電擊死大鼠皮膚超微結(jié)構(gòu)及心肌HIF-2α、H-FABP 的表達(dá)變化

馮國(guó)偉，劉霞，齊倩，王松軍，楊琛騰，左敏，張國(guó)忠

1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院司法鑒定中心，河北 石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院 河北省法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊050017

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，由電流引起的損傷或死亡較為多見(jiàn)，電流斑是判斷電擊損傷的主要形態(tài)學(xué)依據(jù)，然而在低電壓、環(huán)境潮濕、水中觸電等情況下則有可能不形成電流斑[1]，此類案件一般是結(jié)合案情、現(xiàn)場(chǎng)和尸體檢驗(yàn)等綜合作出判斷，法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)尚缺乏形態(tài)學(xué)依據(jù)，因此，電擊死尤其是無(wú)明顯電流斑電擊死的判定以及生前與死后電擊的鑒別診斷仍然是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中亟待解決的問(wèn)題[2-3]。本研究在大鼠電擊模型的基礎(chǔ)上，利用掃描電鏡觀察大鼠電擊部位皮膚的改變，同時(shí)對(duì)心肌缺氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）和心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（heart typefatty acid-binding protein，H-FABP）含量進(jìn)行檢測(cè)，以期為電擊死的法醫(yī)學(xué)判定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立

健康SD 大鼠72 只（由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量（220±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為電擊死組、死后電擊組和對(duì)照組，每組24 只。

參照文獻(xiàn)[4]，電擊死組大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后連接自制電擊裝置，用金屬夾連接大鼠左前肢與右后肢，接通電源（220 V，50 Hz）電擊至死。通電后大鼠開(kāi)始痙攣、卷曲、尾強(qiáng)直，幾秒鐘即出現(xiàn)震顫，約2 min 后該現(xiàn)象減弱并消失。斷電時(shí)，大鼠心搏呼吸停止，已死亡。將大鼠分別于死后即刻、死后30 min、死后60 min 取電擊部位皮膚和心臟，每個(gè)亞組8 只。

死后電擊組大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后頸椎脫臼處死，之后分別于死后即刻、死后30 min、死后60 min 連接自制電擊裝置，用金屬夾連接大鼠左前肢與右后肢，通電2 min（220 V，50 Hz），電擊后立即取電擊部位皮膚和心臟，每個(gè)亞組8 只。

對(duì)照組大鼠經(jīng)10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，用金屬夾連接大鼠左前肢與右后肢2 min，不通電，頸椎脫臼處死之后，分別于死后即刻、死后30 min、死后60 min 取連接裝置部位皮膚和心臟，每個(gè)亞組8 只。

皮膚樣本大小為3 mm×3 mm，部分置于4%甲醛溶液中待HE 染色，部分置于2.5%戊二醛固定液中，待掃描電鏡觀察。心臟組織置于4%甲醛溶液中待行免疫組織化學(xué)染色。

本研究通過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

兔來(lái)源抗HIF-2α 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），兔來(lái)源抗H-FABP 抗體（武漢博士德生物工程有限公司），SP-9001 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB 顯色試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

BX61 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司），S-3500N掃描電鏡（日本Hitachi 公司）。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

將大鼠皮膚組織固定制成蠟塊，常規(guī)HE 染色后，置于光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察。

1.3.2 掃描電鏡觀察

皮膚組織經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后乙醇梯度脫水（50%乙醇溶液20 min，70%乙醇溶液20 min，80%乙醇溶液20 min，90%乙醇溶液20 min，100%乙醇20 min），將皮膚組織置于掃描電鏡下（×800）觀察。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色

將大鼠心臟組織固定制成蠟塊，切片常規(guī)脫蠟，PBS洗滌后，用3%過(guò)氧化氫（H2O2）室溫下封閉30 min，浸于抗原修復(fù)液中微波抗原修復(fù)，自然冷卻后用PBS清洗3 次，3%甲醇-過(guò)氧化氫室溫孵育30 min，PBS 清洗3 次，滴加山羊血清工作液于37 ℃下封閉30 min；分別滴加1∶400 稀釋的抗HIF-2α 抗體、1∶600 稀釋的抗H-FABP 抗體，置于4 ℃濕盒中過(guò)夜，次日切片恢復(fù)室溫后用PBS 清洗，滴加山羊血清工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗后再滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 聚合物，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗，用DAB 顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染，水洗返藍(lán)，常規(guī)脫水透明后中性樹(shù)膠封片，置于顯微鏡下觀察。

HIF-2α 蛋白在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)為細(xì)胞核黃染，H-FABP 在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)著色。各亞組切片于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野，運(yùn)用Image-Pro Plus（IPP）圖像分析軟件計(jì)算HIF-2α 陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值及H-FABP 缺染面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0 軟件（美國(guó)IBM 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用表示，各組間的比較采用單因素方差分析，采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 皮膚改變及HE染色

對(duì)照組皮膚無(wú)明顯變化。電擊死組與死后電擊組大鼠電擊處皮膚有燒灼表現(xiàn)；電流斑與接觸導(dǎo)體走行一致，呈灰黃色，質(zhì)地較硬，干燥，中央凹陷，周圍稍隆起，邊緣鈍圓，與周圍組織分界清晰。鏡下見(jiàn)對(duì)照組表皮細(xì)胞排列整齊，無(wú)異常，細(xì)胞和胞核無(wú)極性化改變；電擊死組與死后電擊組可見(jiàn)表皮細(xì)胞融合變薄、致密，細(xì)胞界限不清，表皮細(xì)胞胞質(zhì)均質(zhì)化，表皮下空泡形成，縱向伸長(zhǎng)且嚴(yán)重扭曲變形，有核流征表現(xiàn)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠皮膚的組織病理學(xué)改變（HE×400）Fig.1 Histopathological changes of rats skin in each group（HE×400）

2.2 掃描電鏡觀察

對(duì)照組皮膚在掃描電鏡下可見(jiàn)復(fù)層扁平上皮排列整齊，細(xì)胞界限清晰。電擊死組皮膚在掃描電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞碎屑，細(xì)胞界限不清，皮膚表面缺損，可見(jiàn)分枝型裂隙和枯焦?fàn)铨斄眩つw表面散在圓形和橢圓形小孔，邊緣不規(guī)則，散在大量球形異物顆粒，表面凹凸不平，附著或鑲嵌于受損皮膚表面，在損傷區(qū)內(nèi)不能區(qū)分角質(zhì)層與其他各層細(xì)胞。死后電擊組皮膚在掃描電鏡下的改變與電擊死組類似。詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠皮膚在掃描電鏡下的觀察結(jié)果（×800）Fig.2 Scanning electron microscope images of rats skin in each group（×800）

2.3 HIF-2α免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞偶見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，且各亞組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比，電擊死各亞組HIF-2α表達(dá)均明顯增多且在死后即刻達(dá)到高峰，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。電擊死后30 min 組與電擊死后即刻組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電擊死后60 min 組與前兩組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

死后電擊組僅在死后即刻較相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組表達(dá)增多（P＜0.05），但低于電擊死后即刻組（P＜0.05）；死后30 min 電擊組和死后60 min 電擊組心肌細(xì)胞均可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，但與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。死后30 min 電擊組與死后60 min 電擊組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但兩組與死后即刻電擊組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果詳見(jiàn)表1、圖3。

圖3 各組大鼠心肌HIF-2α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining results of HIF-2α of rats myocardium in each group（×400）

表1 各組大鼠心肌HIF-2α蛋白表達(dá)的平均光密度值Tab.1 Immunohistochemical changes of HIF-2α of rats myocardium in each group （n=8，）

表1 各組大鼠心肌HIF-2α蛋白表達(dá)的平均光密度值Tab.1 Immunohistochemical changes of HIF-2α of rats myocardium in each group （n=8，）

注：1）與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同組死后即刻大鼠比較，P＜0.05；3）與同組死后30 min 大鼠比較，P＜0.05；4）與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)電擊死組比較，P＜0.05。

2.4 H-FABP免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)較均勻一致的陽(yáng)性表達(dá)，偶見(jiàn)點(diǎn)片狀缺染，各亞組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

電擊死組大鼠隨死后時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞缺染面積逐漸增大，各亞組之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

死后電擊各亞組心肌缺染面積較對(duì)照組增大，各亞組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但缺染面積低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)電擊死組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果詳見(jiàn)表2、圖4。

圖4 各組大鼠心肌H-FABP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining results of H-FABP of rats myocardium in each group（×400）

表2 各組大鼠心肌H-FABP表達(dá)的缺染面積Tab.2 Staining loss area of H-FABP of rats myocardium in each group （n=8，，μm2）

表2 各組大鼠心肌H-FABP表達(dá)的缺染面積Tab.2 Staining loss area of H-FABP of rats myocardium in each group （n=8，，μm2）

注：1）與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與同組死后即刻大鼠比較，P＜0.05；3）與同組死后30 min 大鼠比較，P＜0.05；4）與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)電擊死組比較，P＜0.05。

3 討論

電流損傷的形態(tài)學(xué)變化分為體表變化和體內(nèi)變化兩部分。本研究掃描電鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組皮膚可見(jiàn)復(fù)層扁平上皮排列整齊，細(xì)胞界限清晰。電擊死組皮膚可見(jiàn)細(xì)胞碎屑，細(xì)胞界限不清，皮膚表面缺損，可見(jiàn)分枝型裂隙和枯焦?fàn)铨斄?，皮膚表面散在圓形和橢圓形小孔，邊緣不規(guī)則，散在大量球形異物顆粒，表面凹凸不平，附著或鑲嵌于受損皮膚表面，在損傷區(qū)內(nèi)不能區(qū)分角質(zhì)層與其他各層細(xì)胞。死后電擊組皮膚鏡下表現(xiàn)與電擊死組類似。因此，單純依據(jù)皮膚掃描電鏡結(jié)果并不能有效區(qū)分電擊死與死后電擊。

HIF-2α 是HIF-2 的活性亞基和功能性亞基，受氧含量水平的調(diào)節(jié)，是細(xì)胞在缺氧應(yīng)答反應(yīng)中最早作出反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，也是重要的調(diào)節(jié)因子之一[5-6]。TALKS 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，除了巨噬細(xì)胞外，正常人的其他組織和器官中幾乎沒(méi)有HIF-2α 的表達(dá)。有關(guān)胚胎發(fā)育的研究[8-10]結(jié)果表明，HIF-2α mRNA 主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在肝細(xì)胞、腎成纖維細(xì)胞、胰腺間質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和心肌間質(zhì)細(xì)胞中也有一定的表達(dá)。在常氧狀態(tài)下，HIF-2α 的半衰期很短，在細(xì)胞中處于不斷被合成和降解的狀態(tài)，在氧濃度低于2%的條件下，HIF-2α 亞基氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）中的脯氨酸殘基Pro530和Pro405 不能被羥化，導(dǎo)致HIF-2α 不能被E3 泛素連接酶復(fù)合體的VHL 蛋白識(shí)別和降解，導(dǎo)致HIF-2α 蛋白在細(xì)胞核聚集增多[11]。本研究對(duì)照組大鼠心肌偶見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明HIF-2α 在正常心肌細(xì)胞中僅有少量表達(dá)，且在死亡后60 min 內(nèi)表達(dá)無(wú)明顯變化。而電擊死組在死后即刻和死后30 min 出現(xiàn)HIF-2α 高表達(dá)，死后60 min 表達(dá)有所下降，推測(cè)心肌缺血缺氧在電損傷發(fā)生機(jī)制中的作用非常關(guān)鍵，電擊死可能影響心肌的電子傳遞鏈從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)窒息進(jìn)而誘導(dǎo)HIF-2α 的高表達(dá)，且HIF-2α 對(duì)生前電擊具有高度敏感性，在心肌缺氧60 min 后僅發(fā)生少量的降解，說(shuō)明HIF-2α 具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。死后電擊組大鼠心肌僅在死后即刻出現(xiàn)一定的陽(yáng)性表達(dá)，可能因?yàn)榇笫蟊惶幩篮笮募〖?xì)胞還存在一定的生物活性，導(dǎo)致心臟遭受電擊后引起HIF-2α 高表達(dá)進(jìn)而對(duì)心臟起保護(hù)作用，然而隨著死后時(shí)間的延長(zhǎng)，心肌細(xì)胞失活，抗原表位丟失等原因造成HIF-2α 低表達(dá)。

H-FABP 是心臟中富含的一種新型低分子量蛋白質(zhì)，廣泛存在于心肌細(xì)胞的胞質(zhì)，分子量為14 000～15 000，占心臟中全部可溶性蛋白的4%～8%[12]。HFABP 是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換半衰期為2～3 d，作為一種公認(rèn)的心肌損傷標(biāo)志物，H-FABP 對(duì)防止心肌損傷具有決定性的意義[13]。H-FABP 通過(guò)離子通道的調(diào)節(jié)結(jié)合或者釋放脂肪酸，參與心肌內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝。H-FABP 具有高度心臟特異性[14]，作為一種心肌損傷的標(biāo)志物得到越來(lái)越多的應(yīng)用，目前主要用于急性心肌梗死的早期診斷、心肌早期損傷和缺血再灌注的評(píng)估等[14-16]。既往研究[17-18]結(jié)果證實(shí)，心肌缺血后心臟樣本中可見(jiàn)H-FABP 缺失，并且缺失規(guī)律和肌紅蛋白類似。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞中H-FABP 大量存在，無(wú)明顯缺染；電擊死組大鼠心肌細(xì)胞中H-FABP 可見(jiàn)明顯缺染，說(shuō)明心肌細(xì)胞對(duì)缺血高度敏感，電擊后心肌脂肪酸代謝加快以提供能量，心肌細(xì)胞內(nèi)H-FABP 含量迅速上升，由于H-FABP 具有相對(duì)較低的分子量，且電擊后心肌細(xì)胞受損，細(xì)胞膜通透性增加，H-FABP 從心肌釋放，進(jìn)入血液循環(huán)，隨著死后時(shí)間的延長(zhǎng)，H-FABP 持續(xù)進(jìn)入血液導(dǎo)致H-FABP 缺染面積逐漸增大；死后電擊組大鼠由于死后心肌失活，血液循環(huán)消失，僅有少量H-FABP 由心肌細(xì)胞釋放進(jìn)入血液，故死后電擊各亞組均只有少量H-FABP 缺染。因此，進(jìn)一步檢測(cè)血液中H-FABP 的表達(dá)情況可為電擊死的診斷提供依據(jù)。

綜上所述，皮膚掃描電鏡可為電擊死的鑒定提供一定的幫助，但是并不能有效地鑒別生前電擊與死后電擊。死后電擊各亞組心肌HIF-2α 表達(dá)均低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)電擊死組，且在死后30 min 表達(dá)差異最大，而死后電擊各亞組心肌H-FABP 表達(dá)均高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)電擊死組，且在死后60 min 表達(dá)差異最大，提示HIF-2α、H-FABP 對(duì)電擊死與死后電擊的鑒別具有一定意義。