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    吡非尼酮對(duì)新西蘭兔膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕攣縮的改善作用

    2021-06-17 08:08:04張永光盛青松胡建偉陳建梅葉永平
    武警醫(yī)學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:吡非尼酮羥脯氨酸膠原

    張永光,盛青松,邱 卓,胡建偉,陳建梅,葉永平

    瘢痕是機(jī)體在創(chuàng)傷后組織修復(fù)過(guò)程中的必然產(chǎn)物[1]。由于全身或局部多種因素的影響,瘢痕組織往往過(guò)度增生而具有較強(qiáng)的收縮性,可使肢體的正常解剖結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能障礙等[2]。創(chuàng)傷后關(guān)節(jié)囊周?chē):壅尺B及攣縮是膝關(guān)節(jié)屈伸功能受限的重要原因,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。對(duì)于涉及濱海及遠(yuǎn)洋作業(yè)人群,膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后因高滲海水浸泡及難以及時(shí)救治等多重因素,瘢痕攣縮所致功能受限更為明顯,致畸致殘率更高。因此,海水浸泡膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕攣縮是亟待解決的臨床難題[4]。目前。此類(lèi)研究尚少見(jiàn)于報(bào)道。

    吡非尼酮(Pirfenidone,PFN)是一種具有抗炎、抗氧化和抗纖維化作用的新型小分子化合物,對(duì)于特發(fā)性肺纖維化具有良好的療效[5]。然而,關(guān)于吡非尼酮治療膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕攣縮卻未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探索通過(guò)口服吡非尼酮改善海水浸泡動(dòng)物膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性瘢痕,觀察其對(duì)增生性瘢痕的影響,通過(guò)組織Masson染色和標(biāo)本ELISA檢測(cè)進(jìn)一步觀察其治療效果,并初步探討其可能的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器 吡非尼酮(大連美侖生物技術(shù)有限公司),速眠新與蘇醒珍(長(zhǎng)沙拜特生物科技研究所),多聚甲醛(國(guó)際集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),兔羥脯氨酸(Hyp)ELISA試劑盒(酶免,MM-36861O2),蘇木精染色液(Solarbio),伊紅染色液(大連美侖生物技術(shù)有限公司),無(wú)水乙醇(西隴科學(xué)股份有限公司),二甲苯(西隴科學(xué)股份有限公司),中性樹(shù)膠(biosharp),小鼠/兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(SA1020,BOETER),DAB顯色試劑盒(AR1022,BOETER),Masson染色三色試劑盒(G1340,SoLarBio),TGF-β1(21898-1-AP,Proteintech),KH-TS型自動(dòng)組織脫水機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司),KH-BL型包埋機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司),KH-BL型包埋機(jī)冷臺(tái)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司),輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(賽默飛世爾儀器有限公司),攤片烤片機(jī)(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司),黏附載玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司),超純水機(jī)(Millipore 超純水機(jī))。

    1.2 動(dòng)物分組與手術(shù) 普通級(jí)雄性新西蘭兔20只(約2.2 kg,上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng),許可證號(hào)碼:SCXK[滬]2017-0008)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,規(guī)律喂食、飲水。按照隨機(jī)數(shù)字表法將新西蘭兔分為四組:生理鹽水組(NS組),無(wú)菌海水組(SW組),生理鹽水+ PFD治療組(NS+PFN),無(wú)菌海水+PFD治療組(SW+PFN),每組5只。膝關(guān)節(jié)手術(shù)過(guò)程如下:選取兔子右側(cè)大腿肌肉注射速眠新(0.1~0.2 ml/kg)麻醉。進(jìn)入手術(shù)麻醉狀態(tài)后,用剃毛器去除左腿膝關(guān)節(jié)周?chē)拿?,將兔子固定在小?dòng)物手術(shù)臺(tái)上,75%乙醇、碘伏消毒術(shù)野;無(wú)菌刀片沿髕旁內(nèi)側(cè)縱行做長(zhǎng)4 cm的膝關(guān)節(jié)切割傷口,逐層切開(kāi)至關(guān)節(jié)腔,暴露關(guān)節(jié)軟骨面,傷后患肢無(wú)菌紗布?jí)浩戎寡⑼孟リP(guān)節(jié)創(chuàng)口于無(wú)菌生理鹽水/無(wú)菌海水中浸泡1 h,浸泡結(jié)束后給予生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔,依次縫合創(chuàng)口,無(wú)菌紗布包扎。給予兔子右大腿注射0.2 ml蘇醒珍,待兔子蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)。吡非尼酮治療組(NS+PFN組和SW+PFN組)動(dòng)物予吡非尼酮(0.75 g)與飼料混合喂養(yǎng),每天給藥1次。NS組和SW組僅給予飼料喂養(yǎng)。術(shù)后4周深度麻醉動(dòng)物后取材。將關(guān)節(jié)液保存于-80 ℃冰箱;髕上囊與關(guān)節(jié)周?chē):劢M織用4%多聚甲醛固定液固定后保存于室溫。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理并經(jīng)由第九〇〇醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

    1.3 Masson染色 用配制好的weigert鐵蘇木精染色液染色7 min。酸性乙醇分化液分化10 s,水洗。Masson藍(lán)化液返藍(lán)3 min,水洗。蒸餾水洗1 min。麗春紅品紅染色液染色30 s。在上述操作過(guò)程中按蒸餾水:弱酸溶液=2∶1比例配置弱酸工作液,用弱酸工作液洗1 min。磷鉬酸溶液洗2 min。用配置好的弱酸工作液洗1 min。使用苯胺藍(lán)染色液滴加1 min。用配置好的弱酸工作液洗1 min。95%乙醇快速脫水。無(wú)水乙醇脫水3次,每次15 s。二甲苯透明10 min。中性樹(shù)膠封片。

    1.4 羥脯氨酸含量檢測(cè) 從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需樣本。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl;樣本孔中加入待測(cè)樣本 50 μl;空白孔不加。除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體 100 μl,用封板膜封住反應(yīng)孔,37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350 μl),靜置 1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μl,37℃避光孵育15 min。 每孔加入終止液50 μl,15 min內(nèi),在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

    1.5 TGF-β1含量檢測(cè) 將獲取的新鮮標(biāo)本加入磷酸緩沖鹽溶液,勻漿充分,離心,收集上清液。稀釋后各孔加樣量50 μl。加樣時(shí)設(shè)空白孔與樣品孔。樣品孔中先加入40 μl樣品稀釋液,然后加入10 μl待測(cè)樣品。加樣過(guò)程中,注意將樣品加于酶標(biāo)板孔的底部,不觸及酶標(biāo)板孔的孔壁,搖晃混勻。加酶,除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑溶液 50 μl,空白孔不加酶。封板后將酶標(biāo)包被板放入 37 ℃溫箱中溫育30 min。使用蒸餾水將30倍濃縮洗滌液稀釋30倍后備用。從溫箱中取出酶標(biāo)包被板,去除封膜,棄去液體,甩干,然后使用洗滌液將每孔加滿,靜置 30 s后棄去,此步驟重復(fù)5次,最后拍干。每孔加入顯色劑 A 50 μl,再加入顯色劑B 50 μl,搖晃混勻后放入避光處顯色10 min,溫度保持在 37 ℃。 酶標(biāo)包被板上的每孔加入終止液50 μl,結(jié)束反應(yīng)過(guò)程。以空白孔調(diào)零,450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的OD值。

    2 結(jié) 果

    2.1 大體觀察 術(shù)后以絲線縫合切口,各組動(dòng)物切口3 d左右干燥結(jié)痂,無(wú)明顯滲出,切口周?chē)つw無(wú)紅腫。1周左右線結(jié)脫落,愈合良好,切口無(wú)裂開(kāi)、潰瘍、感染等情況。

    2.2 Masson染色結(jié)果 如圖1所示,在NS組和SW組,膠原纖維粗大,呈螺旋狀排列,結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為致密而紊亂狀;在吡非尼酮處理組(NS+PFN組和SW+PFN組),膠原纖維分布相對(duì)稀疏,大致呈平行排列,相對(duì)更為規(guī)則。

    圖1 瘢痕組織Masson染色結(jié)果(×100)

    2.3 羥脯氨酸水平 檢測(cè)結(jié)果顯示,在SW組、NS組、SW+PFN組和NS+PFN組,羥脯氨酸分別為(114.20±14.54)ng/ml、(99.21±18.27)ng/ml、(87.91±12.02)ng/ml和(76.17±18.72)ng/ml,水平逐漸降低。SW+PFN組羥脯氨酸水平明顯低于SW組(P<0.05)。

    2.4 TGF-β1水平 檢測(cè)結(jié)果顯示,SW組和NS組TGF-β1水平分別為(151.53±20.21)ng/ml和(141.72±4.14)ng/ml。經(jīng)吡非尼酮干預(yù)后,SW+PFN組和NS+PFN組TGF-β1水平相對(duì)降低,分別為(106.53±12.86)ng/ml和(92.03±10.05)ng/ml。SW+PFN組TGF-β1水平明顯低于SW組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討 論

    膝關(guān)節(jié)是人體最大的關(guān)節(jié),負(fù)重多且運(yùn)動(dòng)量大[6]。由于膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)面大且部位表淺,杠桿作用最強(qiáng),不穩(wěn)定而易受傷。膝關(guān)節(jié)損傷后,出現(xiàn)功能障礙的一個(gè)主要原因在于關(guān)節(jié)囊周?chē)M織的瘢痕粘連及攣縮,導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)屈伸功能受限[7]。嚴(yán)重的膝關(guān)節(jié)瘢痕攣縮會(huì)導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)功能喪失,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,對(duì)個(gè)人、家庭及社會(huì)造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[8]。濱海地區(qū)涉海及遠(yuǎn)洋作業(yè)人群龐大,膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后因高滲海水浸泡及難以及時(shí)救治等多重因素,膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷更為嚴(yán)重,后期瘢痕攣縮致功能受限更為明顯,導(dǎo)致患者致畸致殘率更高。此外,沿海部隊(duì)渡海登島演練亦存在膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷海水浸泡、瘢痕攣縮致畸致殘等情況[9, 10]。故此,解決膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后周?chē):蹎?wèn)題,探索一條治療海水浸泡膝關(guān)節(jié)損傷的行之有效的方法,具有重要的臨床實(shí)踐意義。

    瘢痕是人體在創(chuàng)傷后組織修復(fù)過(guò)程中的必然產(chǎn)物,任何創(chuàng)傷的愈合均伴有不同程度的瘢痕形成[11]。在組織修復(fù)過(guò)程中,由于全身或局部多種因素的影響,常出現(xiàn)瘢痕組織的過(guò)度增生而形成增生性瘢痕。增生性瘢痕具有較強(qiáng)的收縮性,可使膝關(guān)節(jié)的正常解剖結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[12]。增生性瘢痕的形成往往是多因素共同作用的結(jié)果。一般認(rèn)為成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制,細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡在瘢痕形成過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。此外,機(jī)體受損后,成纖維細(xì)胞激活、增殖,轉(zhuǎn)化成表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)的肌成纖維細(xì)胞,分泌產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)。

    在肌成纖維細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子中,研究較多的是 TGF-β1,它是目前已知的與增生性瘢痕形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子[14]。TGF-β1的主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和結(jié)締組織的合成。在成纖維細(xì)胞中,TGF-β1刺激細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成與沉積,抑制膠原酶的產(chǎn)生,并能增加膠原酶抑制劑的產(chǎn)生。TGF-β1除能導(dǎo)致組織纖維化,也能誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞高表達(dá) α-SMA[15]。也就是說(shuō)修復(fù)細(xì)胞中成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制,細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡,部分生長(zhǎng)因子的大量產(chǎn)生及三者之間相互協(xié)調(diào)的關(guān)系構(gòu)成了增生性瘢痕形成的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此,促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解、抑制膠原的合成和 TGF-β1的過(guò)表達(dá)對(duì)于治療增生性瘢痕來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。

    在本研究中,我們將吡非尼酮應(yīng)用于海水浸泡后的膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中。通過(guò)組織學(xué)觀察和免疫學(xué)測(cè)定,結(jié)果表明吡非尼酮抑制了海水浸泡后膝關(guān)節(jié)傷口愈合過(guò)程中的膠原合成,緩解了瘢痕粘連。膝關(guān)節(jié)損傷經(jīng)海水浸泡后,在對(duì)照組,膠原纖維粗大,呈螺旋狀排列,結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為致密而紊亂狀;在吡非尼酮處理組,膠原纖維稀疏而排列相對(duì)規(guī)則,大致平行。膠原是瘢痕組織的重要組成部分,主要由成纖維細(xì)胞合成和分泌。羥脯氨酸是膠原蛋白的主要組成氨基酸,占膠原纖維氨基酸含量的12.5%,其含量測(cè)定可以反映瘢痕組織中膠原的形成。ELISA測(cè)定結(jié)果表明,SW+PFN組羥脯氨酸水平明顯低于SW組,表明吡非尼酮可能抑制了創(chuàng)傷后膠原蛋白的合成,從而緩解了創(chuàng)傷后瘢痕的過(guò)度增生。TGF-β1是肌成纖維細(xì)胞分泌的與瘢痕過(guò)度形成關(guān)系最密切的細(xì)胞因子。吡非尼酮屬于細(xì)胞因子抑制藥,在臨床上已經(jīng)成為治療特發(fā)性肺纖維化的一線藥物。吡非尼酮通過(guò)抑制TGF-β1,一定程度上控制了成纖維細(xì)胞的增殖和遷移,減少細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白的沉積,從而達(dá)到延緩患者肺纖維化程度[16]。在本研究中,SW+PFN組TGF-β1水平顯著低于SW組,提示吡非尼酮可能通過(guò)抑制TGF-β1水平,從而降低了成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成,最終抑制了瘢痕的過(guò)度增生。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),吡非尼酮能有效地抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物海水浸泡膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后瘢痕增生,且可能是通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá),從而調(diào)控了膠原合成與降解,緩解了瘢痕的過(guò)度增生。因此,吡非尼酮可能成為治療海水浸泡膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的藥物,具有一定的應(yīng)用潛力。然而,本實(shí)驗(yàn)仍存在一些不足之處。首先,海水具有低溫、偏堿性、高滲透壓及致病菌多等特點(diǎn)[17],傷口繼發(fā)的病理生理學(xué)變化往往比陸地?fù)p傷更為復(fù)雜,難于控制,本實(shí)驗(yàn)尚屬初步探索,真實(shí)海水浸泡環(huán)境的模擬和重現(xiàn)在進(jìn)一步研究中尤為重要。其次,目前學(xué)者們大多采用兔制備膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后粘連動(dòng)物模型[18],側(cè)重于術(shù)后并發(fā)癥的治療;海水浸泡膝關(guān)節(jié)損傷少見(jiàn)于報(bào)道,診斷標(biāo)準(zhǔn)仍不明確,加之致傷混雜因素繁多,至今并無(wú)公認(rèn)成熟的海水浸泡膝關(guān)節(jié)損傷動(dòng)物模型供研究使用。因此,需要不斷深入研究來(lái)獲取更完善的數(shù)據(jù)指標(biāo),從而建立適宜的動(dòng)物損傷模型以利于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探索。

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