自噬在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞退變中表達(dá)的研究

王浩 陳群超 殷麗麗

【摘 要】目的：探究不同退變階段骨關(guān)節(jié)炎自噬因子ULK1、Beclin1和LC3B在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。方法：根據(jù)Kellgren-Lawrence影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集正常軟骨樣品，中期、晚期骨關(guān)節(jié)炎軟骨樣品;體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫組化染色用于鑒定軟骨細(xì)胞，運(yùn)用熒光定量PCR及WB技術(shù)分別從mRNA及蛋白水平檢測(cè)ULK1、Beclin1和LC3B的表達(dá)。結(jié)果：甲苯胺藍(lán)染色顯示，軟骨細(xì)胞核為深藍(lán)色，胞質(zhì)中有大量異色藍(lán)紫色顆粒。膠原蛋白的免疫熒光染色顯示，細(xì)胞外基質(zhì)為棕色，細(xì)胞核染為黃褐色。熒光定量PCR及WB結(jié)果顯示，正常軟骨細(xì)胞中ULK1、Beclin1、LC3B mRNA及蛋白水平穩(wěn)定表達(dá)，隨著骨關(guān)節(jié)炎程度加重，其表達(dá)量逐漸減少，細(xì)胞中表達(dá)量最低的是晚期骨關(guān)節(jié)炎組，3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：隨著骨關(guān)節(jié)炎的加重，軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)因子的表達(dá)降低。自噬是維持正常軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的保護(hù)機(jī)制，對(duì)調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展有重要的作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細(xì)胞;自噬;退變

Study on the Expression of Autophagy in Osteoarthritis Chondrocyte Degeneration

WANG Hao，CHEN qun-chao，YIN Li-li

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expressions of autophagy factors ULK1，Beclin1 and LC3B in chondrocytes of osteoarthritis at different stages of degeneration.Methods：According to the Kellgren-Lawrence imaging diagnostic criteria，normal cartilage samples，mid-term and late osteoarthritis cartilage samples were collected.Chondrocytes were isolated and cultured in vitro;toluidine blue and typeⅡ collagen immunohistochemical staining were used to identify chondrocytes;and the expressions of ULK1，Beclin1 and LC3B were detected by fluorescent quantitative PCR and WB Technology respectively from mRNA and protein levels.Results：Toluidine blue staining showed that the nucleus of cartilage was dark blue，and there were a large number of heterochromatic blue purple granules in the cytoplasm.Immunofluorescence staining of collagen showed that the extracellular matrix was brown and the nucleus was yellowish brown.The results of fluorescence quantitative PCR and WB showed that ULK1，Beclin1 and LC3B were stably expressed in normal chondrocytes at mRNA and protein levels.With the aggravation of osteoarthritis，the expression level gradually decreased.The lowest expression level was in the advanced osteoarthritis group，and the difference was statistically significant

（P < 0.05）.Conclusion：With the aggravation of osteoarthritis，the expression of autophagy related factors in chondrocytes decreased.Autophagy is a protective mechanism to maintain normal chondrocyte homeostasis，and plays an important role in regulating the development of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;chondroc-yte;autophagy;degeneration

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)生于50歲以上的中老年人，女性發(fā)病率高于男性。軟骨細(xì)胞的減少和軟骨基質(zhì)的降解是OA形成的主要病理變化，其中軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡起著重要的作用[1-2]。在OA的發(fā)展過程中，受損的細(xì)胞器和降解的大分子物質(zhì)逐漸積聚在軟骨細(xì)胞中，破壞了軟骨細(xì)胞的平衡，細(xì)胞合成、分解代謝失衡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能異常，生存能力下降，細(xì)胞外基質(zhì)合成能力下降，從而加速軟骨細(xì)胞的退變[3]。

自噬（Autophagy）是細(xì)胞自我降解并循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)組分的過程，在維持細(xì)胞環(huán)境平衡和提高細(xì)胞存活率方面發(fā)揮著重要作用[4]。許多疾病的發(fā)生和進(jìn)展都與自噬相關(guān)，它是自噬相關(guān)基因（Atg）參與介導(dǎo)的蛋白質(zhì)加工修飾過程，其中Atg1、Atg6、Atg8（哺乳動(dòng)物中的同源物分別稱作ULK1、Beclin1、LC3B）分別起到誘導(dǎo)者、調(diào)節(jié)者、執(zhí)行者的作用[5-6]。如果可以找到調(diào)控OA軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡的機(jī)制，維持軟骨細(xì)胞合成、分解代謝平衡，將對(duì)治療OA有重要意義。因此，本研究使用人膝OA軟骨細(xì)胞，探究自噬在OA軟骨細(xì)胞退變中的作用，能夠?yàn)椴捎盟幬镏委烵A提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 病例來源 根據(jù)Kellgren-Lawrence影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，從蘇州市立醫(yī)院手術(shù)室進(jìn)行膝關(guān)節(jié)截肢或置換術(shù)的患者中，取正常對(duì)照組5個(gè)軟骨樣品，中期、晚期OA組各10個(gè)軟骨樣品。本研究通過蘇州市立醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和授權(quán)，倫理審查編號(hào)為KL901126?；颊呔椴⒑炇鹜鈺?。

1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液、

Ⅱ型膠原酶（美國Hycolon公司）;TRIzol試劑、Taq PCR反應(yīng)試劑盒（中國大連寶生物公司）;dNTP Promega、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司）;抗ULK1（生產(chǎn)批號(hào)ab133747）、抗Beclin1（生產(chǎn)批號(hào)ab55878）、抗LC3B（生產(chǎn)批號(hào)ab48394，英國Abcam公司）。引物：自噬相關(guān)基因ULK1、Beclin1、LC3B及內(nèi)參β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

2 方 法

2.1 軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng) 從手術(shù)室獲取的標(biāo)本，用生理鹽水反復(fù)沖洗，轉(zhuǎn)移至盛有DMEM培養(yǎng)基的離心管中，在低溫條件下盡快轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將正常軟骨，中期、晚期OA軟骨標(biāo)本用組織剪盡量剪成小于1 mm3的小塊軟骨。在物理消化的基礎(chǔ)上，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化20 min，PBS溶液清洗后加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37 ℃水浴箱中輕微震蕩消化30～40 min，加入胎牛血清終止消化，離心機(jī)以1000 r·min-1離心5 min，離心半徑6 cm，棄上清，即得到消化后的軟骨細(xì)胞。將上述獲得的軟骨細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。

2.2 倒置顯微鏡下觀察并繪制生長曲線 倒置顯微鏡下觀察不同時(shí)期軟骨細(xì)胞的形態(tài)、黏附、生長特性和密度，MTT比色法繪制細(xì)胞生長曲線，監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖。

2.3 細(xì)胞爬片制作 將經(jīng)過處理后的蓋玻片放在6孔板中，以1×104·mL-1，每孔2 mL的密度在6孔板中接種第2代軟骨細(xì)胞，將其置于37 ℃的培養(yǎng)箱中，并以體積分?jǐn)?shù)5%的CO2進(jìn)行培養(yǎng);當(dāng)蓋玻片上軟骨細(xì)胞的融合率達(dá)到約80%時(shí)，用PBS溶液洗滌3次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定30 min，然后用雙蒸餾水洗滌3次。

2.4 軟骨細(xì)胞爬片甲苯胺藍(lán)染色 將細(xì)胞玻片放在染色架上，加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的甲苯胺藍(lán)染料溶液，并在室溫下染色30 min;用雙蒸水洗去多余的染料溶液;用水和無水乙醇梯度干燥，每次約2 min;安裝后使用中性樹膠，并使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察和記錄。

2.5 軟骨細(xì)胞爬片Ⅱ型膠原免疫組化染色 將細(xì)胞玻片放在染色架上，并與未接種的動(dòng)物血清在室溫下孵育10 min;使用1∶100的兔抗人Ⅱ型膠原蛋白抗體，4 ℃過夜;用PSB溶液加溫后在37 ℃沖洗45 min，加入滴滴標(biāo)記的二抗生物素，在室溫下孵育10 min;DAB顯色5～10 min，蘇木精染色2 min，鹽酸酒精辨別;用雙蒸餾水輕輕沖洗10～15 min;用無水乙醇和中性膠干燥，并用倒置顯微鏡觀察和捕獲圖像進(jìn)行記錄。

2.6 熒光定量PCR檢測(cè) 將細(xì)胞接種到板中的軟骨細(xì)胞中，通過三唑法從軟骨細(xì)胞中提取RNA，并通過DNA蛋白質(zhì)分析儀的凝膠電泳確定RNA的含量和純度，以及RNA片段的完整性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR試劑盒用于檢測(cè)人ULK1、Beclin1及LC3B mRNA，ACTB（β-actin）用作基因內(nèi)部參考。使用2-ΔΔCT方法分析相應(yīng)的基因表達(dá)，并為每個(gè)樣品定義3個(gè)重復(fù)樣品。引物序列見表1。

2.7 Western blot 檢測(cè) 使用預(yù)冷的軟骨細(xì)胞蛋白提取物進(jìn)行總蛋白提取;使用BCA方法確定蛋白質(zhì)濃度;SDS-PAGE電泳;確定作為目標(biāo)蛋白質(zhì)體積大小的轉(zhuǎn)移時(shí)間，轉(zhuǎn)移后迅速除去膜并在TBST溶液中洗滌3 min，然后將溶液封閉1 h;在室溫下將一抗孵育2 h，然后用TBST洗滌膜;將二抗孵育2 h，每次用TBST清洗膜10 min，共3次，然后添加ECL顯色溶液進(jìn)行曝光和顯影。使用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白質(zhì)范圍的灰度值，并使用內(nèi)部對(duì)照進(jìn)行半定量分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS V25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單向方差分析。成對(duì)比較通過SNK方法在多個(gè)組中進(jìn)行測(cè)試;如果方差是不規(guī)則的，或者組間的均值差異很小，則可以將Kruska l -Wallis

秩和檢驗(yàn)用于多個(gè)獨(dú)立樣本。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 原代軟骨細(xì)胞倒置相差顯微鏡觀察 在倒置相差顯微鏡下，可以觀察到原代正常軟骨細(xì)胞是球形的，大小均勻。培養(yǎng)8～12 h后，細(xì)胞開始黏附在壁上。附著后，軟骨細(xì)胞表現(xiàn)為短梭形。2～

3 d后，擴(kuò)展為多邊形。擴(kuò)散很明顯，可以看到成簇，并且在部分區(qū)域軟骨細(xì)胞呈集落生長。第1代細(xì)胞貼壁時(shí)間縮短，增殖速度加快，見圖1;第2代和第3代軟骨細(xì)胞的生長速度快于第1代，而第4代軟骨細(xì)胞生長緩慢。

3.2 軟骨細(xì)胞生長曲線 為了監(jiān)測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖，筆者使用MTT比色法繪制細(xì)胞生長曲線。第2代正常軟骨細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，增殖在前5 d緩慢，5～7 d加速，7～9 d顯著增加，9～11 d增殖趨緩。隨著傳代次數(shù)的增加，軟骨細(xì)胞增殖的頂點(diǎn)變得越來越少，速度越來越慢。見圖2。

3.3 軟骨細(xì)胞的鑒定 為了在體外鑒定分離的軟骨細(xì)胞，筆者在原代軟骨細(xì)胞切片上進(jìn)行了甲苯胺藍(lán)染色，并用免疫組化檢測(cè)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Ⅱ型膠原表達(dá)。

用甲苯胺藍(lán)將軟骨細(xì)胞染色，并在倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞核為深藍(lán)色，胞質(zhì)為藍(lán)紫色，可見1～

2個(gè)細(xì)胞核，染色陽性，見圖3;化學(xué)染色后的Ⅱ型

膠原免疫染色組，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜為黃棕色，染色較深，細(xì)胞核未染色，細(xì)胞核為黃褐色，在細(xì)胞周圍可見黃褐色顆粒，染色呈陽性表現(xiàn)，見圖4。

3.4 不同退變階段OA軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的表達(dá)變化 在正常軟骨細(xì)胞中，可以檢測(cè)到自噬相關(guān)基因ULK1、Beclin1及LC3B穩(wěn)定表達(dá)，隨著OA程度加重，其表達(dá)量逐漸降低，表達(dá)量最低的是晚期OA組軟骨細(xì)胞，3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3.5 不同退變階段OA軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的進(jìn)一步變化，結(jié)果見圖5。檢測(cè)正常軟骨細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因ULK1、Beclin1及LC3B穩(wěn)定表達(dá)，隨OA程度加重，其表達(dá)量逐漸減少，其中，表達(dá)量最低的是晚期OA組軟骨細(xì)胞，3組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

4 討 論

OA是一種退行性疾病，會(huì)導(dǎo)致軟骨、軟骨下骨和滑膜乃至整個(gè)關(guān)節(jié)軟骨退行性改變。關(guān)節(jié)軟骨由少量的軟骨細(xì)胞和豐富的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成。在維持代謝穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性中，軟骨細(xì)胞的正常功能狀態(tài)起著重要作用[8];因此，軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨的發(fā)育形成、退變中扮演著重要角色。

自噬可以不斷降解細(xì)胞器和破壞大分子物質(zhì)，這是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。自噬在軟骨細(xì)胞的成熟和穩(wěn)態(tài)中也起著重要作用。

本研究中，定量熒光PCR和Western blot技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平揭示了與自噬相關(guān)因子的定量表達(dá)及其與OA的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，與自噬相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)在正常軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，隨著OA的進(jìn)展，其表達(dá)量逐漸降低，提示自噬能夠維持正常軟骨細(xì)胞代謝平衡，是正常軟骨細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。當(dāng)軟骨細(xì)胞受損時(shí)，自噬作用被抑制，進(jìn)一步加速了OA的進(jìn)程。與CARAM?S等[9-10]研究結(jié)果一致。

SASAKI等[11]報(bào)道，與正常軟骨細(xì)胞相比，早期OA軟骨細(xì)胞中Beclin1、LC3B mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，而晚期OA軟骨中，Beclin1、LC3B mRNA及蛋白表達(dá)則下調(diào)。根據(jù)上述研究結(jié)果，筆者推測(cè)，在OA早期，自噬作為恢復(fù)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的最初嘗試，為了保護(hù)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡，其表達(dá)將增加。如果高強(qiáng)度破壞性因子繼續(xù)影響軟骨細(xì)胞，自噬不堪重負(fù)，自噬活性下降，凋亡活動(dòng)增強(qiáng)。因此，在晚期OA軟骨中，自噬活性下降。此外，SASAKI等[11]用一氧化氮、白細(xì)胞介素-1刺激軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞自噬表達(dá)增強(qiáng)，這也驗(yàn)證了筆者的假設(shè)，進(jìn)一步說明至少在軟骨細(xì)胞退變的初始階段，自噬表達(dá)增強(qiáng)。

本研究針對(duì)不同退變階段OA軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)因子的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)自噬在OA軟骨及軟骨細(xì)胞退變過程中具有重要的調(diào)控作用。在OA引起的各種病理學(xué)因素的刺激下，軟骨細(xì)胞首先反應(yīng)性上調(diào)自噬相關(guān)因子，促進(jìn)軟骨細(xì)胞生存。但是，隨著損傷性因素的持續(xù)存在以及不斷增強(qiáng)，自噬水平降低，并導(dǎo)致軟骨內(nèi)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致OA的發(fā)生、進(jìn)展。

參考文獻(xiàn)

[1] HUNTER DJ，BIERMA-ZEINSTRA S.Osteoarthri-tis[J].Lancet，2019，393（10182）：1745-1759.

[2] GR?SSEL S，MUSCHTER D.Recent advances in the treatment of osteoarthritis[J].Res，2020，9（1）：325.

[3] KRAUS VB，KARSDAL MA.Osteoarthritis：current molecular biomarkers and the way forward[J].Calcif Tissue Int，2020，4（1）：1-5.

[4] CAVALLI G，CENCI S.Autophagy and protein secre-tion[J].J Mol Biol，2020，432（8）：2525-2545.

[5] YANG Y，KLIONSKY DJ.Autophagy and disease：

unanswered questions[J].Cell Death Differ，2020，27（3）：858-871.[6] CARAM?S B，TANIGUCHI N，OTSUKI S，et al.

Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage，and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2010，62（3）：791-801.

[7] KELLGREN JH，LAWRENCE JS.Radiological assessment of osteoarthrosis[J].Ann Rheum Dis，1957，16（4）：494-502.

[8] HE Y，WU Z，XU L，et al.The role of SIRT3-mediated mitochondrial homeostasis in osteoarthritis[J].Cell Mol Life Sci，2020，77（19）：3729-3743.

[9] CARAM?S B，TANIGUCHI N，SEINO D，et al.Mechanical injury suppresses autophagy regulators and pharmacologic activation of autophagy results in chondroprotection[J].Arthritis Rheum，2012，64（4）：1182-1192.

[10] LOTZ MK，CARAM?S B.Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health，aging and OA[J].Nat Rev Rheumatol，2011，7（10）：579-587.

[11] SASAKI H，TAKAYAMA K，MATSUSHITA T，et al.Autophagy modulates osteoarthritis-related gene expression in human chondrocytes[J].Arthritis Rheum，2012，64（6）：1920-1928.

收稿日期：2020-12-03;修回日期：2021-01-19