基于UPLC-MS/MS探究烘焙程度對(duì)咖啡豆中有機(jī)酸含量影響

王東旭，王新財(cái)，胡奇杰，王鳳麗，厲 芬，陳褚建

（湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江湖州 313000）

咖啡作為世界三大飲料之首，深受各國(guó)人民的喜愛(ài)[1]。酸度是評(píng)價(jià)咖啡飲品品質(zhì)的重要因素之一，而咖啡中的酸度主要來(lái)自咖啡豆烘焙過(guò)程中產(chǎn)生的酸，烘焙咖啡豆中含有水溶性綠原酸、奎尼酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、醋酸、甲酸、乳酸、甘醇酸等三十多種有機(jī)酸以及無(wú)機(jī)磷酸[2]。研究表明有機(jī)酸具有軟化血管、促進(jìn)微量元素吸收、幫助胃液消化等功能[3]。有機(jī)酸的含量受烘焙的溫度及時(shí)間影響較大，同時(shí)還受咖啡豆的種類影響[4]。與咖啡豆其他有效成分相比，酒石酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸等有機(jī)酸在咖啡豆中含量并不高，其總量約占2.5%[5]，目前對(duì)引起咖啡酸味的脂肪族酸含量的報(bào)道較少，現(xiàn)有報(bào)道主要側(cè)重于對(duì)烘焙咖啡豆中有機(jī)酸檢測(cè)方法的報(bào)道[2,4,6]，以及烘焙程度對(duì)咖啡豆中原有有機(jī)酸含量研究[7]。烘焙程度對(duì)多種有機(jī)酸尤其是新生成的有機(jī)酸含量影響還少有研究。有研究表明，蘋(píng)果酸和檸檬酸會(huì)形成溫和愉悅性的酸味[2]，高溫下綠原酸降解產(chǎn)物奎尼酸會(huì)形成咖啡風(fēng)味中的澀感[8]，奎尼酸降解產(chǎn)物莽草酸是多種芳香化合物的前體物質(zhì)[9]，因此考察不同烘焙程度下咖啡豆中有機(jī)酸含量變化對(duì)于烘焙咖啡豆的口感控制極為重要。

目前，有機(jī)酸的檢測(cè)方法主要有分光光度法[10]、氣相色譜法[11-12]、高效液相色譜法[13-16]、離子色譜法[17-18]和液質(zhì)聯(lián)用法[19-21]等。分光光度計(jì)法檢出限較高；氣相色譜法需要衍生處理；高效液相色譜法可測(cè)定大多數(shù)有機(jī)酸，但紫外靈敏度相對(duì)較低；而液質(zhì)聯(lián)用法因具有高選擇性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[20]。咖啡中的有機(jī)酸測(cè)定目前還是以液相色譜為主，尚未見(jiàn)到液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)用于咖啡中有機(jī)酸檢測(cè)的報(bào)道。

本研究以產(chǎn)自洪德拉斯咖啡豆為原料，經(jīng)過(guò)不同程度（輕度、中輕度、中度、中深度、重度、重深度）的烘焙，采用新建立的超高效液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)7種有機(jī)酸（富馬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸、檸檬酸）含量。通過(guò)分析有機(jī)酸含量變化揭示不同烘焙程度對(duì)咖啡豆有機(jī)酸成分的影響，研究7種有機(jī)酸含量變化的相互關(guān)系和烘焙中新生成的有機(jī)酸含量變化規(guī)律，并對(duì)4種咖啡豆（分別產(chǎn)自肯尼亞、印尼、巴西、薩爾瓦多）進(jìn)行驗(yàn)證，完成開(kāi)發(fā)基于酸感的烘焙工藝。該研究為進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)咖啡酸感形成的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也對(duì)咖啡豆烘焙產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洪德拉斯SHB咖啡豆 產(chǎn)自洪都拉斯NINFA LANZA莊園；肯尼亞AA++咖啡豆 產(chǎn)自肯尼亞奇雅瓦姆魯魯；印尼羅布斯塔咖啡豆 產(chǎn)自印度尼西亞爪哇；巴西喜拉多咖啡豆 產(chǎn)自巴西喜拉多；薩爾瓦多紅波旁咖啡豆 產(chǎn)自薩爾瓦多Loma La GIoria莊園；琥珀酸（succinic acid，99.5%）、蘋(píng)果酸（malic acid，98.0%）、酒石酸（tartaric acid，99.0%）、莽草酸（shikimic acid，98%）、奎尼酸（quinic acid，98.0%）、檸檬酸（citric acid，≥99.5%） 標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司；富馬酸（fumaric acid，99.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（CAN，色譜純）、甲醇（MeOH，色譜純）德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；試驗(yàn)用水 為超純水。

ACQUITYTM 超高效液相色譜、XevoTM TQD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；ME204E型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Genius 3漩渦混合器 德國(guó)IKA公司；KQ-500DB型超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra X-12R型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；Simplicity型超純水儀 美國(guó)Millipore公司；L9/11/B410型馬弗爐 德國(guó)nabertherm公司；JFSD-100型粉碎機(jī) 上海嘉定糧油儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取富馬酸、琥珀酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用水溶液配制成質(zhì)量濃度均為1.00 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液。再用純水稀釋成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。各對(duì)照品儲(chǔ)備液和混合對(duì)照品儲(chǔ)備液均置于4 ℃冰箱中保存。根據(jù)需要移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成濃度分別為50.0、100、500、1000和2000ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。取1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22 μm水相濾膜后供高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

1.2.2 供試品溶液的制備 隨機(jī)選取咖啡豆平鋪一層于坩堝盤(pán)中，放入馬弗爐固定位置烘焙。烘焙完成后，立即取出冷卻至室溫。設(shè)定烘焙溫度為220 ℃，烘焙時(shí)間分別為10、20、30、40、50和60 min，對(duì)應(yīng)的咖啡豆烘焙程度為輕度、中輕度、中度、中深度、重度、重深度。收集烘焙咖啡豆樣品，用粉碎機(jī)將咖啡豆粉碎（粒徑1.00 mm），供有機(jī)酸含量測(cè)定。

稱取1.00 g（精確至0. 01 g）咖啡豆粉置于15 mL離心管中，加入10.00 mL純水，渦旋2 min，超聲20 min，以9000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。根據(jù)目標(biāo)物含量再將上述溶液分別用純水稀釋10和500倍，過(guò)0.22 μm水相濾膜。按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 測(cè)定方法 分別精密吸取上述混合對(duì)照儲(chǔ)備液各5 μL，注入高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，測(cè)定出峰面積，以濃度（ng/mL）（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制7種有機(jī)酸化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。精密吸取上述供試品溶液5 μL，注入高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀，測(cè)定峰面積，采用外標(biāo)法定量。

1.2.4 色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為乙腈溶液，流動(dòng)相B為0.2%甲酸水（v/v，下同）溶液，梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，3%A；2.0～2.5 min，3%～30%A；2.5～3.5 min，30%A；3.5～3.6 min，30%～3%A；3.6～7.0 min，3%A；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）電離，負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓為-2.5 kV；離子源和脫溶劑氣溫度分別為150 和350 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣流速分別為800 和50 L/h；碰撞氣為氬氣；7種化合物的定性定量離子對(duì)（m/z）、錐孔電壓及碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 待測(cè)物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)及最佳質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Selected transitions and optimized potentials of the target compounds

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相質(zhì)譜條件的選擇

文獻(xiàn)[22]表明，因有機(jī)酸在反相色譜柱中的保留值較小，酸性物質(zhì)在高極性流動(dòng)相（水相比例高）中會(huì)存在電離形式和未電離形式，導(dǎo)致色譜圖中同一物質(zhì)出現(xiàn)多峰和拖尾現(xiàn)象，影響檢測(cè)精度；控制流動(dòng)相pH可以有效調(diào)控有機(jī)酸的測(cè)定形態(tài)，避免多峰和拖尾現(xiàn)象。因此，本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.2%甲酸溶液等3種流動(dòng)相對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果表明：7種有機(jī)酸類化合物中酒石酸和檸檬酸在乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液條件下，出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象，見(jiàn)圖1；而在乙腈-0.2%甲酸溶液作為流動(dòng)相下，7種有機(jī)酸類化合物半峰寬小，峰形對(duì)稱尖銳，滿足測(cè)試要求。

圖1 液相色譜條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of UPLC conditions

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

將有機(jī)酸混合對(duì)照溶液在上述液相質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，繪制進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)、定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)的7種有機(jī)酸類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性擬合得到線性方程和決定系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，7種有機(jī)酸線性擬合良好，決定系數(shù)均大于0.990。7種有機(jī)酸對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，7種有機(jī)酸峰形良好，目標(biāo)峰周圍無(wú)雜峰干擾，滿足定量檢測(cè)要求。根據(jù)信噪比（S/N）=3，計(jì)算得到7種有機(jī)酸的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

在烘焙洪都拉斯咖啡豆樣品中分別加入3個(gè)濃度梯度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述條件平行測(cè)定6次，扣除本底含量后計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，采用該研究建立的方法測(cè)定7種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為81.9%～104.7%，RSD為0.53%～6.64%。7種有機(jī)酸化合物精密度和回收率均滿足定量檢驗(yàn)需求。

表2 回歸方程和線性范圍Table 2 Linearity parameters and linear ranges of BPs

2.4 烘焙程度及咖啡豆種類因素考察

對(duì)7種有機(jī)酸在不同烘焙程度下的含量變化進(jìn)行研究，通過(guò)檢測(cè)洪德拉斯SHB咖啡生豆在220 ℃溫度下有機(jī)酸隨時(shí)間變化的含量，得到7種有機(jī)酸的含量變化點(diǎn)線圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，7種有機(jī)酸均有檢出，其中最主要的酸是奎尼酸、檸檬酸和蘋(píng)果酸，有機(jī)酸含量受溫度因素影響較大。富馬酸含量隨烘焙時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在烘焙40 min時(shí)達(dá)到最大值，含量為15.47 mg/kg；琥珀酸含量隨烘焙時(shí)間的增加而增加，烘焙前30 min含量變化較小，烘焙40 min時(shí)開(kāi)始快速增加，60 min烘焙含量最高；蘋(píng)果酸含量隨烘焙時(shí)間增加而逐漸降低，烘焙時(shí)間越長(zhǎng)，蘋(píng)果酸含量越低，烘焙40 min后降幅趨于平緩；酒石酸含量隨烘焙時(shí)間增加而增加，烘焙60 min酒石酸含量最高，為8.93 mg/kg；莽草酸含量變化較為特殊，前30 min未檢出，30 min之后開(kāi)始檢出，烘焙60 min達(dá)到峰值；奎尼酸含量隨烘焙時(shí)間的增加而逐漸升高，20 min后變化幅度較??；檸檬酸含量隨烘焙時(shí)間的增加呈現(xiàn)先增加后大幅減少的變化趨勢(shì)。根據(jù)主要的三種酸檸檬酸、蘋(píng)果酸與奎尼酸的含量變化表現(xiàn)可以看出輕度烘焙下，引起愉悅味道的檸檬酸和蘋(píng)果酸總量最高，達(dá)到1201.5 mg/kg，引起澀味的奎尼酸含量最低，為1363.7 mg/kg，因此輕度烘焙時(shí)咖啡豆的酸感最佳。

圖2 有機(jī)酸化混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（50 ng/mL）Fig.2 Chromatograms for the mixed standard solution of organic acids（50 ng/mL）

表3 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Results of tests for recovery and precision (n=6)

圖3 洪德拉斯咖啡豆不同烘焙程度下的有機(jī)酸含量變化（n=3）Fig.3 Organic acid content of Honduras coffee beans with different roasting (n=3)

圖4 4種咖啡豆不同烘焙程度下的有機(jī)酸含量變化（n=3）Fig.4 Organic acid content of 4 coffee beans with different roasting (n=3)

根據(jù)7種有機(jī)酸含量變化點(diǎn)線圖結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[23-24]可以得到有機(jī)酸的相互關(guān)系和變化規(guī)律：蘋(píng)果酸中α羥基受熱易脫水轉(zhuǎn)化為富馬酸，造成蘋(píng)果酸含量下降，富馬酸含量上升；奎尼酸可以由綠原酸加熱降解而來(lái)，莽草酸則由奎尼酸脫水生成，因此奎尼酸和莽草酸含量雖然都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但是莽草酸上升滯后于奎尼酸；檸檬酸在受熱下則會(huì)分解成琥珀酸，造成檸檬酸與琥珀酸含量形成負(fù)相互關(guān)系；酒石酸則由葡萄糖氧化分解形成，造成含量上升。

基于洪都拉斯咖啡豆中有機(jī)酸變化規(guī)律和最佳酸度烘焙條件，本研究對(duì)市面上常見(jiàn)的其他產(chǎn)地咖啡豆進(jìn)行了有機(jī)酸含量檢測(cè)，驗(yàn)證上述規(guī)律及工藝。結(jié)果見(jiàn)圖4，4種其他咖啡豆有機(jī)酸含量變化趨勢(shì)與洪都拉斯咖啡豆相似，但含量有所差異。研究表明巴西喜拉多咖啡豆在中輕度烘焙酸度最高，印尼羅布斯塔咖啡豆則在烘焙過(guò)程中酸度最低。比較奎尼酸含量變化圖發(fā)現(xiàn)，中輕度烘焙下，印尼羅布斯塔咖啡豆?jié)茸畹?；中深度到重深度烘焙過(guò)程中，印尼羅布斯塔咖啡豆?jié)茸罡?，但四種咖啡豆?jié)炔町愝^小。因此，本研究對(duì)烘焙過(guò)程中咖啡豆中有機(jī)酸變化規(guī)律具有普適性，滿足咖啡豆的基于酸度口感的烘焙工藝要求。

3 結(jié)論

建立了以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)咖啡豆中7種有機(jī)酸化合物的檢測(cè)方法；該方法采用純水作為提取溶劑、采用UPLC-MS/MS在負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下檢測(cè)，外標(biāo)法定量。該分析方法滿足方法學(xué)考察要求，操作簡(jiǎn)便，靈敏度好，準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，為咖啡豆中有機(jī)酸含量測(cè)定提供了技術(shù)支持?？Х榷沟目谖妒苡袡C(jī)酸影響較大，有機(jī)酸含量與烘焙條件密切相關(guān)，烘焙程度中對(duì)咖啡豆中7種有機(jī)酸含量影響的研究報(bào)道還較少，通過(guò)測(cè)定在6種烘焙條件下咖啡豆中7種有機(jī)酸含量，結(jié)果顯示7種有機(jī)酸均有檢出，其中最主要的酸是檸檬酸，奎尼酸和蘋(píng)果酸。烘焙過(guò)程中洪德拉斯咖啡豆，檸檬酸、蘋(píng)果酸含量下降，琥珀酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸含量上升，富馬酸含量先增加后降低；以檸檬酸和蘋(píng)果酸為指標(biāo)顯示，在輕度烘焙條件下，酸度口感最佳；考察4種常見(jiàn)產(chǎn)地咖啡豆發(fā)現(xiàn)，不同咖啡豆有機(jī)酸變化趨勢(shì)大體相同，但有機(jī)酸含量略有差異，因此調(diào)控烘焙程度及咖啡豆產(chǎn)地，可以有效地改變咖啡的酸味及澀味，同時(shí)本研究也為改進(jìn)咖啡烘焙工藝提供了一定的理論依據(jù)。