蟲草素的抗腫瘤與抗轉(zhuǎn)移作用的研究進(jìn)展

崔琳琳,袁 甜,王 洋,李 洋,申光煥

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076; 2.黑龍江省預(yù)防與治療老年病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

蟲草素最早于1951年被德國科學(xué)家Cunningham等人[1]從蛹蟲草發(fā)酵菌絲體的培養(yǎng)液分離得到,是由腺苷和脫氧戊糖組成的核苷酸[2],為腺苷類似物(圖1),亦被稱為3′-脫氧核苷(3-deoxyadenosine)。具有抑制mRNA聚腺苷酸化,調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程,抗癌、抗炎、抗氧化劑、抗白血病、抗高血脂、抗肝毒性、抗纖維化和神經(jīng)保護(hù)活性,改善皮膚老化,骨骼肌疲勞抑制,殺蟲,防止缺血再灌注引起的損傷和骨骼保護(hù)等藥理作用。近年來文獻(xiàn)多集中在構(gòu)建蟲草素納米復(fù)合材料[3]、腺苷酸脫氨酶(ADA)抑制劑聯(lián)用來改善蟲草素在體內(nèi)半衰期短的問題。

蟲草素抗腫瘤涉及到苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、核因子激活的B細(xì)胞的κ-輕鏈增強(qiáng)(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PI3K/Akt、金屬蛋白酶(MMP)和半胱氨酸蛋白酶(caspase)等信號通路。蟲草素會(huì)激活A(yù)MPK信號通路,關(guān)閉mTOR信號通路,終止蛋白翻譯。蟲草素會(huì)抑制蛋白α激酶γ亞基泛素化,抑制蛋白IKBα的磷酸化及降解,抑制NF-κB通路(促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移),最終抑制MMP-9的表達(dá)。MAPK有4個(gè)亞族:ERK、P38、JNK、ERK5,蟲草素會(huì)激活c-Jun氨基端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)蛋白激酶和P38蛋白激酶并誘導(dǎo)Bcl-2家族中的促凋亡蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,胱天蛋白酶3(MMP-3)表達(dá)會(huì)激活多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM),啟動(dòng)PARP蛋白促凋亡作用。PI3K/Akt信號通路負(fù)調(diào)節(jié),最終抑制MMP-9的表達(dá)。蟲草素會(huì)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá),從而降低腫瘤細(xì)胞的侵襲。

圖1 腺苷及蟲草素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of adenosine and cordycepin

1 蟲草素抑制腫瘤生長繁殖

1.1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

圖2 蟲草素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡Fig.2 Cordycepin induces tumor cell apoptosis

蟲草素抗腫瘤機(jī)制可以分為直接和間接兩種方式[4]來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬或凋亡。蟲草素可以通過激活死亡受體3(DR3)、腺苷G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、腫瘤p53抑制因子、促凋亡蛋白(Bax和caspases),抑制抗凋亡蛋白(BCL-2和BCL-xL)和PI3K/Akt來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;還可以通過介導(dǎo)c-FLIP L(凋亡調(diào)節(jié)因子)、PI3K/AKT/mTOR途徑、AMPK/mTOR通路來誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。具體機(jī)制如(圖2)。Hsu等[5]研究證實(shí)了蟲草素通過caspase途徑(選擇切割蛋白質(zhì))來誘導(dǎo)小鼠口腔癌(4NAOC-1)細(xì)胞凋亡。Wang等[6]通過qRT-PCR和Western blot證實(shí)了蟲草素介導(dǎo)促凋亡激活蛋白caspase-3和抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2)的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Yu等[7]研究蟲草素誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(NSCLC)的凋亡與自噬作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)蟲草素不僅可以介導(dǎo)c-FLIP L(凋亡調(diào)節(jié)因子)來促進(jìn)caspase-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還可以抑制肺癌中的mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)信號通路來促使細(xì)胞自噬,加快誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Shao等[8]用蟲草素治療HepG2細(xì)胞分別24、48、72和96 h的IC50值是735±3.67、497.5±2.49、385±1.93和307.5±1.54 mol/L,發(fā)現(xiàn)蟲草素誘導(dǎo)HepG2(人肝癌細(xì)胞)凋亡有兩條途徑:分別是FADD(死亡區(qū)域蛋白)和Bcl-2,而FADD途徑也可以促使Bcl-2(促凋亡蛋白)家族蛋白調(diào)節(jié),使線粒體膜通透性增加,導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放,從而誘導(dǎo)HepG2凋亡。Zeng等[9]發(fā)現(xiàn)蟲草素(20、40 mg/kg)可改善亞硝基二乙胺(NDEA)刺激引起的肝癌轉(zhuǎn)移酶活性并通過Western blot證實(shí)蟲草素通過經(jīng)典的PI3K/AKT/mTOR途徑來治療NDEA誘導(dǎo)的肝癌(HCC)凋亡。Hwang等人[10]發(fā)現(xiàn)蟲草素通過抑制c-FLIPL表達(dá),激活(絲裂原活化蛋白激酶)MKK7-JNK信號通路來觸發(fā)腎癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制。Huang等[11]發(fā)現(xiàn)蟲草素可以激活p38來誘導(dǎo)切割caspase-3和PARP(DNA修復(fù)酶)活化，使P53依賴ROS(活性氧)累積,選擇性誘導(dǎo)MA-10小鼠間質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡;還可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,使細(xì)胞自噬。該文獻(xiàn)弄清了中等濃度以下的蟲草素不會(huì)導(dǎo)致初級小鼠間質(zhì)細(xì)胞死亡,蟲草素在MA-10小鼠間質(zhì)瘤細(xì)胞的作用通路可能是未來研究蟲草素作用機(jī)制的典范。鄭慶委等[12]發(fā)現(xiàn)蟲草素通過AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,促使Tca-8113(人舌癌細(xì)胞)凋亡。綜合以上可知,蟲草素在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡過程中caspase-3起著關(guān)鍵性的作用,蟲草素還可以誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤,胰腺癌細(xì)胞,前列腺癌細(xì)胞凋亡。目前對MAPK通路級聯(lián)反應(yīng)的一些上游調(diào)節(jié)激酶和下游作用底物等尚未完全清楚,例如P38蛋白激酶該位點(diǎn)活化機(jī)制尚不清楚,因此需要學(xué)者進(jìn)行更深入的研究。

1.2 細(xì)胞周期阻滯

蟲草素可以促進(jìn)PI3K/Akt、p53等通路磷酸化,造成腫瘤細(xì)胞周期停滯在G1、S和M、G2/M期,從而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,如(圖3)。Cao等[13]研究蟲草素對人膀胱癌(T24)細(xì)胞存活的影響,對培養(yǎng)的T24細(xì)胞給予蟲草素的劑量為0、10、30和90 μg/mL,對細(xì)胞進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)蟲草素呈劑量依賴性地降低膀胱癌細(xì)胞的存活率,G1、S 和M 期的細(xì)胞存活數(shù)量減少。通過激活A(yù)3腺苷受體使Akt(細(xì)胞生存生長傳導(dǎo)途徑,過度激增可促進(jìn)癌細(xì)胞繁殖)通路失活,誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞(T24細(xì)胞)凋亡。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)60 μmol/L的蟲草素使C6膠質(zhì)細(xì)胞存活率下降到65%,發(fā)現(xiàn)60、80 μmol/L的蟲草素可以誘導(dǎo)p53的磷酸化和表達(dá),以及下游的caspase-7和PARP裂解來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為靶向研究A2AR(腺苷A2aR受體)或p53(抑癌基因)治療藥物提供了依據(jù)。廖園洪[15]闡明了蟲草素激活A(yù)TR-Chk2-Cdc25A信號通路,促進(jìn)Cdc25A的降解,使得CDK2不能被去磷酸化激活,最終造成S期的阻滯,發(fā)揮抗急性髓細(xì)胞白血病(AML)作用;并從Sesterstatin 4/5(二倍半萜化合物)類似物及中間體中篩選出能夠有效抑制白血病細(xì)胞株HL-60 生長的海洋化合物,這為海洋化合物的開發(fā)提供了契機(jī)與先河。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)蟲草素阻斷了人胰腺癌細(xì)胞(MIApaca-2和capan-1)周期蛋白A的合成,DNA復(fù)制失敗,導(dǎo)致S期細(xì)胞周期停滯。有節(jié)律的蟲草素治療會(huì)抑制OSCC(人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞)中的EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)致使細(xì)胞周期停滯。Su等[17]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)蟲草素聯(lián)合放療(RT)可降低p-ATM(共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變)和p-CHK2(檢查點(diǎn)激酶2)表達(dá),誘導(dǎo)使G2/M期阻滯。Lee等[18]發(fā)現(xiàn),200 μmol/L蟲草素可以激活人膀胱癌細(xì)胞中c-Jun 氨基末端激酶來誘導(dǎo)p21WAF1(周期依賴性激酶抑制因子)表達(dá)上調(diào),P53通路減弱,使細(xì)胞周期停滯在G2/M期。Nasser等[19]通過流式細(xì)胞術(shù)方法,分別用蟲草素的濃度為0、20、40、80 μmol/L處理胃癌SGC7901細(xì)胞系24 h,S期百分比上升至45.29±2.13、53.315±2.54、71.092±2.24和71.203±3.1,使細(xì)胞停滯在S期,其機(jī)制是蟲草素促進(jìn)PI3K/Akt磷酸化生成ROS使人胃癌(SGC-7901)細(xì)胞停滯。綜上所述,蟲草素可以通過線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性半胱天冬酶途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯,也可以通過多途徑結(jié)合阻滯腫瘤細(xì)胞周期[20]。

圖3 蟲草素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯Fig.3 Cordycepin-induced tumor cell cycle arrest

1.3 腫瘤干細(xì)胞的抗性

圖4 蟲草素抗腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲Fig.4 Cordycepin resists tumor metastasis and invasion

腫瘤干細(xì)胞本質(zhì)上是腫瘤細(xì)胞群自我更新,無限增殖保持旺盛生命力的元兇。Li等[21]通過建立閉合性股骨骨折的大鼠模型,使用骨髓源性MSC(BMMSC)進(jìn)行治療,利用茜素紅S(ARS)染色和成骨標(biāo)記基因的表達(dá)來評估蟲草素對體外BMMSC的影響,發(fā)現(xiàn)10 μg/mL蟲草素可以通過低氧反應(yīng)途徑來促進(jìn)成骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)愈合,并提出蟲草素低氧反應(yīng)途徑可能成為骨折的潛在治療途徑。Yang等[22]用100 μmol/L蟲草素處理卵巢癌細(xì)胞(SKOV-3)48 h,發(fā)現(xiàn)Akt是腫瘤細(xì)胞存活和凋亡的關(guān)節(jié)點(diǎn),p-JNK是SKOV-3細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的關(guān)鍵介質(zhì),明確了蟲草抑制CCL5(趨化因子)介導(dǎo)Akt/NF-kB磷酸化來抑制SKOV-3(人體細(xì)胞卵巢癌細(xì)胞)的遷移。Wnts是成年哺乳動(dòng)物中大多數(shù)組織干細(xì)胞的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素和調(diào)節(jié)因子,核心Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路激活是CSC生存關(guān)鍵[23],Ko等[24]用50～200 μmol/L的蟲草素處理懸浮液癌細(xì)胞4～24 h,發(fā)現(xiàn)蟲草素呈劑量依賴性降低β-catenin的表達(dá),蟲草素可能通過PI3K/AKT依賴機(jī)制調(diào)控GSK-3β/β-catenin,從而抑制人體中的LSCs(白血病干細(xì)胞)的存活或更新,為蟲草素與其他藥物協(xié)同根除LSCs來治療白血病提供了新策略。

2 蟲草素對腫瘤微環(huán)境的調(diào)控作用

高侵襲的腫瘤細(xì)胞不一定具有高轉(zhuǎn)移能力,但是高侵襲是腫瘤細(xì)胞高轉(zhuǎn)移的必要條件。癌癥轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因,因此針對腫瘤生態(tài)微環(huán)境治療癌癥轉(zhuǎn)移是目前新興的一種方法[25]。

2.1 抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因參與、多因素影響的復(fù)雜過程,蟲草素通過調(diào)控(絲裂原活化蛋白激酶)MAPK、NF-κB、PI3K/Akt、P-Akt和P-Fak等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)MMP(線粒體電位)表達(dá),上調(diào)內(nèi)源性MMP-3和caspase-9的表達(dá),阻斷EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化),調(diào)控E-cadherin/N-cadherin蛋白平衡,從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲,具體如(圖4)。王多等[26]證明了蟲草素通過(絲裂原活化蛋白激酶)MAPK、NF-κB和PI3K/Akt等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)MMP(線粒體電位)表達(dá),從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。劉特思等[27]通過實(shí)驗(yàn)得出蟲草素可以抑制EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)和靶向DEK蛋白調(diào)控Akt和Erkl/2信號通路來抑制膽管癌細(xì)胞遷移。Kan等人[28]通過體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),蟲草素可以上調(diào)內(nèi)源性MMP-3和Caspase-9的表達(dá),逆轉(zhuǎn)DRGn(髓背根神經(jīng)元神經(jīng)節(jié))的神經(jīng)毒性作用,證實(shí)了蟲草素(CDC)50 μmol/L對利多卡因誘導(dǎo)DRGNs(脊髓背根神經(jīng)元神經(jīng)節(jié))毒性起到挽救作用,MMP-3很可能是蟲草素直接下游底物,CDC/MMP-3信號級聯(lián)可能是一種降低神經(jīng)毒性的方法。最新Lee等人[29]發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中(富含蟲草素)的WIB-801C抑制MMP-9的表達(dá)和活性,減輕了BSCB(血-脊髓屏障)在血細(xì)胞浸潤后的破壞,抑制損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞對p38MAPK的激活,改善了脊髓損傷后的細(xì)胞調(diào)亡，為以后WIB-801C作為脊髓損傷后的治療藥物奠定基礎(chǔ)。Choi等[30]發(fā)現(xiàn)蟲草素在(0、5、10、15、20和25 μg/mL)呈劑量依賴性的抑制PC-3(人前列腺癌細(xì)胞)的運(yùn)動(dòng)和侵襲。蟲草素在調(diào)控緊密連接(TJ)的基礎(chǔ)上,抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性,還同時(shí)提高了(金屬蛋白酶組織抑制劑)TIMP-1和TIMP-2的水平。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9發(fā)揮主要作用,這為靶向治療腫瘤研發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。

2.2 腫瘤轉(zhuǎn)移阻滯

Hueng等[31]在傷口愈合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蟲草素用80～100 μmol/L處理人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(U87MG),60～80 μmol/L處理人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(LN229),24 h后,傷口面積較對照組明顯增加,蟲草素可以降低整合素α1、AKT、P-FAK、白細(xì)胞介導(dǎo)的蛋白表達(dá),從而抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U8MG7和LN229的遷移,蟲草素介導(dǎo)的P-Akt、P-Fak,這些靶點(diǎn)可能是今后抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移的有效靶點(diǎn)[32]。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)蟲草素通過調(diào)節(jié)TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)來阻斷EMT(上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化),達(dá)到抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移,該實(shí)驗(yàn)解決了蟲草素在卵巢癌細(xì)胞中癌癥轉(zhuǎn)移和線粒體活性之間關(guān)聯(lián)不清楚的問題。Yang等[34]實(shí)驗(yàn)表明10 μg/mL蟲草素在孵育Caki-1(腎癌)細(xì)胞24和48可顯著細(xì)胞的遷移,通過調(diào)節(jié)microRNA-21/PI3k/AKT通路,阻滯腎癌細(xì)胞遷移。蟲草素通過溶酶體降解和蛋白磷酸酶活化來抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移,多機(jī)制聯(lián)合抑制黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。

2.3 癌細(xì)胞與間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的粘附

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是有具有多向分化潛能的原始細(xì)胞,但在炎癥[35-36]微環(huán)境中受到抑制,腫瘤壞死因子(TNF-a)是抑制成骨細(xì)胞分化成熟的主要通路,間充質(zhì)干細(xì)胞可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抵抗[37-38]。劉建兵等[39]通過體外實(shí)驗(yàn)初步探討蟲草素呈濃度時(shí)間依賴性的激活p53、caspase-3信號通路與逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT(上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化),E-cadherin和N-cadherin蛋白分別是上皮表型和間質(zhì)表型的標(biāo)志分子,E-cadherin表達(dá)降低,N-cadherin表達(dá)升高是細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要機(jī)制,蟲草素通過調(diào)控E-cadherin/N-cadherin蛋白的平衡來抑制胰腺癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,這一發(fā)現(xiàn)為胰島素靶向胰腺癌干細(xì)胞提供了理論基礎(chǔ),具體E-cadherin和N-cadherin的相關(guān)機(jī)制和信號分子還需要進(jìn)一步摸索。目前,大量基因組學(xué)和流行病學(xué)表明炎癥在腫瘤發(fā)展過程中扮演至關(guān)重要的角色[40-41]。楊建平等[42]發(fā)現(xiàn)蟲草素直接減少IkBa磷酸化,抑制TNF-α來激活NF-kB信號通路,因此得出蟲草素除了抑制TNF-α減少炎癥,還促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞成骨分化。Liang等[43]用50 μmol/L蟲草素處理骨髓白血病U937和K562細(xì)胞24 h破壞了白血病與間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs的聯(lián)系,下調(diào)白血病中的N-鈣粘蛋白和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的VCAM-1(血管細(xì)胞粘附因子),抑制白血病細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附。Su等[44]發(fā)現(xiàn)有節(jié)律的蟲草素給藥上調(diào)了E-鈣粘蛋白的表達(dá),下調(diào)了N-鈣粘蛋白的表達(dá),抑制了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)可以有效地控制腫瘤的發(fā)展。

3 結(jié)論與展望

筆者經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)蟲草素抗腫瘤機(jī)制[45]涉及到多基因[46-48]表達(dá)調(diào)控,具體可歸結(jié)為以下幾種原因[49]:蟲草素磷酸化與ATP(三磷酸腺苷)結(jié)構(gòu)高度相似,酶會(huì)錯(cuò)誤地將蟲草素識(shí)別為腺苷,導(dǎo)致嘌呤代謝異常,抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成[50-51]；蟲草素取代ATP,抑制靶向蛋白激酶；蟲草素直接激活蛋白激酶,例如AMPK,AMP/ATP比率增加；PolyA(聚合酶)錯(cuò)誤識(shí)別為ATP,中斷mRNA聚腺苷酸化；作為配體抑制RNA延伸和轉(zhuǎn)錄。就國內(nèi)外進(jìn)展而言:目前國外在研究蟲草素抗腫瘤[52-53]Akt/p38、NF-KB、AMPK上下游靶點(diǎn)比較成熟,而國內(nèi)剛剛起步;國外在神經(jīng)修復(fù),脂肪分化等方面已有新的突破,國內(nèi)多集中在肝癌肺癌方面;國外在蟲草素抗腫瘤[54]方面已進(jìn)入到臨床試用階段,國內(nèi)多集中在提取培養(yǎng)[55-57]這方面。面對這一情形,我們可采取的措施有:就蟲草素快代謝這方面,可以通過結(jié)構(gòu)改造,材料包埋技術(shù)[58]延長其在體內(nèi)作用時(shí)間[59-60];就作用機(jī)制這方面,我們可以通過計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)模擬結(jié)合代謝組學(xué)[61]整體挖掘蟲草素的調(diào)控機(jī)制。我國應(yīng)該積極與國際接軌,結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)反復(fù)驗(yàn)證蟲草素抗病機(jī)理[62-63],加快研究其作用機(jī)制過程,將蟲草素開發(fā)利用到最大限度。