吉非替尼通過調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體影響兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷作用的機(jī)制

謝大偉 ，張來鑫 ，李青松 ，王靜 ，王彤

作者單位：1 秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院手足外科，河北 秦皇島 066000；2 青龍縣醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 秦皇島 066500

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）主要的病理改變表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨缺損及軟骨下骨質(zhì)增生。目前OA 的發(fā)病機(jī)制依然不夠清楚，但氧化應(yīng)激、炎癥因子、維生素 D、肥胖等因素都被證明是 OA 的危險(xiǎn)因素，其中炎性因子誘發(fā)的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解和軟骨退化被認(rèn)為是 OA 的主要因素。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路在機(jī)體的很多生長(zhǎng)及代謝過程都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，尤其是在骨骼系統(tǒng)中調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中的作用。吉非替尼作為一種選擇性 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑，通過選擇性競(jìng)爭(zhēng) EGFR 酪氨酸激酶催化區(qū)域中的 Mg-ATP 結(jié)合位點(diǎn)，從而阻斷 EGFR 信號(hào)通路，抑制非小細(xì)胞肺癌的血管生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但其在關(guān)節(jié)炎的作用目前鮮少報(bào)道。本研究于 2019年 1—6月在研究吉非替尼調(diào)控兔膝 OA 模型軟骨代謝過程中，進(jìn)一步明確 EGFR 調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝的具體機(jī)制，來為 OA 的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇清潔級(jí)健康新西蘭兔 30 只，雌性各半，6月齡，體質(zhì)量范圍為 2.0～2.5 kg，由上海市松江區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廠提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017—0008，由福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng) ，許可證號(hào) SCXK（閩）2017-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲得秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20190513）。根據(jù)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》中動(dòng)物處理方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器

吉非替尼（山東安弘制藥有限公司提供 ，批號(hào) H20160013，批次 20161223）；原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL）檢測(cè)試劑盒（上海銳聰科技發(fā)展有限公司）；Ⅱ型膠原蛋白（COL-Ⅱ）、基質(zhì)金屬蛋白酶 13（MMP-13）免疫組化試劑盒（武漢博士德生物制劑有限公司）；腫瘤壞死因子 α（TNF-α），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司）；磷酸化絲裂素活化蛋白激酶（p-P38 MAPK）、絲裂素活化蛋白激酶（P38MAPK）、p-EGFR、EGFR、GAPDH 多克隆抗體（美國(guó) Abcam 公司）；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó) sigma3-30K）；OLYMPUSBX 51 顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；HPIAS-1000 高清晰彩色病理圖 像 分 析系統(tǒng)（同濟(jì)千屏）。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

將 30 只 6月齡新西蘭兔采用隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組、模型組、吉非替尼組，每組 10 只。所有組均根據(jù) Hulth-Telhag 法建立 OA 模型，利用 30 mg∕kg 戊巴比妥鈉與兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔保持仰臥位固定后，常規(guī)備皮，消毒鋪巾，取兔左、右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)行縱側(cè)剪開長(zhǎng)約 4 cm 的切口，假手術(shù)組僅剪開皮膚，不做任何處理，模型組及吉非替尼組均剪斷前、后交叉韌帶及內(nèi)側(cè)副韌帶，并將內(nèi)側(cè)半月板完整的摘除，傷口縫合，采取無敷料包扎，不對(duì)傷腿進(jìn)行固定。術(shù)后采用單兔單籠喂養(yǎng)方式，前 7 d 通過肌內(nèi)注射硫酸慶大霉素 80000 U 防止傷口感染，每天強(qiáng)迫兔活動(dòng) 30 min，4周后即可獲得兔 KOA 模型。

1.4 給藥方法

造模 4周后開始給藥，根據(jù)兔與人用藥量用 Meeh Rubner 公式換算等效劑量，吉非替尼組兔給予 85 mg∕kg 灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，1 次∕天，連續(xù) 5周。

1.5 樣本采集及制備

停藥 1周后，于取樣前禁食10 h，耳緣靜脈注射空氣處死動(dòng)物后，在髕骨內(nèi)側(cè)做縱行切口，逐層分開直至關(guān)節(jié)囊，將關(guān)節(jié)處反復(fù)屈伸將關(guān)節(jié)液擠壓帶髕上囊內(nèi)側(cè)后，往里面注射生理鹽水反復(fù)抽吸后，將關(guān)節(jié)液盡量抽出后放置于試管中 ，低溫高速離心 15 min 后 ，留取上清 ，保存于-80 ℃超低溫冰箱中待測(cè)。同時(shí)剪開膝關(guān)節(jié)囊后，將股骨內(nèi)踝關(guān)節(jié)軟骨迅速取出并修成 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的組織塊，經(jīng)固定、脫鈣后，石蠟包埋，連續(xù)切成厚約 5 μm 的切片，用于病理變化檢查及 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.6 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察軟骨組織病理變化情況及 Mankin ′s 評(píng)分

將組織切片用二甲苯溶液浸泡 5 min，浸泡 2 次；后梯度乙醇水合，然后依次浸入蘇木素染液內(nèi)染色 3～5 min，水洗 30～60 s；酸水浸潤(rùn) 20 s，水洗 30～60 s；氨水中浸潤(rùn) 40 s，水洗 30～60 s；最后置于伊紅染液中染色 2 min，再洗去多余染液，濾紙吸干，迅速滴加適量中性樹膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察染色情況并分析。以 Mankin ′s 評(píng)分評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各組軟骨組織 HE 染色病理變化情況進(jìn)行分析。

1.7 TUNEL 染色觀察軟骨細(xì)胞凋亡情況

按照試劑盒說明要求，依次使用二甲苯和濃度梯度乙醇溶液清洗切片，用蛋白酶 K 溶液室溫處理 15 min，PBS清洗 4 次。10% 中性甲醛固定兩次，分別用乙醇乙酸和 3% 過氧化氫浸潤(rùn)，PBS 清洗后加入 TdT 酶緩沖溶液孵育 5 min；PBS 清洗后加入預(yù)熱的終止液，終止反應(yīng) 20 min，PBS 清洗 2 次，滴加過氧化酶標(biāo)記物抗體，孵育 20 min 后 PBS 清洗，加上二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液，顯色半小時(shí)用無水乙醇和二甲苯固定，晾干，熒光封片試劑封片。兩小時(shí)內(nèi)熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。凋亡率（%）=陽(yáng)性細(xì)胞∕總細(xì)胞×100%。

1.8 關(guān)節(jié)液中 TNF-α、IL-1β 水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)關(guān)節(jié)液中 TNF-α、IL-1β水平，由專業(yè)熟練人員嚴(yán)重按照試劑盒說明說進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 免疫組化檢測(cè)軟骨組織中 COL-Ⅱ、MMP-13陽(yáng)性表達(dá)情況

將石蠟切片脫水、PBS 溶液漂洗、3% 過氧化氫與甲醇混合液浸泡 10 min，超純水漂洗、抗原修復(fù)、PBS 漂洗 5 min、加入一抗 37 ℃反應(yīng) 2 h、PBS 漂洗 5 min、加入二抗 37 ℃反應(yīng) 40 min、PBS漂洗 5 min、DAB 室溫顯色 20～30 min，鏡檢觀察有棕黃色顆粒出現(xiàn)時(shí)則采用自來水終止。再用蘇木素復(fù)染 30 s、自來水漂洗、中性樹膠封片，光鏡下觀察細(xì)胞樣本中 COL-Ⅱ、MMP-13 的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為棕黃色顆粒。每張片子 400×視野 10 個(gè)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，以計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目∕總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)軟骨組織中 EGFR、P38MAPK 蛋白表達(dá)情況

提取各組兔軟骨組織中的總蛋白，采用 Bradford 調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、電轉(zhuǎn)膜至甲醛處理過預(yù)處理過的聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜），密封 2 h，加入 p-P38MAPK、P38MAPK、p-EGFR、EGFR、GAPDH 一抗（1∶500）4 ℃孵育過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）漂洗40 min，加入 HRP 標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育 1 h，TBST 漂洗 40 min，ECL 發(fā)光液顯色，暗室曝光到 X線片上，采用 Imaging System 軟件分析各組條帶灰度值，依據(jù)相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組病理觀察及 Mankin′s 評(píng)分情況

與假手術(shù)組相比，模型組關(guān)節(jié)軟骨層明顯變薄，并且有潰裂和裂隙情況存在，同時(shí)軟骨柱狀排列消失，結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重?fù)p壞，軟骨細(xì)胞明顯減少，與模型組相比，吉非替尼組軟骨病理?yè)p傷情況更嚴(yán)重 ，且三組Mankin′s 評(píng)分關(guān)系為假手術(shù)組＜模型組＜吉非替尼組（均

P

＜0.05）。見圖1、表1。

2.2 各組軟骨細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組，而模型組軟骨細(xì)胞凋亡率顯著低于吉非替尼組（均

P

＜0.05）。見表1。

2.3 各組關(guān)節(jié)液中 TNF-α、IL-1β 水平比較

假手術(shù)組兔關(guān)節(jié)液中 TNF-α、IL-1β 水平顯著低于模型組，而模型組兔關(guān)節(jié)液中 TNF-α、IL-1β 水平顯著低于吉非替尼組（均

P

＜0.05）。見表1。

2.4 各組中軟骨組織中 COL-Ⅱ、MMP-13 表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示：模型組中 COL-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于假手術(shù)組，而又顯著高于吉非替尼組（

P

＜0.05），模型組中 MMP-13 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于假手術(shù)組 ，而顯著低于吉非替尼組（

P

＜0.05）。見 圖2、表1。

圖1 各組新西蘭兔軟骨組織病理結(jié)果（HE染色×400） 圖2 各組新西蘭兔軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白（COL-Ⅱ）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色×400）

2.5 各組中 P38MAPK、EGFR 蛋白表達(dá)情況

Western blotting 結(jié)果顯示，吉非替尼組中 EGFR 蛋白磷酸化水平顯著低于模型組，模型組又顯著低于假手術(shù)組，同時(shí)吉非替尼組中 p38MAPK 蛋白磷酸化水平顯著高于模型組，模型組又顯著 高于假手術(shù)組（均

P

＜0.05）。見圖3、表1。

圖3 各組新西蘭兔中 P38MAPK、EGFR 蛋白表達(dá)條帶圖

3 討論

目前研究已經(jīng)證實(shí)，軟骨細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的降解都是導(dǎo)致 OA 軟骨降低的主要因素，而軟骨細(xì)胞的凋亡又發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。關(guān)節(jié)軟骨作為一種特殊的無血管且細(xì)胞數(shù)目較少的結(jié)締組織，其軟骨細(xì)胞軟轉(zhuǎn)換率較低，因此軟骨損傷后的自我修復(fù)能力較差，而大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，要想提高軟骨組織自我修復(fù)能力維持軟骨組織的完整性至關(guān)重要。軟骨細(xì)胞的更新及代謝過程極為復(fù)雜，由多種細(xì)胞因子參與，其中 EGF 信號(hào)通路能夠介導(dǎo)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，來調(diào)控軟骨細(xì)胞的生物學(xué)過程，在健康人群軟骨中可明顯看到磷酸化 EGFR 染色較強(qiáng)，且僅分布在軟骨表層，而隨著 OA 的進(jìn)程，磷酸化 EGFR 的染色顯著減少。本研究發(fā)現(xiàn)給予兔 KOA 模型吉非替尼處理，關(guān)節(jié)軟骨損傷情況進(jìn)一步惡化，提示磷酸化 EGFR水平減少后，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)械力學(xué)等明顯減弱，加速軟骨病理?xiàng)l件下的退變。袁功武等利用遺傳修飾小鼠和吉非替尼處理小鼠，均發(fā)現(xiàn)低 EGFR 活性的 OA 小鼠軟骨細(xì)胞破壞加重，OA 進(jìn)展更快，本研究與其基本一致。

細(xì)胞的凋亡是機(jī)體重要的自我保護(hù)機(jī)制，能夠避免細(xì)胞壞死后的內(nèi)容物損傷周圍組織，而一旦這個(gè)機(jī)制出現(xiàn)問題，就會(huì)誘發(fā)炎癥。TNF-α 作為一種重要的炎癥細(xì)胞因子，能夠通過級(jí)聯(lián)效應(yīng)加重炎癥反應(yīng)，還會(huì)加速軟骨基質(zhì)的降解，IL-1β 則是作為主要的效應(yīng)因子，直接作用于軟骨細(xì)胞，促進(jìn)前列腺素 E2 的釋放，誘發(fā)滑膜炎癥及骨吸收，同時(shí)前列腺素還會(huì)加速軟骨的分解，加重關(guān)節(jié)損傷。本研究結(jié)果顯示兔 KOA 模型吉非替尼處理后，軟骨細(xì)胞凋亡率顯著升高，同時(shí)關(guān)節(jié)液中 TNF-α、IL-1β 水平也顯著升高，提示我們吉非替尼可能是通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡及關(guān)節(jié)處炎癥反應(yīng)來加重軟骨退變。陳永健等研究顯示，兔 KOA 模型軟骨細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，并且血清 TNF-α、IL-1β 水平也顯著高于對(duì)照組，本研究與其一致。

表1 各組新西蘭兔關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞各指標(biāo)比較

軟骨基質(zhì)的降解也是誘發(fā) OA的重要因素 ，MMPs 蛋白通過特異性的裂解膠原分子，從而直接降解軟骨基質(zhì)，其中 MMP-13 可直接降解軟骨基質(zhì)中最具代表性且含量最高的 COL-Ⅱ，其他 MMPs 都需要經(jīng)過 MMP-13 來發(fā)揮作用 ，因此 MMP-13 和COL-Ⅱ的水平可作為反映軟骨退化情況的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，兔 KOA 模型吉非替尼處理后，COL-Ⅱ陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，而 MMP-13 表達(dá)率顯著升高，表明吉非替尼通過促進(jìn) MMP-13 表達(dá)，加速 COL-Ⅱ降解，從而加重軟骨損傷。有研究表示MMPs 的表達(dá)受多種信號(hào)通路調(diào)控，其中 p38MAPK發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，同時(shí) EGFR 信號(hào)途徑可以直接或間接的影響 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)軟骨組織中 EGFR、p38MAPK 蛋白表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)吉非替尼處理后，EGFR 磷酸化水平顯著降低，而 p38MAPK 磷酸化水平顯著升高，提示我們 低 EGFR 磷酸化水平 ，可能誘導(dǎo)p38MAPK 磷酸化 ，進(jìn)而激活下游信號(hào)因子MMP-13表達(dá) ，加速COL-Ⅱ的進(jìn)行性降解，證實(shí)了 Shu 等提出的 EGFR 可能作為 p38MAPK 信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。

綜上所述，吉非替尼作為一種特異性 EGFR 磷酸化抑制劑，可能通過抑制 EGFR 磷酸化，促進(jìn)下游p38MAPK 磷酸化 ，誘導(dǎo)MMP-13合成增加 ，加速COL-Ⅱ降解，同時(shí)還會(huì)提高關(guān)節(jié)處炎癥細(xì)胞因子水平，加重炎癥反應(yīng)，加速軟骨細(xì)胞凋亡。因此提高EGFR 磷酸化可以作為防治 OA 的一種新手段，但EGFR 具體的調(diào)控機(jī)制仍有待深入研究。