PTD4-Cu,Zn-SOD原核重組表達(dá)載體優(yōu)化及蛋白表達(dá)

程艷，萬(wàn)婷婷，薛榮亮

·論著·

PTD4-Cu,Zn-SOD原核重組表達(dá)載體優(yōu)化及蛋白表達(dá)

程艷，萬(wàn)婷婷，薛榮亮

710068 西安，陜西省人民醫(yī)院麻醉科（程艷）；710100 西安，西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院麻醉與舒適化醫(yī)療中心（薛榮亮）；100191 北京，北京大學(xué)第三醫(yī)院麻醉科（萬(wàn)婷婷）

優(yōu)化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重組表達(dá)載體以增加 SOD 融合蛋白表達(dá)。通過(guò)基因工程設(shè)計(jì)引物并優(yōu)化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重組表達(dá)載體，擴(kuò)增并鑒定目的基因，將優(yōu)化后的原核重組表達(dá)載體以熱激法轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) 中，通過(guò) IPTG 誘導(dǎo)重組載體進(jìn)行蛋白表達(dá)，通過(guò)溶菌酶 + 超聲裂解菌體，離心后收集上清，利用 Ni-NTA 樹(shù)脂純化，10 kD，20 kD 透析袋濃縮，以獲得 SOD 融合蛋白。利用 SDS-PAGE 凝膠電泳及 Western blot 鑒定 SOD 融合蛋白。采用 BCA 與黃嘌呤氧化酶法測(cè)定 SOD 融合蛋白濃度及活力。優(yōu)化后的重組表達(dá)載體優(yōu)化了稀有堿基，增加了 His·Tag 標(biāo)簽，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作為一個(gè)整體，在I 與H I 限制性內(nèi)切酶作用下定向插入，構(gòu)建了長(zhǎng)度為 6213 bp 的優(yōu)化質(zhì)粒，基因測(cè)序結(jié)果與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列對(duì)比顯示堿基序列正確。優(yōu)化后的 SOD 融合蛋白表達(dá)量約占菌體的 32%，較前（20%）提高，純化濃縮后純度為 94%，較前（90%）增加。測(cè)定濃度為 1.8 mg/ml，37 ℃時(shí) SOD 總活力為（3065.137 ± 19.75）U/mg prot。通過(guò)重組表達(dá)載體密碼子優(yōu)化，可以獲得高產(chǎn)量、高活性的 SOD 融合蛋白。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域； 超氧化物歧化酶； 質(zhì)粒

過(guò)氧化反應(yīng)與多種神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切，其產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是造成神經(jīng)元死亡的主要原因。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是針對(duì) ROS 的主要抗氧化劑防御系統(tǒng)，但其分子量大且無(wú)特異性受體，難以穿過(guò)血腦屏障及細(xì)胞膜進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（protein transduction domain，PTD）是一個(gè)以肽為載體的能夠有效運(yùn)輸各種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞和細(xì)胞核的系統(tǒng)，能夠把生理狀態(tài)下不能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物效應(yīng)的物質(zhì)帶入細(xì)胞的載體工具[1]。PTD-4 結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有雙親性，因而具有高效且快速的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力[2]。

大腸桿菌原核表達(dá)體系是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，近幾十年，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也得到不斷發(fā)展和完善，被科研及工業(yè)用戶大量用于各種重組蛋白表達(dá)。與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，具有目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)、成本相對(duì)低等特點(diǎn)[3]。本課題組前期已成功構(gòu)建 PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重組表達(dá)載體[4]，并成功制備 PTD4-Cu,Zn-SOD 融合蛋白（簡(jiǎn)稱 SOD 融合蛋白）[5]。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在充分考慮大腸桿菌（BL21(DE3)）的密碼子偏好的基礎(chǔ)上，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，在不改變氨基酸的前提下，替換了原序列中的稀有密碼子（AGG，AGA）以及低利用率密碼子，選擇大腸桿菌高偏好性的密碼子，對(duì) pET16b-PTD4-Cu, Zn-SOD 基因序列進(jìn)行了優(yōu)化，以期更加穩(wěn)定地增加 SOD 融合蛋白的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

BL21(DE3) 購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；PTD4-Cu,Zn-SOD 基因序列由薛榮亮課題組提供；pET16b 質(zhì)粒、pBluescript II SK-Cu, Zn-SOD 購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；KOD plus DNA polymerase 購(gòu)自日本 Toyobo 公司；DNA 連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶H I、I、T4DNA 連接酶購(gòu)自日本 Takara 公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；西班牙瓊脂糖、考馬斯亮藍(lán)染液、LB 固培養(yǎng)基、BCA 試劑盒購(gòu)自西安赫特生物科技有限公司；His Tag 單克隆抗體、山羊抗小鼠 IgG 二抗-HRP 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記購(gòu)自美國(guó) Earthox 公司；IPTG購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；Bio-Rad 蛋白預(yù)染 marker 購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；HisPurTMNi-NTA Spin Columns 購(gòu)自美國(guó) Thermo Scientific；SDS-PAGE 試劑盒購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司；SOD 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及優(yōu)化 上游引物：5' ACCATGG GTCACCACCACCATCATCACCATCATCACCACTCTTCTGGTCACATCGAAGGTCGTCACATGCTGGAAATGTACGCTCGTGCTGCTGCTCGTCAGGCTCGTGCTATGGCTACCAAAGCTGTTTGCGTTCTGAAAGGTGAtGGcCCaGTTCAGGGTATCATCAACTTCGAACAGAAAGAATCTAACGGTCCGGTTAAAGTTTGGGGTTCTATCAAAGGTCTGACCGAAGGTCTGCACGGTTTCCACGTTCACGAATTCGGTGACAACACCGCTGGTTGCACCTCTGCTGGTCCGCACTTCAACCCGCTGTCTCGTAAACACGGTGGTCCGAAAGACGAAGAACGTCACGTTGGTGACCTGGGcAACGTTACCGCTGACAAAGACGGTGTTGCTGACGTTTCTATCGAAGACTCTGTTATCTCTCTGTCTGGTGACCACTGCATCATCGGTCGTACCCTGGTTGTTCACGAAAAAGCTGACGACCTGGGTAAAGGTGGTAACGAAGAATCTACCAAAACCGGTAACGCTGGTTCTCGTCTGGCTTGCGGTGTTATCGGTATCGCTCAGtaa 3'；下游引物：5' GCCGGATCCTTACTGAGCGATACCGATAACACCGCAAGCCAGACGAGAACCAGCGTTACCGGTTTTGGTAGATTCTTCGTTACCACCTTTACCCAGGTCGTCAGCTTTTTCGTGAACAACCAGGGTACGACCGATGATGCAGTGGTCACCAGACAGAGAGATAACAGAGTCTTCGATAGAAACGTCAGCAACACCGTCTTTGTCAGCGGTAACGTTGCCCAGGTCACCAACGTGACGTTCTTCGTCTTTCGGACCACCGTGTTTACGAGACAGCGGGTTGAAGTGCGGACCAGCAGAGGTGCAACCAGCGGTGTTGTCACCGAATTCGTGAACGTGGAAACCGTGCAGACCTTCGGTCAGACCTTTGATAGAACCCCAAACTTTAACCGGACCGTTAGATTCTTTCTGTTCGAAGTTGATGATACCCTGAACTGGGCCATCACCTTTCAGAACGCAAACAGCTTTGGTAGCCATAGCACGAGCCTGACGAGCAGCAGCACGAGCGTACATTTCCAGCATGTGACGACCTTCGATGTGACCAGAAGAGTGGTGATGATGGTGATGATGGTGGTGGTG 3'。整個(gè)引物序列的主體部分由 His·tag + PTD4 + Cu,Zn-SOD 序列構(gòu)成，小寫(xiě)部分為未優(yōu)化序列。在上游引物的 5'端加有限制性內(nèi)切酶I 位點(diǎn)，即 CCATGG，下游引物的 5'端加有限制性內(nèi)切酶H I 位點(diǎn)，即 GGATCC。ATG 為起始密碼子，隱藏在限制性內(nèi)切酶I 序列中，taa 為終止密碼子。本研究只針對(duì)堿基序列進(jìn)行了優(yōu)化，氨基酸的表達(dá)并未改變，理論上與原堿基序列表達(dá)的蛋白無(wú)差異。上述引物由西安醫(yī)智信生物科技有限公司合成。

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及鑒定 PCR 反應(yīng)體系共 20 μl：目的基因上游引物（10 μmol/L）1 μl，目的基因下游引物（10 μmol/L）1 μl，KOD DNA polymerase 0.5 μl，10 × PCR buffer 2 μl，dNTP 2 μl，pBluescript II SK-Cu,Zn-SOD 模板 1 μl，MgSO42 μl，ddH2O 11.5 μl。目的基因擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 1 個(gè)循環(huán)（3 min），94 ℃變性（30 s）、58 ℃退火（30 s）、68 ℃延伸（30 s）30 個(gè)循環(huán)，68 ℃延伸 1 個(gè)循環(huán)（5 min），完成目的基因擴(kuò)增。雙酶切反應(yīng)，目的基因酶切體系共 30 μl：目的基因20 μl，H I 1 μl，I 1 μl，10 × K buffer 3 μl，ddH2O 5 μl，37 ℃水浴 4 h。pET16b 酶切體系共 30 μl：pET16b 2 μl，H I 1 μl，I 1 μl，10 × K buffer 3 μl，ddH2O 23 μl，37 ℃水浴 4 h。使用 T4 DNA 連接酶合成重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系共 10 μl：目的基因（I/H I）5 μl，pET16b（I/H I）3 μl，10 × T4 DNA ligase buffer 1 μl，T4 DNA ligase 1 μl，PCR 儀中室溫反應(yīng) 2 h，4 ℃冰箱過(guò)夜。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.3 SOD 融合蛋白重組載體表達(dá) 將 1 μl 重組載體加入 100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴 30 min，42 ℃水浴熱激 60 s，冰浴 2 min 后，向離心管中加入 500 μl 的 LB 液體培養(yǎng)基（不含 Amp），放置 37 ℃搖床 200 r/min 振蕩 60 min，表達(dá)質(zhì)粒中攜帶的抗生素抗性基因（Ampr）。將復(fù)蘇好的菌液于 4000 r/min 離心振蕩 5 min，棄掉上清 500 μl，保留底部的懸浮細(xì)胞 100 μl。吸取合適體積的菌液，均勻涂布于含有 Amp 的 LB 固體培養(yǎng)基上，隨后將其置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，正面朝上放置 2 h 使菌液完全吸干，隨后倒置培養(yǎng)皿，再置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，直至生長(zhǎng)出明顯菌落（約 16 h）。最后將培養(yǎng)皿放置于 4 ℃冰箱中，篩選表達(dá)抗生素抗性基因的菌落。挑取 1 個(gè)生長(zhǎng)良好的單菌落，接種到 5 ml 含 Amp 的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃恒溫?fù)u床上以 200 r/min 振蕩培養(yǎng)，直至到達(dá)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約 16 h），即600為 0.6 ～ 0.8。在含有菌液的凍存管中加入 20% 的甘油，于–80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.4 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá) 取–80 ℃下保存的菌落 30 μl 接種到 3 ml 含 Amp 的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃恒溫?fù)u床上以 200 r/min 過(guò)夜振蕩培養(yǎng)，直至到達(dá)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將培養(yǎng)好的菌液于 4 ℃條件下，以 8000 r/min 的速度離心 10 min，棄掉上清，用 5 ml 含 Amp 的 LB 液體培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，在 37 ℃恒溫?fù)u床上以 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 2 ～ 4 h，直至到達(dá)細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。于菌液中加入 IPTG 至終濃度為 0.84 mmol/L，在 37 ℃恒溫?fù)u床上以 200 r/min 振蕩培養(yǎng) 4 h 以誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后，準(zhǔn)確測(cè)定600值。在 4 ℃條件下，以 8000 r/min 離心 10 min 并收集菌體。

1.2.5 裂解細(xì)胞，提取融合蛋白 以菌液:溶菌酶結(jié)合緩沖液（冰浴的）= 20:1 的比例混和后，加入 PMSF（蛋白酶抑制劑）至終濃度為 1 mmol/L。以菌液:核酸酶（2 U/μl）= 10:1的比例加入相應(yīng)單位的核酸酶。于冰上放置 30 min 后，使用超聲裂解儀裂解細(xì)菌。具體方法為：裂解儀設(shè)置能量為 200 W，工作時(shí)間為裂解 1 s 停 1 s，循環(huán)為50 s，在 4 ℃條件下，將超聲探頭伸至菌液液面下約 0.5 cm 裂解細(xì)菌一個(gè)循環(huán)。將裂解后的菌液于 4 ℃，以 12 000 r/min 離心 10 min 后收集上清，于–20 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2.6 純化融合蛋白 用適量的 Ni-NTA 樹(shù)脂填充柱，允許存儲(chǔ)緩沖液通過(guò)重力流動(dòng)從樹(shù)脂中排出。通過(guò)將蛋白質(zhì)提取物與等體積的平衡緩沖液混合來(lái)制備樣品。用兩個(gè)樹(shù)脂床體積的平衡緩沖液平衡柱子，允許緩沖液從色譜柱中排出。將制備的蛋白質(zhì)提取物加入樹(shù)脂中，收集流出液，標(biāo)注為流出物。用兩個(gè)樹(shù)脂床體積的洗滌緩沖液洗滌樹(shù)脂，重復(fù)此步驟，直至 280 nm 處的流過(guò)部分的吸光度接近基線。用兩個(gè)樹(shù)脂床體積的洗脫緩沖液從樹(shù)脂中洗去帶 His 標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。重復(fù)這個(gè)步驟兩次，每個(gè)部分在一個(gè)單獨(dú)的管中，分別標(biāo)注為洗脫 1 及洗脫 2。通過(guò)測(cè)量 280 nm 處級(jí)分的吸光度監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)洗脫。將收集的洗脫液依次加入 20 kD 及 10 kD 透析袋中進(jìn)行透析濃縮，收集透析液。

1.2.7 SOD 融合蛋白鑒定 將上述所獲得的上清液及純化蛋白以體積比 4:1 加入 5 × SDSloading buffer，100 ℃煮 5 min，冷卻離心后進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳，部分凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，部分凝膠應(yīng)用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶進(jìn)行封閉 2 h，用 TBST 緩沖液將 His Tag 抗體以 1:1000 的體積比進(jìn)行稀釋，室溫下孵育 PVDF 膜 1 h 后，4 ℃搖床過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜 15 min × 3次，TBST 按 1:30000 稀釋的二抗（羊抗鼠），室溫孵育 2 h，TBST 緩沖液洗膜 15 min × 3次，暗室曝光、定影、顯影及掃描膠片，采用Image J 進(jìn)行圖像處理，反映目的蛋白的表達(dá)。

1.2.8 SOD 融合蛋白濃度及活性測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)應(yīng)用 BCA 法測(cè)定 SOD 融合蛋白濃度，應(yīng)用 SOD 試劑盒檢測(cè) SOD 活性。

2 結(jié)果

2.1 SOD 融合蛋白原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶I、I 和I、HI 兩次雙酶切后，將 PTD4 與Cu,Zn-SOD 基因片段定向插入，成功構(gòu)建了 PTD4-Cu,Zn-SOD 質(zhì)粒，其長(zhǎng)度為 6207 bp（圖1A）。優(yōu)化后的 SOD 融合蛋白質(zhì)粒如圖1B 所示，PTD4 序列前的I與I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)消失，最近的雙切酶位點(diǎn)為I 與H I 位點(diǎn)?？寺?表達(dá)區(qū)域內(nèi)，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作為一個(gè)整體，在I 與HI 限制性內(nèi)切酶作用下定向插入，構(gòu)建了長(zhǎng)度為 6213 bp 的優(yōu)化質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列對(duì)比，顯示堿基序列正確。

2.2 SOD 融合蛋白重組質(zhì)粒的基因序列

如圖2 所示，陰影部分為定向插入的 His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD DNA 序列。

2.3 裂解菌液中 SOD 融合蛋白表達(dá)鑒定

如圖3 所示，菌體裂解離心后上清液中有大量的目的蛋白表達(dá)，在最佳溫度（37 ℃）及 IPTG 最佳誘導(dǎo)濃度（0.84 mmol/L）下，灰度掃描分析顯示，表達(dá)量約占菌體總蛋白的 32%。未優(yōu)化表達(dá)載體上清液中的目的蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的 20%[5]。

2.4 純化SOD 融合蛋白表達(dá)鑒定

通過(guò) SOD-PAGE 電泳、考馬斯亮藍(lán)染色鑒定 SOD 融合蛋白表達(dá)情況如圖4 所示，Western blot 鑒定 SOD 融合蛋白結(jié)果如圖5所示，結(jié)果提示，通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)步驟，優(yōu)化后的質(zhì)粒能夠表達(dá) SOD 融合蛋白，分子量為 20 kD 左右，無(wú)明顯雜帶，灰度掃描分析顯示純度為 94%，證明蛋白純化效果良好。未優(yōu)化表達(dá)載體目的蛋白表達(dá)，灰度掃描顯示純度為 90%[5]。

圖1 pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD 與 SOD 融合蛋白原核重組表達(dá)載體構(gòu)建圖[A：pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD 質(zhì)粒；B：SOD 融合蛋白質(zhì)粒圖（優(yōu)化后）]

Figure 1 Construction of recombinant expression vector of pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD and SOD fusion protein [A: pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD plasmid; B: SOD fusion protein plasmid(optimized)]

圖2 SOD 融合蛋白原核重組表達(dá)載體基因序列（陰影部分為定向插入的 His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD DNA 序列）

Figure 2 Gene sequence of SOD fusion protein prokaryotic recombinant expression vector (The shaded part is the His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD DNA sequence inserted in the direction)

1：Marker（5 μl）；2 ～ 4：上清液（37 ℃，IPTG 終濃度 0.1、0.5、0.84 mmol/L，10 μl）；5 ～ 7：上清液（28 ℃，IPTG 終濃度 0.1、0.5、0.84 mmol/L，10 μl）；8 ～ 10：上清液（16 ℃，IPTG 終濃度 0.1、0.5、0.84 mmol/L，10 μl）

1: Marker (5 μl); 2 - 4: supernatant (37 ℃, IPTG final concentration 0.1, 0.5, 0.84 mmol/L, 10 μl); 5 - 7: supernatant (28 ℃, IPTG final concentration 0.1, 0.5, 0.84 mmol/L, 10 μl); 8 - 10: supernatant (16 ℃, IPTG final concentration 0.1, 0.5, 0.84 mmol/L, 10 μl)

圖3 不同溫度及 IPTG 不同誘導(dǎo)條件下，SOD 融合蛋白的分布

Figure 3 Distribution of SOD fusion protein under different temperature and IPTG induction conditions

1、6：Marker（8 μl）；2 ～ 3：洗脫液 1（10 μl）；4 ～ 5：洗脫液 2（10 μl）

1, 6: Marker (8 μl); 2 - 3: Eluted protein 1 (10 μl); 4 - 5: Eluted protein 2(10 μl)

圖4 SOD 融合蛋白表達(dá)鑒定

Figure 4 Expression identification of SOD fusion protein

2.5 SOD 融合蛋白濃度及活力檢測(cè)

BCA 法測(cè)定 SOD 融合蛋白濃度為 1.8 mg/ml，SOD 試劑盒檢測(cè) SOD 融合蛋白在 37 ℃時(shí) SOD總活力為（3065.137 ± 19.75）U/mg prot。而未優(yōu)化表達(dá)載體，目標(biāo)蛋白濃度為 0.7 mg/ml，37 ℃時(shí) SOD 總活力為（1125.888 ± 15.65）U/mg prot。

3 討論

重組蛋白表達(dá)的過(guò)程包括將合適的互補(bǔ) DNA（cDNA）序列插入表達(dá)載體（如質(zhì)粒）中，然后通過(guò)轉(zhuǎn)染、熱激等方法將構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)錄出翻譯編碼靶蛋白的mRNA，并在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)大量的目的蛋白。在宿主細(xì)胞選擇方面，大腸桿菌以快速生長(zhǎng)、高效接收外源 DNA 和高速率表達(dá)重組蛋白的特點(diǎn)，成為蛋白質(zhì)生產(chǎn)的優(yōu)選宿主[6]。本課題組前期利用 PTD4 肽高效的穿膜性，且能保證 SOD 活性的特點(diǎn)，采用 PTD4 與Cu,Zn-SOD 結(jié)合，以 pET16b 質(zhì)粒為表達(dá)載體，運(yùn)用基因工程成功獲得了pET16b-PTD4-Cu, Zn-SOD 重組質(zhì)粒[4]，并以BL21(DE3) 為宿主，利用蛋白純化技術(shù)獲得 PTD4-Cu,Zn-SOD 融合蛋白[5]，并成功將體外表達(dá)的Cu,Zn-SOD 遞送入體外培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞中[7]，克服了普通 SOD 穿膜困難的缺點(diǎn)。

由于每一種宿主都有自己的密碼子偏好，使用宿主偏好的密碼子有助于提高蛋白質(zhì)表達(dá)的效率和準(zhǔn)確性[8]，為了增加蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，密碼子優(yōu)化策略被廣泛應(yīng)用。密碼子優(yōu)化是指通過(guò)改變基因的密碼子，克服與密碼子使用相關(guān)的表達(dá)限制來(lái)使蛋白質(zhì)表達(dá)最大化的方法。自然界的生物共用一套密碼子，除 3 個(gè)終止密碼子，余 61 個(gè)密碼子可以編碼出 20 種氨基酸，這表明大多數(shù)氨基酸由一個(gè)以上的同義密碼子編碼[9]，即不同的密碼子可以編碼同一種氨基酸，因此這種方法是可行的。密碼子優(yōu)化策略能夠成功提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平的關(guān)鍵原因有：稀有密碼子對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有限速作用、同義密碼子可互換而不影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能以及通過(guò)用常用的密碼子代替稀有密碼子可以增加蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[10]。據(jù)報(bào)道，密碼子優(yōu)化可以使蛋白質(zhì)表達(dá)增加 1000 倍[11]。前期的pET16b-PTD4- Cu,Zn-SOD 融合蛋白的Cu,Zn-SOD 序列來(lái)源于人，而宿主為大腸桿菌。在這種異源條件下，宿主細(xì)胞的環(huán)境完全不同，由于密碼子偏好問(wèn)題，導(dǎo)致宿主被迫表達(dá)其不具有豐富轉(zhuǎn)運(yùn) RNA（tRNA）的目的蛋白，這也是對(duì)于不同來(lái)源的重組基因不能高水平表達(dá)的一個(gè)重要原因[12]。此次設(shè)計(jì)引物的序列末端帶有 TAA，在I酶切位點(diǎn)插入后，可以保證蛋白的 N 端不會(huì)有多余的堿基序列，在I 酶切位點(diǎn)插入，His·Tag 前有 ATG，在使 SOD 融合蛋白載體上所帶的His·Tag 表達(dá)的同時(shí)，沒(méi)有增加多余的氨基酸，可達(dá)到純化蛋白的目的。

圖5 Western blot 鑒定（蛋白上樣量均為 10 μl）

Figure 5 SOD fusion protein identification by Western blot (The amount of protein is 10 μl)

本實(shí)驗(yàn)充分考慮了物種密碼子的使用偏差，根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性，采用大腸桿菌常用密碼子并替換稀有密碼子，優(yōu)化 PTD4-Cu,Zn-SOD 堿基序列。本研究只針對(duì)堿基序列進(jìn)行了優(yōu)化，氨基酸的表達(dá)并未改變，且在表達(dá)載體中加入新的標(biāo)簽蛋白片段，可達(dá)到純化蛋白的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的重組表達(dá)載體基因測(cè)序結(jié)果與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列對(duì)比，顯示堿基序列正確。大腸桿菌菌體裂解離心后上清液中有大量的目的蛋白表達(dá)，在最佳溫度（37 ℃）及 IPTG 最佳誘導(dǎo)濃度（0.84 mmol/L）下，灰度掃描分析顯示，表達(dá)量約占菌體總蛋白的 32%，遠(yuǎn)高于前期實(shí)驗(yàn)上清液中 SOD 融合蛋白表達(dá)量（20%）。SOD-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色及Western blot 鑒定 SOD 融合蛋白結(jié)果提示，優(yōu)化后的質(zhì)粒能夠表達(dá) SOD 融合蛋白，分子量為 20 kD 左右，灰度分析顯示純度為 94%，無(wú)明顯雜帶，蛋白純化效果良好，且明顯高于前期實(shí)驗(yàn)中蛋白純度（90%）。BCA 法測(cè)定 SOD 融合蛋白濃度為 1.8 mg/ml，SOD 試劑盒檢測(cè) SOD 融合蛋白在 37 ℃時(shí) SOD 總活力為（3065.137 ± 19.75）U/mg prot，遠(yuǎn)高于前期實(shí)驗(yàn)中目的蛋白濃度（0.7 mg/ml）及活性（1125.888 ± 15.65）U/mg prot，均提示本實(shí)驗(yàn)合成的 SOD 融合蛋白具有高水平的濃度和活力，可為后期的抗氧化治療提供可能的途徑。

綜上所述，通過(guò)重組表達(dá)載體密碼子優(yōu)化，可以獲得高產(chǎn)量、高活性的 SOD 融合蛋白。

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Optimization of PTD4-Cu,Zn-SOD protein recombinant expression vector and protein expression

CHENG Yan, WAN Ting-ting, XUE Rong-liang

Author Affiliations: Department of Anesthesiology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi'an 710068, China (CHENG Yan); Anesthesia & Comfort Health Center, Xi’an International Medical Center Hospital, Shaanxi 710100, China (XUE Rong-liang); Department of Anesthesiology, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China (WAN Ting-ting)

Optimization of PTD4-Cu,Zn-SOD protein recombinant expression vector to increase PTD4-Cu,Zn-SOD protein expression.PTD4-Cu,Zn-SOD prokaryotic recombinant expression vector were optimized and amplified, and the target genes were identified through designing primers and genetic engineering. The optimized vector was transformed intoBL21(DE3) by heat shock method and induced to express the protein by IPTG. After theBL21(DE3) cells were cracked by lysozyme & ultrasound, the supernatant was collected after centrifugation, and purified with Ni-NTA resin, followed by concentration with 10 kD and 20 kD dialysis bags to obtain the PTD4-Cu,Zn-SOD proteins. SDS-PAGE gel electrophoresis and Western blot were used to identify the protein. The concentration and vitality of PTD4-Cu,Zn-SOD proteins were determined by BCA and xanthine oxidase method.The rare bases in recombinant expression vector were optimized, and His-tag was added. The His-PTD4-Cu-SOD and His-PTD4-Zn-SOD sequence were inserted as a whole into the restriction site ofI andH I enzymes for construction. Theoptimized plasmid has a length of 6213 bp, and the base sequence was correct by gene sequencing. Optimized PTD4-Cu,Zn-SOD protein expression accounted for about 32% of the content in bacterial cells, which was higher than the original one (20%); and the protein purity after purification and concentration was 94%, which was higher than the original protein (90%). The concentration was 1.8 mg/ml, and total SOD activity at 37 ℃ was (3065.137 ± 19.75) U/mg protein.High yield and activity PTD4-Cu,Zn-SOD protein can be obtained through optimization of recombinant expression vector.

protein domain; superoxide dismutase; plasmid

XUE Rong-liang, Email: xuerl299@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金（81471131）

薛榮亮，Email：xuerl299@163.com

2020-12-15

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.004