巨噬細胞J774A.1外泌體促進結直腸癌細胞系MC38和CT26的增殖和遷移

楊旭東，于紅亮，李 靜，趙春華

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 細胞生物學系，北京 100005)

結直腸癌(colorectal cancer)是最常見的惡性腫瘤之一，約占全世界每年診斷的癌癥和癌癥相關死亡的10%，在發(fā)展中國家的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢[1-2]。外泌體是幾乎所有細胞都能分泌的直徑30～200 nm的雙層膜囊泡，含有蛋白、DNA、RNA、脂質等多種成分，具有生物學功能[3]。隨著近些年的不斷研究，外泌體顯示出了在多方面的功能和應用，比如減緩衰老，治療少肌癥和阿爾茨海默病[4-6]。

近年來，巨噬細胞外泌體對腫瘤作用的研究也在逐漸增加。通常，M1型巨噬細胞的外泌體具有促炎和抑制腫瘤生長的作用，如能增強疫苗的抗腫瘤活性[7]，增強紫杉醇抗腫瘤的效果[8]，而M2型巨噬細胞的外泌體卻是抑炎和促進腫瘤生長的[9-10]。J774A.1細胞是小鼠單核巨噬細胞，有研究證明其表型為M2型[11-12]，目前該細胞及其外泌體對結直腸癌影響及相關機制的報導較少。本研究使用J774A.1的外泌體處理結直腸癌細胞MC38和CT26，觀察它們的增殖、遷移能力及MEK-ERK通路磷酸化水平的變化，初步探索J774A.1的外泌體在結直腸癌中的作用，以期為人結直腸癌的治療提供一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和耗材：DMEM高糖、RPMI 1640 和胎牛血清(Gibco公司)；青霉素和鏈霉素(PS)(華北制藥股份有限公司)；0.22 μm濾杯和100 KD超濾管(Millipore公司)；流式抗體CD68和CD206(Proteintech公司)；多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)；CCK8試劑盒(Yeasen公司)；Western blot抗體CD63(Proteintech公司), TSG101和CD9(Abcam公司), MEK、p-MEK、ERK和p-ERK(Cell Signaling Technology公司)。

1.1.2 細胞：小鼠巨噬細胞J774A.1及小鼠結直腸癌細胞系MC38和CT26均購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：J774A.1細胞用DMEM高糖+10% FBS+PS培養(yǎng)，MC38細胞和CT26細胞用RPMI 1640+10% FBS+PS培養(yǎng)。

1.2.2 J774A.1細胞表型的鑒定：將J774A.1細胞用細胞刮收集，用D-Hank’s緩沖液清洗后于4 ℃孵育一抗30 min，清洗后于4 ℃孵育二抗30 min，清洗后篩網(wǎng)過濾，流式檢測CD68和CD206。

1.2.3 超濾法提取外泌體：當J774A.1細胞匯合度達到80%時，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。收集上清至50 mL離心管，2 500 r/min離心30 min去除細胞碎片等雜質。離心后的上清用0.22 μm的濾杯在超凈工作臺中過濾，之后再用100 KD超濾管在4 ℃超速離心機中離心以提取外泌體，離心轉速從4 000×g逐漸上升到6 000×g，離心時間從5 min逐漸上調到20 min。

1.2.4 透射電鏡鑒定外泌體：1%戊二醛固定外泌體，滴20 μL在銅網(wǎng)上，滴加1%乙酸雙氧鈾負染2 min，濾紙吸除多余染液，日光燈下干燥1 h后拍照。

1.2.5 結直腸癌細胞對外泌體的攝取：將1 μL 濃度為1 mmol/L的熒光染料DiI加入1 mL含外泌體的RPMI 1640溶液中，將適量混合液加入細胞培養(yǎng)板中，在不同時間段(0、6、12、24 h)對細胞使用多聚甲醛固定，清洗后加入1 μL Hoechst染料染色，清洗后加入1 mL緩沖液，拍照。

1.2.6 CCK8檢測細胞增殖：將MC38和CT26細胞分別按2 000個/孔接種于96孔板，第1～3天內檢測，加入10% CCK8培養(yǎng)1 h，用酶標儀在450 nm處檢測吸光度值。按CCK8試劑盒說明書計算細胞增殖率。

1.2.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力：將細胞按5.0×105個/孔接種于6孔板，當細胞匯合至90%時，用10 μL的槍頭進行劃痕，用緩沖液清洗3次。外泌體濃度為300 μg/mL，在不同時間點(如0、12、18、24、36 h)顯微鏡下進行觀察和拍照。

1.2.8 Western blot檢測蛋白：將細胞按2×105個/孔接種于6孔板，過夜換新鮮培養(yǎng)基且添加外泌體，外泌體濃度為300 μg/mL，處理24 h后提取細胞總蛋白用于Western blot實驗，檢測MEK-ERK信號通路。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 J774A.1細胞表型及其外泌體的鑒定

小鼠單核巨噬細胞J774A.1貼壁生長,流式細胞術檢測其表型為CD68+CD206+(圖1A)，說明其為M2型巨噬細胞。按照超濾的方法提取J774A.1細胞的外泌體。透射電鏡觀察到外膜深染的圓形或類圓形的微囊泡，直徑為30～140 nm(圖1B)。納米顆粒追蹤分析NTA顯示囊泡的直徑分布范圍，峰值在126.6 nm處(圖1C)。Western blot實驗表明這些微囊泡陽性表達外泌體的標志蛋白TSG101、CD63和CD9(圖1D)。以上結果符合外泌體的基本特征。

A.flow cytometry was used to identify the phenotype of J774A.1； B.transmission electron microscopy was used to detect the morphology of J774A.1 exosome； C.NTA was used to assess the diameter size of J774A.1 exosome； D.Western blot was used to detect the surface markers of J774A.1 exosome

2.2 結直腸癌細胞MC38和CT26攝取J774A.1的外泌體

分別在0、6、12和24 h對細胞進行免疫熒光觀察的結果顯示，隨著時間的延長，MC38和CT26對外泌體的攝取量逐漸增加，24 h時達到高峰(圖2)。

圖2 MC38及CT26攝取J774A.1外泌體Fig 2 Uptake of J774A.1 exosome by MC38 and CT26

2.3 J774A.1細胞的外泌體促進MC38和CT26細胞增殖

CCK8法檢測結果顯示，用不同濃度外泌體處理24～72 h后，相比于MC38細胞的對照組，外泌體的所有濃度處理組的細胞增殖均顯著增加(P<0.05)，且存在一定的濃度和時間依賴性(圖3)。而相比于CT26細胞的對照組，外泌體的高濃度處理組(50～300)μg/mL的細胞增殖也都明顯增加(P<0.05)，并且呈一定的濃度和時間依賴性(圖3)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 μg/mL group圖3 CCK8法檢測MC38和CT26的增殖能力Fig 3 Proliferation of MC38 and CT26 was detected by CCK8

2.4 J774A.1細胞的外泌體促進MC38及CT26細胞的遷移能力

無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，隨著時間的增加，與對照組相比，加入外泌體的實驗組MC38細胞和CT26細胞的遷移率均明顯增加(圖4)。

圖4 劃痕愈合實驗檢測MC38和CT26的遷移能力Fig 4 Migration ability of MC38 and CT26 was detected by wound healing assay

2.5 J774A.1細胞的外泌體對增殖遷移相關信號通路的影響

Western blot檢測增殖遷移相關的MEK-ERK信號通路的結果顯示，p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達水平升高(圖5)。

圖5 蛋白印跡法檢測MC38和CT26中MEK-ERK信號通路的活化情況Fig 5 The activation of MEK-ERK signaling pathway in MC38 and CT26 was detected by Western blot

3 討論

惡性腫瘤具有無限增殖、抗凋亡、促進炎性反應、向組織侵襲和轉移等能力，其并發(fā)癥所帶來的危害會造成患者身心的巨大痛苦和醫(yī)療費用上的沉重負擔，所以腫瘤治療具有非常重要的意義。腫瘤組織由腫瘤細胞及其賴以生存的腫瘤微環(huán)境組成，腫瘤微環(huán)境含有免疫細胞在內的細胞成分、細胞外基質和細胞因子等。外泌體也屬于腫瘤微環(huán)境，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。

結直腸癌是威脅人類健康和生命的一大惡性腫瘤，具有相當高的發(fā)病率和病死率。本研究探討了小鼠巨噬細胞J774A.1分泌的外泌體對結直腸癌細胞系MC38和CT26的影響，實驗結果提示增殖遷移能力的增強在機制上可能是通過激活MEK-ERK信號通路實現(xiàn)的。通常情況下，外泌體可以通過microRNA或蛋白等成分作用于信號通路，從而發(fā)揮生物學功能[10,13]。所以值得進一步研究的是，J774A.1外泌體是通過何種分子成分活化的此通路。經(jīng)過文獻檢索，M2型巨噬細胞的外泌體對結直腸癌、胃癌、肝癌、胰腺導管癌、膠質瘤、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌有促進作用。MEK-ERK是腫瘤細胞增殖遷移的一條常見通路，但是迄今未發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞的外泌體通過此通路促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的報導。此外，有研究表明，M2型巨噬細胞外泌體可通過PI3K-AKT通路促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。實際上，腫瘤和巨噬細胞之間的作用是相互的，腫瘤的外泌體也能對巨噬細胞產(chǎn)生非常重要的影響[15]。比如，結直腸癌的外泌體能夠誘導巨噬細胞向M2型極化，而極化的巨噬細胞能促進上皮間質轉化和分泌生長因子、趨化因子等,促進癌癥的發(fā)展與轉移[14,16]。

隨著研究的深入，相信外泌體的結構和組分會得到不斷的解析，在外泌體表面的分子修飾及其內部成分的可控變化，將使外泌體在疾病治療上的作用得到極大的進步。而且巨噬細胞與腫瘤關系密切，二者之間的作用也許能幫助我們較好地理解巨噬細胞外泌體的功能及其在腫瘤治療中的應用。綜上所述，M2型巨噬細胞J774A.1的外泌體有望成為結直腸癌上分子靶向治療研究的一個新工具。