血清miRNA-126水平與乙肝肝細胞癌血管生成擬態(tài)的關系

沈 宏，成麗婭，宗春輝，馬 程，趙冬雨

肝癌是我國發(fā)病率第4位的腫瘤，其中乙肝相關肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占我國肝癌總數(shù)的80%～90%[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)與HCC的轉(zhuǎn)移、復發(fā)、生存期縮短等不良預后密切相關[2,3]。探索VM發(fā)生的相關影響因素并作為HCC預后判斷的標志物的研究已成為熱點[4]。多種microRNAs(miRNA)被證實在HCC進展、轉(zhuǎn)移和免疫紊亂中起到作用[5,6]。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA-126與血管完整性和血管生成相關疾病有關[7]。miRNA-126水平下調(diào)也被發(fā)現(xiàn)與HCC轉(zhuǎn)移、患者生存率下降密切相關[8]。然而目前關于miRNA-126與血管生成擬態(tài)在HCC患者預后中的關系的研究未完全明確?；诖耍狙芯糠治隽烁伟┗颊吆徒】祵φ战M血清中miRNA-126水平差異，并通過肝癌組織切片染色探索了血清miRNA-126與VM的關系，以期為將來HCC患者預后判斷和早期干預提供新的參考。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2016-10至2019-10在天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院和武警特色醫(yī)學中心住院接受根治性肝切除術的183例乙肝相關早期肝細胞癌患者作為研究對象(HCC組)。納入標準：(1)巴塞羅那分期為Ⅰ-Ⅱa期，住院接受根治性肝癌切除術，術前乙肝病史明確，術后病理證實為HCC[1]；(2)未接受免疫治療；(3)有完整的數(shù)據(jù)記錄；(4)無其他主要臟器疾病和功能障礙。排除標準：(1)繼發(fā)性肝癌；(2)其他惡性腫瘤；(3)乙肝合并丙肝者。收集天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院健康體檢者183例作為正常對照組。本研究經(jīng)武警特色醫(yī)學中心倫理委員會批準。

1.2 血清樣本采集和保存 收集HCC患者和對照組的靜脈血5 ml。靜止沉淀后以43 000 r/min離心10 min，保留血清，并儲存于-80 ℃冰箱中。血清樣品采集和保存過程中，盡量縮短暴露時間，以防止RNA降解。

1.3 實時定量PCR 根據(jù)說明用miRNasy Mini Kit試劑盒提取血清中的總RNA。用紫外分光光度計在260 nm和280 nm處的吸收值，測定總RNA的濃度和純度。通過PCR擴增反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，用ABI7500定量PCR儀通過RT-PCR技術擴增目的基因。miRNA-126正向引物序列為CTGCTCGACCTCGGAAACTATG。PCR結(jié)果用Opticon Monitor 3軟件進行分析。

1.4 臨床資料收集 收集納入患者的年齡、性別、肝癌BCLC分期、吸煙史、飲酒史、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、肝硬化程度、MVD和術前AFP水平，肝纖維化的Ishak分期。術前CT或MRI影像學資料。

1.5 病理組織染色 HCC組的肝癌組織由病理科進行組織切片常規(guī)HE染色(圖1A)。HE染色后在顯微鏡下判斷標本的VM情況。腫瘤邊界為腫瘤細胞，非內(nèi)皮細胞，未見出血、壞死或炎性細胞浸潤則判斷為HE染色下VM可疑陽性。對VM可疑陽性組織切片再進行CD34-PAS雙重免疫組織化學染色。鏡下觀察：CD34染色陽性為血管內(nèi)皮細胞的細胞膜或(和)細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。VM陽性標準：由PAS陽性環(huán)周圍的腫瘤細胞組織，周圍無內(nèi)皮細胞，管腔內(nèi)無紅細胞。簡言之，PAS陽性和CD34陰性的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)定義為腫瘤組織VM陽性(圖1B)，而CD34染色陽性則判斷為VM陰性(圖1C)[9]。

圖1 肝細胞癌組織病理染色(×200)

微血管密度(microvessel density, MVD)計數(shù)：在100倍視野下，選擇確定內(nèi)皮依賴性血管集中的區(qū)域。微血管由單個或成簇的棕色CD34陽性內(nèi)皮細胞組成。隨機選擇3個200倍視野計算血管總數(shù)為MVD。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 研究納入的HCC組和對照組患者在性別、年齡、吸煙史和飲酒史差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HCC組患者的血清miRNA-12表達水平低于對照組(P=0.000，表1)。

表1 HCC組和對照組患者一般資料比較

2.2 肝細胞癌組織中VM陽性表達的相關因素 HCC患者中VM陽性組與VM陰性組在腫瘤大小、分化程度、TNM分期、Ishak 分期Ⅴ-Ⅵ期、MVD、術前AFP、血清miRNA-126表達水平等方面均存在統(tǒng)計學差異(表2)。

表2 VM陽性組與VM陰性組HCC患者資料比較

2.3 HCC患者發(fā)生VM的危險因素分析 使用Logistic回歸分析發(fā)生VM的影響因素可見，HCC患者術前的血清miRNA-126低表達、AFP升高、腫瘤大小是出現(xiàn)VM的相關因素(表3)。

表3 HCC患者發(fā)生VM的危險因素分析

2.4 不同因素預測VM發(fā)生的ROC分析 分別使用血清miRNA-126低表達、AFP升高、腫瘤大小指標構(gòu)建預測VM發(fā)生的ROC分析可見，術前miR126水平預測VM的曲線下面積為0.869(95%CI：0.815-0.924)，最佳診斷切點為0.43，敏感度為83%，特異度為81%；AFP預測VM的ROC線下面積為0.796(95%CI：0.728～0.864)，腫瘤大小預測VM的ROC線下面積0.755(95%CI：0.683～0.828)，見圖2。

圖2 HCC患者術前不同因素預測VM發(fā)生的ROC曲線

3 討 論

miRNAs是一類長度為20-25nt的非編碼RNA，其對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起著關鍵作用[10]。miRNAs可作為腫瘤細胞的功能效應器，在調(diào)節(jié)腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和免疫紊亂等方面發(fā)揮著多方面的作用[11,12]。近年來，對于miRNAs在HCC中作用的研究也越來越多，目前多項研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA-126與肝癌的增殖、遷移和侵襲密切相關[13]，并明確了miRNA-126下調(diào)可以促進肝癌細胞的轉(zhuǎn)移，影響肝癌患者的預后[8]。我們比較了HCC患者和體檢對照組患者的血清miRNA-126水平發(fā)現(xiàn)，HCC患者miRNA-126表達水平明顯低于正常對照組。既往研究表明miRNA-126和PLK-4的聯(lián)合作用在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用[14]，然而先前的研究并未對VM與miRNA-126相關性進行過分析，我們采用病理相結(jié)合方式分析了miRNA-126與患者VM的關系。

HCC患者發(fā)生VM被認為是加劇腫瘤的轉(zhuǎn)移、復發(fā)、預后不良的重要因素[15]。因此若早期、無創(chuàng)發(fā)現(xiàn)VM，則對HCC患者預后判斷提供一定幫助，更有利于臨床決策。筆者采用患者術前資料和術后病理相結(jié)合進行分析，使用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)miRNA-126可作為VM發(fā)生的一個相關因素。盡管尚不清楚miRNA-126與VM的相關性是否存在因果關系，但既往研究提示miRNA-126-3p的表達下調(diào)可促進肝癌的血管生成和轉(zhuǎn)移，并認為miR-126-3p表達的恢復可能在HCC治療方面提供新思路[16]。也有學者發(fā)現(xiàn)腫瘤患者miRNA-126與微血管的數(shù)量存在一定相關性[17]。也有體內(nèi)研究證實了通過調(diào)控miRNA-126能夠抑制裸鼠皮下腫瘤生長,這為針對miRNA-126進行基因治療靶點提供了一定可能性[18]。盡管目前有多個研究證實了miRNA-126與多個實體腫瘤的內(nèi)皮細胞、血管生長因子、新血管生成等不同方面關系密切，但僅限于肺癌、乳腺癌和卵巢癌等研究[17,19,20]，尚缺乏對HCC患者的相關基礎和臨床研究，這也是今后的一個研究方向。

此外，術前miRNA-126無創(chuàng)預測VM的敏感性特異性均在80%以上，提示血清miRNA-126在今后的臨床應用中可能具有較多的價值。由于發(fā)生VM直接影響HCC患者的復發(fā)、轉(zhuǎn)移，因此本研究為miRNA-126成為HCC患者預后潛在標志物提供了研究基礎。

本研究也存在一定不足，首先研究納入的人群均為根治性HCC患者，肝癌巴塞羅那分期均為I-IIa期患者，缺少對于中晚期HCC患者發(fā)生VM的分析，這部分中晚期HCC患者腫瘤數(shù)目更多、體積相對更大，而這部分患者的miRNA-126與VM關系缺少分析。其次，本研究目前缺少對miRNA-126與患者長期隨訪的關系研究，尚不能判斷血清miRNA-126與患者復發(fā)、預后等方面的關系。今后將繼續(xù)對這些患者完成5年隨訪，探索術前血清miRNA-126與患者預后的關系。最后我們分析的相關因素較少，目前的研究僅能得出因果關系，更多的相關基礎研究值得今后繼續(xù)開展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA miRNA-126與HCC血管生成擬態(tài)存在一定相關性?；颊咝g前血清miRNA-126低表達可一定程度上預測患者VM的發(fā)生。然而，miRNA-126和其他影響VM形成的因素，對HCC患者預后的判斷仍需要進一步研究。