桃膠多糖脫蛋白工藝研究

◎ 亓希武，房海靈，陳澤群，梁呈元，呂 寒

（江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室，江蘇 南京 210014）

桃膠是桃等薔薇科植物的樹干受到機械損傷或病原菌侵染后分泌的物質(zhì)，顏色為淡黃色至黃褐色或桃紅色。桃膠自然風干或用其他方法脫水干燥后形成的固體物質(zhì)稱為原桃膠，原桃膠經(jīng)去雜、水解、脫色、干燥等工藝加工后可得商品桃膠[1]。商品桃膠的性質(zhì)與阿拉伯膠類似，在食品、化工等領域具有廣泛的應用前景[2-3]。此外，桃膠具有藥食兼?zhèn)涞奶攸c，研究表明其具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[4-6]。

桃膠的主要成分為多糖，此外還含有少量雜質(zhì)和蛋白質(zhì)[7]。在桃膠多糖的制備工藝中，脫蛋白是提高桃膠多糖純度和品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。本實驗以桃膠水解液為原料，以蛋白脫除率和多糖保留率為主要指標，對常用的Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、木瓜蛋白酶法和鹽酸法這4種脫蛋白方法進行了比較研究[8-10]，以確定適用于桃膠多糖制備的脫蛋白工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃膠采自江蘇省南京市棲霞區(qū)八卦洲街道桃園；Bradford法蛋白測定試劑盒、木瓜蛋白酶，購自生工生物工程上海（股份）有限公司；Na2CO3、NaHCO3、蒽酮、硫酸、TCA、鹽酸、葡萄糖、牛血清白蛋白、氯仿和正丁醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

FD-1A-50型冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）、Quintix5100-1CN型電子天平（Sartorius）、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）、UV-1600PC分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）、Bio-Rad iMARK酶標儀（Bio-Rad）、KYC-100B恒溫搖床（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）及CF16RN型高速冷凍離心機（HITACHI）。

1.3 實驗方法

1.3.1 桃膠水解液的制備

桃膠經(jīng)去雜、漂洗、冷凍干燥后粉碎，過40目篩，按照料液比1∶50加入堿水解液（0.1 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3溶液，pH=10.3），85 ℃恒溫攪拌水解6 h，5 000 r·min-1離心15 min，得上清液為桃膠水解液。

1.3.2 多糖含量測定

多糖含量測定使用蒽酮比色法[11]。首先繪制葡萄糖標準曲線，將葡萄糖在105 ℃條件下烘干至恒重，配制0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液，分別取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL葡萄糖溶液于試管中，加入蒸餾水補足至0.5 mL，之后分別加入2.5 mL蒽酮試劑，混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫。以0號作為空白對照，使用分光光度計測定其在620 nm下的吸光值。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到葡萄糖標準曲線。桃膠水解液中多糖含量使用相同方法測定。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定

蛋白質(zhì)含量測定使用Bradford法。首先繪制蛋白質(zhì)標準曲線，分別取1 mg·mL-1牛血清白蛋白0 μL、3 μL、6 μL、12 μL、18 μL、24 μL、30 μL和45 μL于離心管中，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）補足至300 μL，獲得不同濃度的蛋白溶液。分別取不同濃度的蛋白溶液20 μL于酶標板中，之后每孔分別加入200 μL Bradford溶液，迅速混勻后室溫靜置5 min，之后在酶標儀中測量其在595 nm下的吸光值。以蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到蛋白質(zhì)標準曲線。桃膠水解液中蛋白質(zhì)含量使用相同方法測定。

1.3.4 Sevage法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，加入1/4體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1），置于搖床中200 r·min-1振蕩1 h，之后5 000 r·min-1離心10 min，棄去中間層的蛋白質(zhì)和下層有機相，向上層溶液中重新加入1/4體積的Sevage試劑，重復振蕩、離心操作5次。每次離心分層后吸取少量上層溶液用于測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 TCA法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，分別加入20%濃度的TCA至終濃度為2%、4%、6%、8%和10%，置于搖床中200 r·min-1振蕩1 h，之后在4 ℃條件下靜置過夜，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 酶法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.0，分別加入木瓜蛋白酶至1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，55 ℃下酶解3 h，之后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 鹽酸法脫蛋白

取桃膠多糖水解液20 mL，分別加入1 mol·L-1鹽酸至鹽酸終濃度為0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1和0.6 mol·L-1，置于搖床中200 r·min-1振蕩2 h，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于測定多糖含量和蛋白質(zhì)含量。

1.3.8 評價指標

分別計算不同脫蛋白條件下的多糖保留率和蛋白脫除率，計算公式：多糖保留率=脫蛋白后多糖含量/脫蛋白前多糖含量×100%；蛋白脫除率=（脫蛋白前蛋白質(zhì)含量-脫蛋白后蛋白含量）/脫蛋白前蛋白質(zhì)含量×100%。

2 結果與分析

2.1 Sevage法脫蛋白

Sevage法脫蛋白結果如圖1所示，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白脫除率迅速提高，5次脫蛋白后蛋白脫除率達到91.25%，但1次（89.64%）和5次之間提高并不明顯；與之相對地，多糖保留率隨著脫蛋白次數(shù)的增加逐漸緩慢降低，從1次的86.71%下降至5次的77.33%。綜合兩個評價指標，Sevage法脫蛋白4次，整體脫蛋白效果較好，桃膠多糖的蛋白脫除率（89.64%）和多糖保留率（82.47%）都在較高水平上。

圖1 Sevage法脫蛋白次數(shù)對桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

2.2 TCA法脫蛋白

TCA法脫蛋白結果如圖2所示，隨著TCA濃度的增加，蛋白脫除率逐漸上升，當TCA濃度為10%時，蛋白脫除率達到82.55%；與之相對的，多糖保留率隨著TCA濃度的增加逐漸降低。綜合兩個評價指標，當TCA濃度為6%時對桃膠多糖的脫蛋白效果較好，此時蛋白脫除率為75.44%，多糖保留率為84.66%。

圖2 TCA濃度對桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

2.3 酶法脫蛋白

木瓜蛋白酶法脫蛋白結果如圖3所示，隨著木瓜蛋白酶濃度的增加，蛋白脫除率逐步增加，但整體處在較低水平上，如酶濃度4%～6%中，蛋白脫除率的增加已趨于平緩，在6%的酶濃度時為76.4%；木瓜蛋白酶法脫蛋白中多糖保留率隨著酶濃度的增加，多糖保留率逐步下降，但下降幅度并不大，整體保持在較高水平上（93.32%～85.70%）。綜合兩個評價指標，在木瓜蛋白酶濃度為6%時，整體脫蛋白效果較好，此時蛋白脫除率為76.4%，多糖保留率為85.7%。

圖3 木瓜蛋白酶濃度對桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

2.4 鹽酸法脫蛋白

鹽酸法脫蛋白結果如圖4所示，隨著鹽酸濃度的升高，蛋白脫除率逐漸升高，但整體水平并不高，鹽酸濃度為0.6 mol·L-1時，蛋白脫除率為77.3%；多糖保留率隨著鹽酸濃度的升高逐漸降低，整體的多糖保留率水平較低（76.67%～60.17%）。綜合兩個評價指標，鹽酸濃度為0.3 mol·L-1時，桃膠多糖脫蛋白效果較好，此時蛋白脫除率為70.04%，多糖保留率為74.12%。

圖4 鹽酸濃度對桃膠多糖蛋白脫除率和多糖保留率的影響圖

3 結論與討論

原桃膠經(jīng)過精制后可得商品桃膠，其溶解度提高，黏度降低，在食品、化工、醫(yī)藥等領域廣泛應用。桃膠主要成分為多糖，包括半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖等，脫蛋白是提高桃膠多糖純度和品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。常見的脫蛋白方法包括鹽析法、Sevage法、TCA法、酶法、鹽酸法等，研究表明不同材料所適用的最佳脫蛋白方法并不相同。例如，李小蓉等比較了Sevage法和TCA法對倒卵葉五加多糖的脫蛋白效果，結果表明TCA用量為7.5%，TCA處理3次，處理時間為30 min時，脫蛋白效果最佳[8]；劉佳維等比較了Sevage法、TCA法和木瓜蛋白酶法對紅參多糖脫蛋白工藝的效果，結果表明木瓜蛋白酶法效果最好，最佳工藝為酶用量3%，pH值6，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h[12]；張帥等比較了Sevage法、TCA法、酶法和醋酸鉛法對筍殼多糖的脫蛋白效果，結果表明筍殼多糖脫蛋白最佳方法為醋酸鉛法[13]。此外，也有研究將不同脫蛋白方法聯(lián)合使用，例如，王曉林等分別使用了Sevage法、TCA法、酶法、酶法+Sevage法聯(lián)用和酶法+TCA法聯(lián)用分析猴腿蹄蓋蕨多糖的脫蛋白效果，結果表明酶法+TCA法聯(lián)用的脫蛋白效果最佳[14]。但是不同材料中聯(lián)合使用不同方法的效果也存在很大差別，并不是聯(lián)合使用效果就會更好，例如，胡會剛等在研究芒果皮渣多糖脫蛋白工藝時，除了單獨使用一種脫蛋白方法外，還使用了TCA+Sevage法、木瓜蛋白酶+TCA法、木瓜蛋白酶+Sevage法、木瓜蛋白酶+TCA-正丁醇法，結果表明單獨使用TCA-正丁醇法效果最佳[9]。此外，聯(lián)合使用不同方法存在步驟繁瑣、多糖損失率高等缺點，因此實際生產(chǎn)中更多使用單一方法。

本研究以蛋白脫除率和多糖保留率為評價指標，比較了常用的脫蛋白方法對桃膠多糖的脫蛋白效果。綜合比較幾種脫蛋白方法，Sevage法隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白脫除率迅速提高，在脫蛋白4次時效果最佳；TCA法當TCA濃度為6%時脫蛋白效果較好，當TCA濃度過高時多糖保留率下降明顯；木瓜蛋白酶法條件較為溫和，多糖保留率水平是幾種方法中最高的，但是蛋白脫除率水平較低；鹽酸法多糖保留率低于其他方法，可能是因為在此過程中糖苷鍵發(fā)生裂解。綜合比較幾種方法的蛋白脫除率和多糖保留率，Sevage法為桃膠多糖脫蛋白的最佳方法，當脫蛋白4次時，蛋白脫除率為89.64%，多糖保留率為82.47%。