宿主細胞的脂筏在問號鉤端螺旋體的進入和存活中起關鍵作用

呂天寶，王佳琪，謝旭峰，宋 寧，關鈺穎，吳殿君，張文龍，曹永國

(吉林大學 動物醫(yī)學學院， 吉林 長春 130062)

鉤端螺旋體病是一種由致病性鉤端螺旋體(鉤體)引起的，除南極洲以外世界范圍內廣泛存在的人獸共患病[1]。鉤體是一種專性需氧的革蘭陰性細菌，可分為非致病性和致病性兩大類，呈螺旋形，長6～20 μm，直徑約0.1 μm[1]。鉤體通過擦傷、割傷或直接穿過正常的皮膚和黏膜進入人體，然后進入血管并通過血流到達全身組織器官，最終定居在腎臟，鉤體經患病動物或人的尿液排出，污染水源和土壤，人和動物可因直接或間接接觸被污染的水和土壤而感染[2]。不同的動物感染不同血清型鉤體表現出不同的臨床癥狀，從輕度的流感樣疾病到嚴重的感染，包括腎和肝衰竭，肺部疾病和死亡。典型癥狀為黃疸，典型病理變化為肺出血[1]。迄今為止，有關鉤體入胞機制尚未被闡明。

脂筏是質膜中功能性的納米級膜結構域，富含膽固醇和鞘脂，其中包含多種信號傳導和轉運蛋白[3]。越來越多的病原體(包括細菌、病毒和寄生蟲等)如大腸埃希菌、假單胞菌、衣原體和A型流感病毒等，已被證明其侵入宿主細胞需要脂筏[4-7]。例如，SEVEAU等[8]發(fā)現鈣黏蛋白和InlB-HGF-R/Met介導的單核細胞增生性李斯特菌進入細胞需要脂筏結構的完整性。但是，鉤體進入細胞是否與脂筏相關尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 細菌和細胞致病性問號鉤端螺旋體賴型賴株(56601)、鼠巨噬細胞細胞系(J774A.1，ATCC編號TIB-67)和非洲綠猴腎上皮細胞(Vero細胞，ATCC編號CCL-81)由本實驗室保存。

1.2 主要儀器與試劑CO2細胞培養(yǎng)恒溫箱購自日本三洋公司；暗視野顯微鏡購自德國奧林巴斯公司；Petroff-Hauser細菌計數板購自美國托馬斯公司；共聚焦顯微鏡購自德國奧林巴斯公司；通用型電泳儀購自美國Bio-Red公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；熒光定量試劑盒購自美國羅氏公司；LC3B、LAMP-1和Caveolin-1抗體購自美國Abcam公司；β-actin以及各種二抗購自美國Immunoway公司；MβCD和膽固醇購自美國Sigma公司；3MA和雷帕霉素購自中國瀚香生物科技有限公司；Lipofectamine RNAiMAX試劑購自美國Invitrogen公司；Cav-1 siRNA購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 細胞與細菌培養(yǎng)致病性問號鉤端螺旋體賴型賴株(56601)在29℃的Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris(EMJH)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過感染金黃地鼠保持毒力。對于所有細胞試驗，鉤體在液體EMJH培養(yǎng)基中的傳代次數少于3次。J774A.1和Vero細胞分別培養(yǎng)在含有10%和2%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細胞毒性試驗將J774A.1細胞以5×103/孔的密度接種在96孔板中，待細胞貼壁后加入不同濃度的MβCD作用30 min后，用CCK8試劑盒檢測細胞毒性。

1.5 細胞處理與感染將J774A.1細胞和Vero細胞以1×106個/孔的密度接種在6孔板中，在完全培養(yǎng)基中預孵育12 h。將細胞分為3組：對照組、MβCD組和MβCD+膽固醇組，然后將MβCD組在含有(10 mmol/L)MβCD的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37℃孵育30 min，MβCD+膽固醇組在含有10 mmol/L MβCD的RPMI 1640培養(yǎng)基中處理30 min 后再在含200 mg/L膽固醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中37℃孵育30 min。用PBS洗滌后，3組細胞以1∶100的劑量感染致病性菌株56601。將細胞在5% CO2中于37℃孵育40 min，用PBS洗滌，經胰蛋白酶消化的離心(1 200 r/min)收集細胞，使用DNA提取試劑盒提取DNA以測量胞內鉤體量。

將J774A.1細胞以1×106個/孔的密度接種在6孔板中，12 h后以1∶100的比例感染鉤體，同時加入3MA(10 mmol/L)或雷帕霉素(50 mg/L)，2 h后收集細胞，用1 mL蒸餾水裂解細胞，吸取100 μL裂解液加入到3 mL EMJH培養(yǎng)基中，29℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4～6 d，在暗視野顯微鏡下用Petroff-Hauser細菌計數板計數。

1.6 小窩蛋白(Cav-1)的小RNA干擾試驗使用Lipofectamine RNAiMAX試劑將siRNA轉染到J774A.1細胞中，并在24 h后對Cav-1進行免疫熒光染色，對細胞進行鉤體感染試驗。

1.7 實時熒光定量PCR根據致病性鉤體特異性基因LipL32設計引物[9]，對胞內鉤體進行熒光定量PCR分析(絕對定量)，使用體外培養(yǎng)細菌中提取的DNA的梯度稀釋液(109～102)制備標準曲線，測定鉤體量。

1.8 激光共聚焦顯微鏡將多聚賴氨酸處理過的12 mm細胞爬片置于24孔板中，以2×105個/孔的數量接種細胞，待細胞貼壁后，將細胞分為對照組和MβCD組，分別處理后，以1∶100的比例感染鉤體，感染40 min后，吸去上清，用預冷的PBS清理3次，加4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗3次后，以含2% BSA的PBS溶液室溫封閉30 min，用抗鉤體一抗室溫孵育30 min，PBS清洗3次后，用FITC標記的熒光二抗室溫孵育30 min，對細胞外的鉤體進行熒光染色。PBS清洗3次后，用含0.2% Triton X-100的PBS溶液室溫處理10 min，PBS清洗1次后再用含2% BSA的PBS溶液室溫封閉30 min，用抗鉤體一抗室溫孵育30 min，PBS清洗3次后，用TRITC熒光二抗室溫孵育30 min，對胞內鉤體進行熒光染色。用PBS清洗3次后，用Hoechst染色5 min，清洗3次后將細胞爬片以甘油黏附到載玻片上，置于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot將J774A.1細胞以1×106個/孔的密度接種在6孔板中，并在完全培養(yǎng)基中預孵育12 h。將細胞分為4組：對照組、MβCD組、鉤體組和MβCD+鉤體組。用MβCD刺激30 min后感染細胞，于感染后4 h收集細胞，用預冷的PBS緩沖液清洗3遍，用蛋白提取試劑裂解細胞10 min，然后用超速離心機以4℃ 12 000 r/min離心10 min收集上清液，使用BCA法檢測蛋白濃度。調整蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，100℃加熱8 min使蛋白變性，配置15% SDS-PAGE濃縮膠以及分離膠，以30 μg/孔蛋白量上樣，80 V電泳20 min后轉用120 V 電泳1 h，然后通過濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，用相應的一抗在4℃環(huán)境下孵育過夜，用TBST溶液清洗3次后，常溫下用二抗孵育2 h，用TBST溶液清洗3次后即可在顯影儀下檢測蛋白量。

2 結果

2.1 鉤體進入細胞需要脂筏介導免疫熒光和Western blot結果表明，MβCD和Cav-1 siRNA都能破壞細胞的脂筏結構(圖1)，并且，細胞毒性試驗分析表明MβCD對細胞沒有潛在的毒性(圖2)。因此，MβCD和Cav-1 siRNA能夠用做脂筏破壞的試劑進行接下來的試驗。

A.MβCD(10 mmol/L)刺激細胞30 min以及Cav-1 siRNA(100 nmol/L)刺激細胞24 h后，對細胞小窩蛋白的熒光染色,其中每個樣品至少隨機拍攝10張不同部位的圖片，圖中展示了各組代表性結果(×400)；B.Western blot檢測Cav-1 siRNA的沉默效果，試驗重復3次

以不同濃度MβCD處理J774A.1細胞30 min，然后用CCK8試劑盒檢測細胞毒性。ns表示P>0.05，無顯著性差異

用qPCR檢測細胞內的鉤體量，結果表明，用MβCD破壞脂筏后，進入J774A.1細胞內的鉤體量明顯降低，用膽固醇回補脂筏后，胞內鉤體量有所升高(圖3A),證明鉤體進入細胞需要脂筏。為了驗證這個現象，采用了小RNA干擾技術，敲低了細胞的小窩蛋白，結果表明，敲低細胞的小窩蛋白后，進入J774A.1細胞的鉤體量明顯降低(圖3C)。在Vero細胞的試驗中，也發(fā)現了同樣的現象，即用MβCD破壞脂筏后，細胞內的鉤體量明顯降低，用膽固醇回補脂筏后，胞內鉤體量有所升高(圖3B)。激光共聚焦結果直觀地表明，脂筏被破壞后，胞內的鉤體量明顯減少(圖3D)。

A,B.J774A.1和Vero細胞在正常狀態(tài)，MβCD破壞脂筏的狀態(tài)以及膽固醇回補狀態(tài)下，鉤體進入細胞的數量的檢測，試驗重復3次；C.J774A.1細胞在正常狀態(tài)以及Cav-1 siRNA破壞脂筏的狀態(tài)下，進入細胞的鉤體數量檢測，試驗重復3次；D.激光共聚焦顯微鏡下觀察胞內外鉤體的熒光染色結果(×1 000)。*表示P<0.05，顯示有顯著性差異；**表示P<0.01，顯示有非常極顯著性差異；***表示P<0.001，顯示有極顯著性差異。下同

2.2 脂筏影響胞內鉤體的存活透射電子顯微鏡下觀察在有無脂筏的情況下鉤體進入細胞的情況，結果顯示在感染后40 min，破壞脂筏結構的J774A.1細胞(圖4E)比正常細胞(圖4B)中的鉤體量明顯較少。在感染后4 h，正常細胞中還有大量鉤體，其形態(tài)學結構無明顯改變(圖4C)，但是在脂筏被破壞的細胞中，感染后4 h的胞內鉤體基本被殺死，并且形態(tài)學結構模糊(圖4F)。另外，通過qPCR檢測了感染后4 h的胞內鉤體量，結果表明，與正常組相比，脂筏被破壞后，細胞殺滅鉤體的能力增強(圖4G)。此外，液體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)試驗也證明了脂筏被破壞后，細胞殺滅鉤體的能力增強(圖4H)。

A.透射電子顯微鏡下，正常狀態(tài)下J774A.1細胞圖；B.正常J774A.1細胞感染后40 min胞內鉤體的情況；C.正常J774A.1細胞感染后4 h胞內鉤體的情況；D.脂筏破壞后的J774A.1細胞圖；E.脂筏破壞后，J774A.1細胞感染后40 min胞內鉤體的情況；F.脂筏破壞后，J774A.1細胞感染后4 h胞內鉤體的情況；G.qPCR檢測感染后40 min以及4 h J774A.1細胞在有無脂筏狀態(tài)下胞內的鉤體量，試驗重復3次；H.液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計數結果表示感染后40 min以及4 h J774A.1細胞在有無脂筏狀態(tài)下胞內存活的鉤體量，試驗重復3次。

2.3 破壞脂筏增強了鉤體感染引起的細胞自噬水平Western blot結果表明，用MβCD破壞脂筏后，J774A.1細胞LC3-Ⅱ蛋白的水平明顯增高，溶酶體標記性蛋白LAMP-1的水平也明顯增高(圖5A)。并且，在感染鉤體后，與對照組相比，脂筏破壞組的LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白的水平明顯較高。證明脂筏被破壞，感染鉤體后，細胞的自噬水平明顯增強(圖5A)。另一方面，用自噬的抑制劑(3MA)和激活劑(雷帕霉素)分別刺激感染鉤體的J774A.1細胞，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計數方法測定胞內鉤體量，結果表明，用雷帕霉素激活細胞自噬后，胞內存活的鉤體明顯較少(圖5B)。由以上結果可知，破壞脂筏可以增強細胞自噬水平，自噬水平的增強有助于細胞殺滅胞內的鉤體。

A.脂筏完整和被破壞狀態(tài)下感染鉤體后4 h的自噬標記分子蛋白免疫印跡圖以及LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白的相對表達水平，試驗重復3次；B.3MA和雷帕霉素分別刺激細胞后，用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計數測得細胞內存活的鉤體量

3 討論

鉤體為非專性細胞內寄生菌，能夠在哺乳動物細胞內轉運而不損壞細胞的功能。鉤體通過人或動物破損的皮膚或黏膜進入體內，隨血流遍布全身組織器官。敏感動物感染后急性死亡，耐受動物發(fā)展成慢性腎臟疾病，其腎臟中有大量鉤體定殖，并隨尿液排出，污染土壤和水源，嚴重威脅著社會公共衛(wèi)生安全[10]。我國農業(yè)部第1125號公告也將鉤體病列為我國二類動物疫病，第1149號公告將其列入人獸共患傳染病名錄。但是，鉤體進入細胞的機制以及其在胞內移行及胞間的穿行機制還未被闡明。

脂筏是脂膜上富含鞘磷脂和膽固醇的微結構域，其包含多種信號轉導蛋白和轉運蛋白，例如小窩蛋白[11-12]。越來越多的病原體，例如大腸埃希菌、假單胞菌、衣原體和A型流感病毒等，已被證明其侵入宿主細胞需要脂筏[4-7]。因此，需要探究脂筏是否在鉤體入胞過程中發(fā)揮作用。

試驗證明MβCD對細胞無毒性，并且免疫熒光結果表明，J774A.1細胞在MβCD作用30 min后，脂筏的標志性蛋白小窩蛋白1(Caveolin-1)的表達明顯降低，因此，參照之前的研究[13-14]，采用MβCD破壞細胞的脂筏結構。與對照組相比，在對J774A.1細胞進行脂筏結構的破壞后，進入細胞的鉤體量明顯降低，用膽固醇回補脂筏結構，發(fā)現胞內的鉤體量有所升高，證明鉤體進入J774A.1細胞需要脂筏。為了避免單一藥物的偶然性，用小RNA干擾技術敲低細胞Cav-1的表達[15]，結果表明，Cav-1的表達降低后，進入細胞的鉤體量同樣減少，再次驗證了鉤體進入細胞需要脂筏。為了驗證這個現象是否與細胞類型有關，用Vero細胞重復了同樣的試驗，結果也表明鉤體進入細胞對脂筏的依賴性。另外，激光共聚焦顯微鏡的觀察結果更直觀地顯示這一現象。這些結果共同表明鉤體進入細胞需要脂筏，當脂筏結構的完整性被破壞后，鉤體進入細胞的能力明顯降低，并且，這個現象與巨噬細胞的主動吞噬作用無關。這種對脂筏的依賴性在單核細胞增生性李斯特桿菌和豬流行性腹瀉病毒的入胞過程中同樣被證實[8,16]。

接下來，通過透射電子顯微鏡觀察J774A.1細胞在有無脂筏結構的情況下感染后40 min及感染4 h后胞內鉤體的數量和形態(tài)。結果表明，在感染后40 min，破壞脂筏結構的J774A.1細胞內的鉤體量明顯減少；在感染后4 h，對照組胞內仍有大量鉤體，并且其形態(tài)完整，而脂筏破壞組胞內的鉤體基本消失，形態(tài)模糊。從胞內鉤體全菌熒光定量和活菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)計數結果可知，在感染后4 h，脂筏破壞組胞內的鉤體幾乎全被清除。這些結果表明破壞脂筏后，細胞殺滅鉤體的能力增強。

有研究表明，脂筏AKT-FOXO1途徑會影響自噬的調節(jié)，脂筏的破壞會誘導自噬[17]。細胞自噬是真核細胞中通過溶酶體降解細胞質成分的過程，同時也具有重要的宿主防御功能。因此，探究中破壞脂筏后，細胞殺滅鉤體的能力增強是否與細胞自噬增強有關，結果表明，破壞脂筏能夠顯著增強細胞LC3-Ⅱ和LAMP-1蛋白表達，證明破壞脂筏能夠增強自噬水平以及鉤體感染后的自噬水平。因此，細胞自噬水平的升高可能有助于殺滅胞內的鉤體。為驗證這一猜想，分別用自噬激活劑(雷帕霉素)和自噬抑制劑(3MA)處理鉤體感染的J774A.1細胞，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)計數結果表明，雷帕霉素能夠顯著降低胞內鉤體量，證明自噬水平的增強有助于殺滅胞內鉤體。以上結果表明，破壞細胞脂筏增強了細胞自噬和細胞殺滅鉤體的能力。

綜上所述，本研究證明鉤體進入細胞需要脂筏，在破壞脂筏后，鉤體進入細胞的量明顯降低，并且細胞殺滅鉤體的能力增強，可能的原因是因為破壞脂筏加強了細胞的自噬水平。本研究發(fā)現鉤體進入細胞與脂筏結構的完整性相關，為鉤體病預防產品的研發(fā)提供理論依據。