苓桂術(shù)甘湯加味聯(lián)合卡托普利對(duì)慢性心力衰竭大鼠BNP、ET-1、Caspase-3水平影響的研究

張燕飛,張 博,陳蘇寧

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽 110004)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是一種繼發(fā)于左室功能障礙的臨床疾病，目前全世界有3700多萬心力衰竭患者,且逐年增多[1]，并對(duì)衛(wèi)生服務(wù)產(chǎn)生巨大需求[2]。CHF臨床表現(xiàn)非常廣泛，如呼吸困難、乏力和體液潴留等，甚至危及生命。中醫(yī)無慢性心力衰竭之名，可歸屬“心悸”“胸痹”等范疇，基本病機(jī)是心氣不足，推動(dòng)血液能力下降，氣虛血瘀，久病漸致CHF，氣虛血瘀型心衰在臨床中較常見[3]。《素問·痹論》云：“心痹者，脈不通，煩則心下鼓，暴上氣而喘”。西藥治療心衰有效，中藥能改善癥狀，且不良反應(yīng)小，中西醫(yī)聯(lián)合治療能有效減輕患者的不適狀態(tài)，提高生存期望值。

B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)在臨床中能準(zhǔn)確地判斷心衰嚴(yán)重程度,具有較高的臨床診斷價(jià)值[4]。內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)由內(nèi)皮細(xì)胞及多種不同類型的細(xì)胞合成,對(duì)心臟損傷有較高的診斷價(jià)值。實(shí)驗(yàn)中心力衰竭動(dòng)物和心力衰竭患者血漿ET-1水平升高,與血流動(dòng)力學(xué)和癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5]。有研究表明,血漿ET-1水平與心衰患者的病死率有關(guān)[6]。Savoj等[7]認(rèn)為ET-1可能是HF的重要預(yù)后指標(biāo),ET-1水平升高與心衰加重、右心室功能下降、肺動(dòng)脈壓升高、左房容積指數(shù)升高有關(guān)[8]。ET-1被認(rèn)為是心力衰竭的預(yù)測(cè)因子和預(yù)后指標(biāo)[9]。在161例臨床研究中,心衰患者血清中BNP和ET-1均高表達(dá),高血壓、低鈉血癥、高BNP、高ET-1是心血管不良事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,血清BNP、ET-1與心力衰竭患者心泵功能及心室重構(gòu)密切相關(guān),可作為評(píng)價(jià)預(yù)后的重要參考指標(biāo)[10]。在心動(dòng)過速誘發(fā)心力衰竭犬模型細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中,心衰時(shí)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartate specific protease 3,Caspase-3)基因表達(dá)增加[11]。

中醫(yī)藥治療CHF在癥狀改善、整體康復(fù)醫(yī)療、提高生活質(zhì)量等方面具有一定優(yōu)勢(shì)。吾師依據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)以苓桂術(shù)甘湯為基礎(chǔ)增加黃芪、丹參、赤芍三味藥，此方具有益氣活血、溫陽利水的功效。本實(shí)驗(yàn)通過觀察比較不同干預(yù)條件下大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平的變化，研究苓桂術(shù)甘湯加味聯(lián)合卡托普利對(duì)心衰大鼠的作用和療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，8周齡，體重180～220 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)[SYXK(遼)2017-0004]。本課題符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物倫理編號(hào)2019PS430K。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪研發(fā)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，恒溫恒濕、采光明暗交替12 h、無菌飼料專人喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑：鹽酸異丙腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)41190402)；卡托普利片(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)PA180308)；ET-1、BNP、Caspase-3雙抗夾心酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒(上海酶聯(lián)生物有限公司，批號(hào)分別為20190626、20190718、20191022)；中性樹脂(中國(guó)上海標(biāo)本模型廠，批號(hào)20170715)；0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業(yè)股份有限公司，批號(hào) Q1906060)。

1.1.3 主要儀器：顯微鏡 (型號(hào) E800)；圖像采集軟件(版本NIS-Elements F3.0)；PowerLab生理記錄儀(型號(hào)Power Lab PL3508)；電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，JJ323BC型)；彩色超聲診斷系統(tǒng)(Philips Ultrasound公司，型號(hào)iE33)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司，型號(hào)NS20150619016)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苓桂術(shù)甘湯加味：茯苓、黃芪各20 g，桂枝、炙甘草各10 g，白術(shù)、丹參、赤芍各15 g。藥品由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院免煎藥房提供。

1.2.2 建模、分組及給藥：SPF雄性SD大鼠50只，隨機(jī)選取10只為正常組，剩余40只建立心衰大鼠模型，腹腔注射異丙腎上腺素，劑量為5 mg/(kg·d)，1次/d，連續(xù)7 d復(fù)制心衰模型[12]，1周后將造模成功大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為心衰組10只、中藥組10只、西藥組10只、聯(lián)合組10只。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》給藥劑量換算，大鼠給予劑量是人的6.3倍，西藥組給予2.5 mg/(kg·d)的卡托普利灌胃，中藥組給予3 g/(kg·d)的苓桂術(shù)甘湯加味灌胃，聯(lián)合組予等劑量卡托普利聯(lián)合等劑量苓桂術(shù)甘湯加味灌胃，心衰組和正常組給予等體積生理鹽水，以上各組均1次/d，連續(xù)4周灌胃。

1.2.3 心功能檢測(cè)：灌胃4周后，正常組與心衰組分別隨機(jī)抽取5只大鼠，多普勒彩色超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.2.4 病理形態(tài)學(xué)觀察：取大鼠左心室置于4%多聚甲醛溶液,4 ℃冰箱固定48 h,常規(guī)切片后將玻片放置于60 ℃烘烤箱中12 h,HE染色后用中性樹膠封片,晾干。通過電子顯微鏡拍照,采集分析組織相關(guān)部位。

1.2.5 BNP、ET-1、Caspase-3的水平檢測(cè)：灌胃4周后，10%水合氯醛麻醉大鼠，用5 ml注射器從腹主動(dòng)脈采血。將血液置于4 ml的EP管中，室溫自然凝固2 h。低溫高速離心20 min，轉(zhuǎn)速為3000 r/min，取上清液，采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 心臟質(zhì)量指數(shù)(Heart mass index,HMI)檢測(cè)：取心臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，用電子秤稱重，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)。計(jì)算公式：HMI=心臟重量/總體重×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠外觀狀態(tài)觀察 正常組大鼠一切如常，其余四組大鼠出現(xiàn)脫毛、呼吸喘促、腳部水腫、行動(dòng)遲緩以及死亡。最終實(shí)驗(yàn)處理前，心衰組死亡3只，西藥組死亡2只，中藥組死亡2只，聯(lián)合組無死亡。

2.2 各組大鼠心功能比較

2.2.1 正常組與心衰組心電圖比較：造模1周后，從正常組和心衰組中隨機(jī)抽取大鼠記錄其心電圖，觀察心率變化，心衰組R-R間期縮短，心率代償性增快(圖1)。

圖1 正常組與心衰組大鼠心電圖比較

2.2.2 各組大鼠LVEF、HMI比較：治療4周后,各給藥組大鼠的LVEF、HMI水平明顯優(yōu)于心衰組,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而給藥組之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠LVEF、HMI水平比較

2.2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞組織病理學(xué)：光鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞病理學(xué)情況(圖2)。正常組心肌纖維結(jié)構(gòu)正常；心衰組心肌細(xì)胞肥大、肌纖維增厚、細(xì)胞核增大、排列紊亂，部分心肌細(xì)胞壞死、空泡變性，伴有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥組、西藥組、聯(lián)合組大鼠心肌纖維增厚、排列稍紊亂，伴輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞組織病理學(xué)比較(HE染色，×200)

2.2.4 各組大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平比較：三組給藥大鼠治療后BNP、ET-1和Caspase-3水平均有所下降,各給藥組與心衰組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清BNP、ET-1、Caspase-3水平比較

3 討 論

CHF是一種綜合征，不僅患病率高，而且預(yù)后差，已成為老年人死亡的主要原因之一。在我國(guó)古代醫(yī)學(xué)書籍中，心氣虛是心衰最基本的病機(jī)[13]。中藥在穩(wěn)定病情、改善心臟功能、提高生活質(zhì)量等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，臨床多采取益氣活血，溫陽利水消腫的治療原則，療效較好[14-15]。苓桂術(shù)甘湯加味由吾師多年經(jīng)驗(yàn)而來，本研究旨在驗(yàn)證苓桂術(shù)甘湯加味對(duì)心衰大鼠BNP、ET-1、Caspase-3指標(biāo)的影響，為臨床用藥提供依據(jù)。

ET-1前體分子在合成ET-1過程中產(chǎn)生的血漿ET-1及其相關(guān)肽的循環(huán)水平作為心血管事件的潛在危險(xiǎn)標(biāo)志物已被廣泛研究。ET-1在調(diào)節(jié)血管張力中起關(guān)鍵作用，并可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增殖和纖維化。ET-1的作用是通過細(xì)胞表面受體的參與，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)通路激活，從而使血管收縮，平滑肌細(xì)胞增殖,與心衰嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。冠心病患者ET-1水平高于健康人，ET-1水平與疾病嚴(yán)重程度及心臟功能密切相關(guān)[17]。Bossard等[18]研究發(fā)現(xiàn)ET-1的表達(dá)水平不僅與CHF有關(guān)，還與急性心力衰竭、冠心病等心血管疾病有關(guān)。Horckmans等[19]在大鼠模型上進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并認(rèn)為ET-1水平降低與微血管通透性降低、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)減少有關(guān)。ET-1與衰老、血壓、肺功能和慢性腎臟疾病的關(guān)系，以及ET-1水平與心臟重構(gòu)(包括左心房直徑增加和左心室質(zhì)量增加)相關(guān)的證據(jù)已被描述。ET-1被認(rèn)為是心力衰竭的預(yù)測(cè)因子和預(yù)后指標(biāo)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要基因之一。有研究顯示，TAC小鼠心肌中的Catenin表達(dá)水平顯著升高，相應(yīng)的，促凋亡蛋白即Caspase-3和Bax的表達(dá)水平顯著升高，Caspase和Bcl-2家族蛋白是凋亡通路的關(guān)鍵因素，Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡的主要Caspases之一，Caspase-3在心肌細(xì)胞凋亡中起重要作用[20]。

通過本實(shí)驗(yàn)可以得出，苓桂術(shù)甘湯加味聯(lián)合卡托普利可以明顯逆轉(zhuǎn)慢性心力衰竭大鼠心臟充血、水腫等肉眼改變，減少心肌病理結(jié)構(gòu)的異常改變，降低血清BNP、ET-1、Caspase-3水平，提高LVEF水平，改善心衰大鼠的生活狀態(tài)，進(jìn)而為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。