響應(yīng)面法優(yōu)化黃花魚魚鱗脫鈣工藝

李文鳳,王標(biāo)詩(shī),余石堅(jiān),陳舒琪,楊勝遠(yuǎn),胡小軍,彭元懷,江 敏,馬景球

(嶺南師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東湛江 524048)

我國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)規(guī)模越來越大,但在漁業(yè)供求鏈不斷提高的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料廢棄物,其中包含大量的魚鱗,其對(duì)環(huán)境凈化造成一定的壓力[1-2]。經(jīng)研究分析魚鱗中的成份主要為生物性高分子膠原蛋白和羥基磷灰石,越來越多的學(xué)者以魚鱗為原料提取膠原蛋白,進(jìn)而開發(fā)藥用明膠產(chǎn)品，這拓展了其在保健食品、醫(yī)藥和化妝美容等方向的應(yīng)用，是近年來的研究熱潮[3-5]。吳凌濤等[6]對(duì)十種淡水魚進(jìn)行研究分析,得出鱸魚和黃花魚營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的結(jié)論。而黃花魚作為我國(guó)四大海洋漁業(yè)品種之一,生長(zhǎng)分布廣泛,具有很好的食療作用,長(zhǎng)期以來深受消費(fèi)者的喜歡[7-8]。黃花魚除鮮食外,還可加工成魚罐頭、魚糜等系列產(chǎn)品,在鮮食和加工過程中魚鱗一般被制成飼料或作為廢棄物進(jìn)行處理,魚鱗中含有豐富的膠原蛋白,對(duì)黃花魚魚鱗進(jìn)行合理研究利用,能提高魚類加工副產(chǎn)物的附加值,進(jìn)一步增大其經(jīng)濟(jì)效益。

魚鱗是由三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白和羥基磷灰石共同形成的纖維板層結(jié)構(gòu),其中膠原被磷灰石黏附,因此提取魚鱗膠原蛋白之前,魚鱗必須脫灰脫鈣,而且脫鈣越徹底,膠原蛋白的質(zhì)量越高[9]。據(jù)目前研究,有關(guān)魚鱗脫鈣工藝的研究方法主要有酸法(鹽酸、檸檬酸、乳酸等)、熱水提取法和EDTA法,以及其他物理輔助脫鈣法(超聲波、微波、磁力攪拌等)[10]。蔣柏泉等[11]在單因素基礎(chǔ)上建立動(dòng)力學(xué)方程,以鹽酸為脫鈣劑得到最優(yōu)工藝條件下鳙魚魚鱗脫鈣率為86.20%。彭元懷等[12]以檸檬酸為脫鈣劑對(duì)羅非魚魚鱗進(jìn)行脫鈣,運(yùn)用EDTA 絡(luò)合滴定法在單因素基礎(chǔ)上利用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化分析,脫鈣率達(dá)96.13%。王梅英等[13]通過采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行超聲波輔助羅非魚魚鱗鹽酸脫鈣的優(yōu)化試驗(yàn),在最優(yōu)工藝條件下脫鈣率達(dá)到92.43%?？梢?不同的方法對(duì)魚鱗脫鈣效果有一定差異。

對(duì)于魚鱗脫鈣工藝的研究,淡水魚中羅非魚[12-13]和四大家魚(青魚草魚鰱魚和鳙魚)[14-17]都有相關(guān)研究報(bào)道,海水魚中(如沙丁魚[18])也有部分報(bào)道,尚未見對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣的相關(guān)報(bào)道,而物理場(chǎng)輔助酸法對(duì)魚鱗脫鈣相關(guān)的報(bào)道也較少。使用的脫鈣劑多為檸檬酸和鹽酸,考慮到安全性和成本等因素,本試驗(yàn)以檸檬酸為脫鈣劑,利用超聲波對(duì)液體產(chǎn)生的空化作用而使液體瞬間獲得巨大壓力來改變魚鱗脫鈣效果,考查料液比、檸檬酸濃度、超聲時(shí)間這三因素對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣率的影響,并通過響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)原理對(duì)魚鱗脫鈣進(jìn)行優(yōu)化分析,以期為黃花魚魚鱗膠原蛋白的提取提供參考條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃花魚魚鱗 收集于湛江市東風(fēng)市場(chǎng);碳酸鈣、鹽酸、氨水、氯化銨、鉻黑T、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉等 均為分析純。

FA2104N-電子天平 上海精科天美科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C精密酸度計(jì) 上海精研電子科技有限公司;BAO-50A精密鼓風(fēng)干燥箱 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司;JY92-ⅡN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;HZS-HA水浴振蕩器 廣州市德科生物科技有限公司;210 mm干燥器 臺(tái)州市偉新糧檢儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚鱗脫鈣工藝 將收集的魚鱗用清水多次沖洗并去除雜質(zhì),于35 ℃干燥箱鼓風(fēng)干燥24 h后儲(chǔ)存于干燥器備用;將干燥的魚鱗剪成細(xì)小碎片,稱取一定量加入一定體積和濃度的檸檬酸溶液,在超聲波功率為450 W條件下處理一定時(shí)間后,過濾、取濾液備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在超聲波功率為450 W條件下,以脫鈣率為指標(biāo),固定檸檬酸濃度為10%,超聲時(shí)間為60 min,探究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)魚鱗脫鈣的影響;固定液料比為1∶20 (g/mL),超聲時(shí)間為60 min,探究檸檬酸濃度(6%、8%、10%、12%、14%)對(duì)魚鱗脫鈣的影響;固定液料比為1∶20 (g/mL),檸檬酸濃度為10%,探究超聲時(shí)間(30、45、60、75、90 min),此時(shí)間為實(shí)際超聲總時(shí)間,不包括間歇時(shí)間,操作中每超聲工作2 s,間歇2 s)對(duì)魚鱗脫鈣的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以料液比(X1)、檸檬酸濃度(X2)、超聲時(shí)間(X3)這3個(gè)因素為自變量,脫鈣率(Y)為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面中Box-Behnken試驗(yàn)原理進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)。因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 脫鈣率的測(cè)定

1.2.4.1 魚鱗中總鈣含量的測(cè)定 按照GB 5009.92-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鈣的測(cè)定,具體操作如下。將晾干的魚鱗剪碎準(zhǔn)確稱取一定量,按照1∶20的料液比加入1 mol/L的鹽酸溶液,在室溫下進(jìn)行處理24 h后將液體轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并定容,用EDTA(0.001 mol/L)溶液進(jìn)行滴定。試樣的總鈣含量按下式計(jì)算:

式中,X-樣液中的總鈣含量,mg/kg;T-EDTA-2Na滴定度,mg/mL;V1-滴定樣液時(shí)所消耗的EDTA-2Na(0.001 mol/L)溶液的體積,mL;V0-滴定空白液時(shí)所消耗的EDTA-2Na(0.001 mol/L)溶液的體積,mL;V2-樣液總體積,mL;m-試樣質(zhì)量,g;V3-滴定用樣液的體積,mL;1000—換算系數(shù)。

1.2.4.2 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考肖莉等[14]實(shí)驗(yàn)方法。準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥處理的基準(zhǔn)碳酸鈣2.5000 g于250 mL燒杯中,緩慢加入少量的鹽酸(6 mol/L)進(jìn)行溶解,定容于1000 mL容量瓶。準(zhǔn)確吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00 mL脫鈣液于250 mL錐形瓶中,加蒸餾水至50 mL,依次加入15 mL氨水緩沖液,3滴鉻黑T,搖勻后用0.01 mol/L的EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液滴至溶液變?yōu)樗{(lán)色,記錄消耗EDTA-2Na的體積。分別以EDTA-2Na的消耗體積和鈣離子濃度為橫縱坐標(biāo)繪制鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到該曲線的線性回歸方程。

1.2.4.3 脫鈣率的計(jì)算 取1 mL脫鈣后的濾液與錐形瓶中。按照1.2.4.2的操作進(jìn)行滴定得到反應(yīng)消耗EDTA-2Na的體積,并通過1.2.4.2得到的線性回歸方程計(jì)算鈣離子濃度,按下式計(jì)算脫鈣率:

式中,Y-魚鱗脫鈣率,%;ρ-由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的鈣離子濃度,mg/mL;V-檸檬酸體積,mL;F-滴定時(shí)稀釋倍數(shù);m-黃花魚魚鱗質(zhì)量,g;H-魚鱗總鈣含量,mg/kg。

1.2.5 魚鱗膠原蛋白損失率測(cè)定 羥脯氨酸是膠原蛋白的氨基酸組成之一,其與膠原蛋白的含量成正相關(guān)關(guān)系,故通過測(cè)定羥脯氨酸含量可間接計(jì)算出膠原蛋白的損失率值[19-20]。參照國(guó)標(biāo)GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》的方法,分別測(cè)得脫鈣液中的羥脯氨酸含量N和魚鱗中羥脯氨酸含量M,再按照以下公式進(jìn)行黃花魚魚鱗脫鈣后膠原蛋白的損失率Y(%)計(jì)算:

式中,Y-膠原蛋白損失率,%;N-羥脯氨酸含量,%;M-魚鱗中羥脯氨酸含量,%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的試驗(yàn)至少進(jìn)行三次,根據(jù)三次試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果以均值或均值(標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行繪圖,Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。根據(jù)鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程為:y=0.0198x-0.0007,式中y為鈣離子濃度,mg/mL;x為EDTA-2Na消耗體積,mL;決定系數(shù)R2為0.9999,表明EDTA-2Na消耗體積和鈣離子濃度有良好線性關(guān)系。

圖1 鈣離子標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calcium ion standard curve

2.2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,以吸光度(扣除空白)為縱坐標(biāo)、羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算回歸方程為 y=0.2068x+0.0076,決定系數(shù)R2為0.9994,顯示吸光度與羥脯氨酸濃度有良好的線性關(guān)系。

圖2 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard cuve of Hyp

圖3 料液比對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on decalcification rate of yellow croaker scales

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對(duì)魚鱗脫鈣的影響 料液比對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣的影響結(jié)果見圖3。由圖3可以看出,料液比小于1∶20時(shí),隨著料液比的增加魚鱗脫鈣率明顯升高,可能是溶液體積增大,使得魚鱗更加分散,增大了檸檬酸與羥基磷灰石的接觸表面積,從而促進(jìn)脫鈣。當(dāng)料液比超過1∶20后,進(jìn)一步增加料液比,脫鈣率有降低的趨勢(shì),可能魚鱗中鈣離子對(duì)檸檬酸的需求基本達(dá)到飽和狀態(tài)[15],再增加料液比,反而不利于魚鱗脫鈣。因此選取液料比為1∶20 g/mL較合適。

2.3.2 檸檬酸濃度對(duì)魚鱗脫鈣的影響 檸檬酸濃度對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣的影響結(jié)果見圖4。由圖4可以看出,脫鈣率隨著檸檬酸濃度的增高有先升后降的趨勢(shì),在濃度為10%時(shí)有較高脫鈣率,相比濃度為6%時(shí)的脫鈣率,兩者結(jié)果相差9.32%,說明檸檬酸濃度對(duì)脫鈣率有較大影響,在濃度較低時(shí),提高反應(yīng)物的濃度,有利于鈣離子與檸檬酸反應(yīng)生成檸檬酸鈣,進(jìn)而促進(jìn)脫鈣。在檸檬酸濃度達(dá)到10%時(shí),此時(shí)體系中的檸檬酸已經(jīng)能夠滿足鈣離子的反應(yīng)需求,體系已趨于平衡[15],此時(shí)提高檸檬酸濃度,對(duì)脫鈣反而不利從而降低了魚鱗脫鈣率。因此選取檸檬酸濃度為10%較適。

圖4 檸檬酸濃度對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣的影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on decalcification rate of yellow croaker scales

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)魚鱗脫鈣的影響 超聲時(shí)間對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣影響的結(jié)果見圖5。由圖5可以看出,超聲時(shí)間小于60 min時(shí),脫鈣率隨著時(shí)間的變化明顯升高,說明魚鱗中的鈣溶出到與檸檬酸反應(yīng)需要一定時(shí)間;當(dāng)脫鈣時(shí)間超過60 min 后,進(jìn)一步提高反應(yīng)時(shí)間,而脫鈣率反而降低,說明過長(zhǎng)時(shí)間超聲處理反而不利于魚鱗脫鈣。因此選取超聲時(shí)間為60 min較適。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on decalcification rate of yellow croaker scales

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 模型的建立與分析 以料液比(X1)、檸檬酸濃度(X2)和超聲時(shí)間(X3)為試驗(yàn)因素,魚鱗脫鈣率Y(%)為評(píng)價(jià)指標(biāo),運(yùn)用Design-Expert V8.0.6 Box-behnken進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì),其試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

對(duì)表2進(jìn)行回歸分析得到試驗(yàn)因素與脫鈣率的方程式如下:

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析和回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn),結(jié)果見表3。由表3中方差分析可知,回歸模型的失擬項(xiàng)P=0.0640>0.05,說明該模型計(jì)算不存在顯著誤差,所得方程與實(shí)際擬合良好;模型的復(fù)決定系數(shù)R2值為0.9927,擬合度>90%,表明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度較好,能合理描述響應(yīng)值的變化過程。因此可利用該模型對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis and their significance test of its coefficients for the regression model

圖6 檸檬酸濃度與超聲時(shí)間對(duì)脫鈣率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of citric acid concentration and ultrasonic time on decalcification rate

圖7 檸檬酸濃度和料液比對(duì)脫鈣率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of citric acid concentration and solid-liquid ratio on decalcification rate

圖8 超聲時(shí)間和料液比對(duì)脫鈣率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour line showing the interactive effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on decalcification rate

2.4.2 響應(yīng)曲面圖型分析 圖6是料液比為1∶20的條件下輔以450 W功率的超聲波進(jìn)行魚鱗脫鈣,檸檬酸濃度-超聲時(shí)間與魚鱗脫鈣率關(guān)系的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。從圖6可知,當(dāng)超聲時(shí)間為60 min以下某一固定值,檸檬酸濃度在6%～10%范圍時(shí),脫鈣率隨檸檬酸濃度增高而增高;當(dāng)超聲時(shí)間為60 min以上某一固定值,檸檬酸濃度在10%～14%范圍時(shí),脫鈣率隨檸檬酸濃度增高而降低。通過檢驗(yàn)結(jié)果P=0.2087(P>0.05),顯示檸檬酸濃度與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)魚鱗脫鈣率的影響不顯著。

圖7是超聲時(shí)間為60 min的條件下輔以450 W功率的超聲波進(jìn)行魚鱗脫鈣,檸檬酸濃度-料液比與魚鱗脫鈣率關(guān)系的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。從中可知,在檸檬酸濃度為8%～12%,料液比為1∶15～1∶25區(qū)間時(shí),脫鈣率有最大閾。P=0.6264(P>0.05),顯示檸檬酸濃度與料液比的交互作用對(duì)魚鱗脫鈣率的影響不顯著。

圖8是檸檬酸濃度為10%的條件下輔以450 W功率的超聲波進(jìn)行魚鱗脫鈣,超聲時(shí)間-料液比與魚鱗脫鈣率關(guān)系的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。從中可知,超聲時(shí)間較短時(shí),適當(dāng)增大料液比能提高脫鈣率;超聲時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),過大的料液比比值反而降低脫鈣率。通過檢驗(yàn)結(jié)果P=0.1349(P>0.05),顯示超聲時(shí)間與料液比的交互作用對(duì)魚鱗脫鈣率的影響不顯著。響應(yīng)面模型中的曲面投影形狀可以反映出考查因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,圖形的形狀近似圓形能體現(xiàn)出各個(gè)因素之間的交互作用不是很顯著[21]。圖7和圖8等高線更接近于圓形,也說明其交互作用不顯著。

2.4.3 提取條件的優(yōu)化與驗(yàn)證 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert. V8.0.6對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析擬合,得到黃花魚魚鱗脫鈣最優(yōu)工藝條件:料液比為1∶19.28,檸檬酸濃度為10.55%,超聲時(shí)間為65.56 min,響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的脫鈣率為99.33%。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況及方案實(shí)施的可操作性,對(duì)上述工藝條件進(jìn)行調(diào)整為:料液比1∶19,檸檬酸濃度10.5%,超聲時(shí)間為65 min,以此條件在功率為450 W的超聲下進(jìn)行三次平行試驗(yàn)測(cè)得實(shí)際脫鈣率為99.18%±0.14%,說明該方程與實(shí)際情況擬合良好,實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的誤差約為0.15%,誤差較小,可能是由于條件差異導(dǎo)致。此數(shù)據(jù)也高于試驗(yàn)中的最高值99.02%,因而說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化黃花魚魚鱗脫鈣工藝的方法相對(duì)較為合理,得到擬合方程適用于對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣工藝條件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化和分析。

2.4.4 最優(yōu)條件下魚鱗脫鈣膠原蛋白的損失率結(jié)果 在最優(yōu)條件工藝下對(duì)魚鱗脫鈣液測(cè)定膠原蛋白含量,進(jìn)行三次平行試驗(yàn),最終得到膠原蛋白損失率為4.08%±0.36%,膠原蛋白損失不大。因此表明超聲波輔助檸檬酸對(duì)黃花魚魚鱗的膠原蛋白影響較小,可以對(duì)魚鱗中鈣進(jìn)行有效脫除能進(jìn)行工藝優(yōu)化,這將為黃花魚魚鱗進(jìn)行下一步提取膠原蛋白的研究提供很好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法設(shè)計(jì)建立了魚鱗脫鈣的液料比、檸檬酸濃度和超聲時(shí)間三因素的回歸模型,表明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度較好,可利用該模型對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。三個(gè)自變量對(duì)魚鱗脫鈣率的影響大小的結(jié)果依次為:超聲時(shí)間>料液比>檸檬酸濃度。通過優(yōu)化分析得出黃花魚魚鱗最佳脫鈣工藝條件為:在超聲波功率450 W下,料液比為1∶19,檸檬酸濃度為10.5%,超聲時(shí)間為65 min,在此條件下魚鱗脫鈣率高為99.18%±0.46%,膠原蛋白損失率為4.08%±0.36%,說明超聲波輔助可以有效提高檸檬酸對(duì)黃花魚魚鱗脫鈣效果,而且對(duì)魚鱗膠原蛋白的損失極小,這為后續(xù)提取魚鱗膠原蛋白奠定了好的基礎(chǔ)。