瓊脂對(duì)Komagataeibacter xylinus自發(fā)變異的控制

王志國(guó),鐘春燕,張偉敏,*

(1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南?？?570228; 2.海南椰國(guó)食品有限公司,海南?？?570311)

木駒形桿菌Komagataeibacterxylinus(或稱(chēng)Acetobacterxylinum,Gluconacebacterxylinus)[1-2],產(chǎn)生的纖維素稱(chēng)為細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose,BC),具有純度、結(jié)晶度、持水力、楊氏模量高及生物相容性好等獨(dú)特性能[3-5],廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[6-9]。我國(guó)海南從1996年開(kāi)始利用椰子水生產(chǎn)細(xì)菌纖維素(椰纖果),目前全省該類(lèi)廠(chǎng)80多家,年產(chǎn)量約18萬(wàn)噸,年產(chǎn)值近3億元。但椰纖果生產(chǎn)中一個(gè)較為突出的技術(shù)問(wèn)題尚未能解決,即K.xylinus種子液制備時(shí)易變異,導(dǎo)致BC產(chǎn)量降低,甚至絕收,此外大量發(fā)酵廢液的排放,既造成一一經(jīng)濟(jì)損失又嚴(yán)重污染環(huán)境。

Schramm等首次報(bào)道了K.xylinus變異現(xiàn)象。在搖瓶培養(yǎng)時(shí),K.xylinus菌體會(huì)發(fā)生變異,從而形成具有中度缺陷和嚴(yán)重缺陷的突變體,相較野生型菌株,突變體在菌落特征及產(chǎn)BC能力方面都有顯著差異,后來(lái)陸續(xù)有學(xué)者就K. sp.變異現(xiàn)象進(jìn)行了報(bào)道[10-12]。前期研究發(fā)現(xiàn),該菌在靜態(tài)淺層培養(yǎng)中很穩(wěn)定,在深層靜態(tài)培養(yǎng)及攪拌培養(yǎng)中易產(chǎn)生變異菌株[13-14]。此外,瓊脂對(duì)K.xylinus在不同培養(yǎng)方法下BC產(chǎn)量及結(jié)晶度具有較大影響。李少慧及Chao等認(rèn)為,瓊脂使K.xylinus靜態(tài)培養(yǎng)中BC產(chǎn)量降低[15-16];但在搖瓶或攪拌培養(yǎng)中,因?yàn)榄傊档土思羟辛15],增加了游離細(xì)胞數(shù)量[15-16]，降低了BC結(jié)晶度,從而提高了產(chǎn)量[17]。

本實(shí)驗(yàn)在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中,研究培養(yǎng)基中添加瓊脂對(duì)K.xylinus自發(fā)變異的影響,采用涂布法對(duì)變異菌的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定,稱(chēng)重法對(duì)BC的產(chǎn)量測(cè)定,同時(shí)運(yùn)用粘度法和傅里葉變換紅外光譜法分別對(duì)BC的聚合度和結(jié)晶度進(jìn)行分析,采用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中纖維素酶活力,以期探尋瓊脂對(duì)K.xylinus自發(fā)變異的控制及原因探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木駒形桿菌(Komagataeibacterxylinus) 本室分離保存;SH液體培養(yǎng)基1000 mL:葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、酵母膏 5 g、檸檬酸1.15 g、Na2HPO42.7 g,121 ℃,滅菌20 min,其中加入20 g瓊脂成為固體培養(yǎng)基[18];種子液制備:固體培養(yǎng)基上(30 ℃,10 d)挑取5個(gè)菌落加入50 mL液體培養(yǎng)基中,30 ℃,靜態(tài)培養(yǎng)3 d;銅乙二胺溶液 中國(guó)紙漿造紙研究院。

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;SHP-1500生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHZ-82氣浴恒溫振蕩器 常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司;UV-3200紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;1-14高速離心機(jī) 德國(guó)Sigma;T27傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 含瓊脂培養(yǎng)液:種子液按5%(v/v)接種量接種至250 mL三角瓶中的150 mL液體SH培養(yǎng)液中(不添加或添加瓊脂0.05%和0.10%,以w/v計(jì)),30 ℃,靜態(tài)培養(yǎng)4 d或者120 r/min搖瓶培養(yǎng)4 d。

含泡沫塑料顆粒培養(yǎng)液:靜態(tài)培養(yǎng)中,防止攜帶BC的菌體下沉,培養(yǎng)液加入泡沫塑料顆粒(3 mm× 3 mm× 3 mm)。在超凈工作臺(tái)上,泡沫顆粒經(jīng)紫外燈照射30 min后,直接無(wú)菌操作投入至已滅菌的液體SH培養(yǎng)液中,培養(yǎng)基的體積和接種方法同上,30 ℃,靜態(tài)培養(yǎng)4 d。

轉(zhuǎn)接培養(yǎng):為了考察K.xylinus在添加瓊脂的培養(yǎng)液中,靜態(tài)和動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中的自發(fā)變異,按5%(v/v)接種量接種至相對(duì)應(yīng)的相同培養(yǎng)基組成和體積的培養(yǎng)液中,并按相對(duì)應(yīng)的相同培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

上述培養(yǎng)中,以靜態(tài)培養(yǎng)(不添加瓊脂)的為對(duì)照組,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2 變異菌計(jì)數(shù) 將30 ℃靜態(tài)或搖瓶4 d的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)無(wú)菌水10～104梯度稀釋,取0.1 mL稀釋液涂布于固體培養(yǎng)基上,30 ℃,培養(yǎng)7 d,變異菌與正常菌的菌落外觀差異明顯,正常菌的菌落小而凸起,表面干燥,變異菌的菌落大而扁平,表面濕潤(rùn)[13]。

1.2.3 BC量測(cè)定 從發(fā)酵液中直接收集膜狀BC,而絮狀或顆粒狀BC經(jīng)4000 r/m,20 min離心獲得,再將BC置于80 ℃,0.1 mol/L NaOH溶液中,維持2 h,冷卻后用0.1 mol/L HCl中和,自來(lái)水充分洗滌,在80 ℃下干燥至恒重后稱(chēng)重。

1.2.4 BC聚合度及結(jié)晶度測(cè)定 銅乙二胺溶液法測(cè)定BC聚合度(Degree of Polymerization,DP):準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)除雜冷凍干燥的BC 0.05 g,加入幾小塊銅片,用20 mL銅乙二胺溶液,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌溶解,使用烏氏粘度計(jì)(內(nèi)徑0.5～0.6 mm)測(cè)定其流出時(shí)間,按下式計(jì)算其聚合度[19]。

式中：ηsp:增比粘度;t:試樣流出時(shí)間,單位s;t0:銅乙二胺溶液流出時(shí)間,單位s;[η]:特性粘度;c:纖維素濃度,單位g/mL。

BC結(jié)晶度測(cè)定:將除雜冷凍干燥的BC,剪刀剪碎,稱(chēng)取2 mg,用300 mg KBr(光譜級(jí),阿拉丁)充分研磨后壓片,使用T27型傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定樣品在4000～400 cm-1范圍內(nèi)的吸光度[20],用基線(xiàn)量取法得到1428及897 cm-1的峰高,根據(jù)下列公式計(jì)算其結(jié)晶度[21-22]。

1.2.5 纖維素酶活力測(cè)定 發(fā)酵液在4000 r/min離心10 min,取上清液20 mL,加入硫酸銨達(dá)到60%(w/w),4 ℃,12 h后,4000 r/min離心10 min,收集沉淀,加入0.1 mol/L,pH5.0的乙酸鈉緩沖溶液3 mL,轉(zhuǎn)移至透析袋中透析至無(wú)銨離子,經(jīng)PEG-20000濃縮后,加入0.1 mol/L,pH5.0乙酸鈉緩沖溶液,使其總體積為1 mL,成為粗酶液,取0.5 mL加入至1 mL乙酸鈉緩沖溶液配制的0.2%(w/v)CMC-Na中,37 ℃水浴,60 min,加入DNS試劑3 mL,沸水浴5 min,冷卻后再加入8 mL蒸餾水,540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

表1 瓊脂對(duì)K. xylinus靜態(tài)培養(yǎng)中自發(fā)變異及BC產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of agar on spontaneous mutation and BC weights of K. xylinus

纖維素酶活力單位為μ mol G/20 mL培養(yǎng)液60 min,其含義:20 mL培養(yǎng)液中的纖維素酶在37 ℃條件下,以CMC-Na為底物,水解60 min,生成的葡萄糖量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。Excel軟件中輸入數(shù)據(jù),進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算、方差分析和Q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂對(duì)K. xylinus自發(fā)變異及BC產(chǎn)量的影響

靜態(tài)培養(yǎng),對(duì)照實(shí)驗(yàn)中,在氣-液界面處,收集到的BC膜不完整(圖1A),而添加0.05%瓊脂或泡沫塑料小顆粒中則形成完整BC膜(圖1B和圖1C),添加0.10%瓊脂中也形成完整的BC膜。

圖1 添加瓊脂或泡沫塑料顆粒對(duì) K. xylinus靜態(tài)培養(yǎng)中BC膜形成的影響Fig.1 Effects of agar or foamed plastic particles on BC pellicles in static culture 注:A.對(duì)照;B.0.05%瓊脂;C.泡沫塑料顆粒。

表1所示:K.xylinus靜態(tài)培養(yǎng)時(shí),對(duì)照實(shí)驗(yàn)(未添加瓊脂的靜態(tài)培養(yǎng))中,變異菌數(shù)達(dá)4.63×105,占總菌數(shù)的38.33%,而添加0.05%和0.10%瓊脂的培養(yǎng)液,以及加入泡沫顆粒的培養(yǎng)液中沒(méi)有出現(xiàn)變異菌。

對(duì)照中,BC產(chǎn)量為0.16 g/L,氣-液界面是菌體生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)BC的活躍層,變異菌在空間及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)方面與野生型競(jìng)爭(zhēng),導(dǎo)致BC產(chǎn)量最低;當(dāng)瓊脂添加量為0.05%時(shí),由于變異菌沒(méi)有出現(xiàn),BC產(chǎn)量增加至0.38 g/L;當(dāng)瓊脂添加量為0.10%時(shí),BC含量反而下降,其原因在于盡管變異沒(méi)有發(fā)生,但瓊脂使發(fā)酵液粘度過(guò)大,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不易滲透至BC膜表面,從而B(niǎo)C產(chǎn)量(0.28 g/L)降低,但仍較對(duì)照中的BC產(chǎn)量高。李少慧及Chao等人靜態(tài)培養(yǎng)時(shí),瓊脂使BC產(chǎn)量降低[15-16],可能是因?yàn)樗麄兊木暝陟o態(tài)培養(yǎng)時(shí)沒(méi)有發(fā)生變異的緣故。

靜態(tài)培養(yǎng)是制備K.xylinus種子液的主要方式,但由于培養(yǎng)容器裝液量多,液體的深度較大,種子液經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)接后往往發(fā)生自發(fā)變異,導(dǎo)致其接種至生產(chǎn)培養(yǎng)基中時(shí)BC產(chǎn)量大幅下降[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),靜態(tài)方式制備種子液時(shí),培養(yǎng)基中添加0.05%的瓊脂,即使連續(xù)轉(zhuǎn)接9次,種子液中也未曾出現(xiàn)變異菌,且培養(yǎng)液中菌體濃度保持在106CFU/mL以上(見(jiàn)圖2)。

K.xylinus動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí),變異菌數(shù)量高達(dá)1.32×107CFU/mL,占總菌數(shù)的88.60%,因而B(niǎo)C產(chǎn)量?jī)H為0.09 g/L;0.05%瓊脂使變異菌的數(shù)量減少,變異菌率下降至66.39%,BC量提高至0.15 g/L;瓊脂量增加至0.10%時(shí),變異菌沒(méi)有出現(xiàn),此時(shí)BC產(chǎn)量達(dá)到最高,為0.34 g/L,與靜態(tài)培養(yǎng)中添加0.05%瓊脂的培養(yǎng)液中產(chǎn)量(0.38 g/L)相當(dāng)。另外,因?yàn)榄傊黾恿伺囵B(yǎng)液粘度,從而削弱剪切力對(duì)菌體產(chǎn)BC的不利影響[15-17]。但盡管培養(yǎng)液中添加0.10%瓊脂阻止了變異菌的出現(xiàn),但如果連續(xù)轉(zhuǎn)接至第2次時(shí),變異菌也會(huì)產(chǎn)生,往往經(jīng)3～4次轉(zhuǎn)接后,培養(yǎng)液中幾乎都是變異菌(見(jiàn)圖2)。

圖2 K. xylinus轉(zhuǎn)接培養(yǎng)中的正常菌和變異菌的數(shù)量變化Fig.2 Changes in numbers of wild type and mutants during series of transfer passage cultures of K. xylinus

靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式中,添加適量瓊脂阻止K.xylinus的自發(fā)變異,因而增加了BC產(chǎn)量。靜態(tài)培養(yǎng)中,0.05%瓊脂培養(yǎng)液連續(xù)轉(zhuǎn)接9次也沒(méi)有出現(xiàn)變異菌株。動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中,0.05%瓊脂培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接過(guò)程中變異菌株易出現(xiàn),瓊脂的添加量增加至0.10%時(shí),初次培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接第一次時(shí),變異菌不會(huì)出現(xiàn),但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)接次數(shù),變異仍會(huì)發(fā)生。繼續(xù)提高瓊脂的量,培養(yǎng)液粘度過(guò)大而無(wú)法進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng)。

2.2 瓊脂對(duì)BC的DP及結(jié)晶度的影響

圖3顯示:靜態(tài)培養(yǎng)中,BC的聚合度(DP)為5.03×103,瓊脂添加量為0.05%和0.10%的培養(yǎng)基中則分別為4.83×103和4.96×103,由此可見(jiàn),靜態(tài)培養(yǎng)中,瓊脂對(duì)BC的DP影響不大(減小幅度皆小于4%);動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中,BC的DP為3.92×103,0.05%及0.10%瓊脂中BC的DP分別為3.61×103和2.95×103。由此可見(jiàn),培養(yǎng)方式會(huì)影響B(tài)C的DP,搖瓶生產(chǎn)的BC的DP比靜態(tài)生產(chǎn)的低,降低22.2%,培養(yǎng)基中添加瓊脂,會(huì)加劇DP的下降,當(dāng)瓊脂量為0.05%時(shí),比靜態(tài)的DP下降26.7%,瓊脂量為0.10%時(shí),下降幅度達(dá)42.2%。

圖3 瓊脂對(duì)BC的DP影響Fig.3 Effects of agar on DP of BC

靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中的BC在800～1500 cm-1范圍的的FT-IR圖譜見(jiàn)圖4和圖5,用基線(xiàn)量取峰高法測(cè)定BC的O’KI結(jié)晶指數(shù),結(jié)果如表2所示:對(duì)照(未添加瓊脂的靜態(tài)培養(yǎng))中的BC的結(jié)晶指數(shù)為3.14,這比文獻(xiàn)[21,23]報(bào)道的4.84要低,可能是菌株差異的緣故。

圖4 K. xylinus靜態(tài)培養(yǎng)中產(chǎn)生BC的FTIR譜圖Fig.4 FTIR spectrum of BC produced by K. xylinus in static culture

圖5 K. xylinus搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生BC的FTIR譜圖Fig.5 FT-IR spectrum of BC produced by K. xylinus in shaken culture

表2 瓊脂對(duì)K. xylinus產(chǎn)BC的結(jié)晶度影響Table 2 Effects of agar on O’KI index of BC produced by K. xylinus

表2可以看出:以未添加瓊脂的靜態(tài)產(chǎn)生BC的結(jié)晶指數(shù)為基準(zhǔn),靜態(tài)培養(yǎng)中,添加0.05%瓊脂,結(jié)晶指數(shù)降低至2.73,下降13.1%,當(dāng)瓊脂量增至0.10%時(shí),結(jié)晶指數(shù)為2.85,下降9.2%,其原因可能是高濃度的瓊脂,因粘度過(guò)大,不易滲透至氣-液界面的BC中,因而對(duì)纖維素的結(jié)晶過(guò)程干擾有限,從而與0.05%的瓊脂中的BC的結(jié)晶度相較而言,下降幅度略低(前者下降幅度13.1%,后者9.2%)。

動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中,未添加瓊脂中的結(jié)晶指數(shù)為2.54,下降19.1%,表明搖瓶培養(yǎng)降低了BC的結(jié)晶度。培養(yǎng)液中添加0.05%瓊脂,結(jié)晶指數(shù)下降至2.23,下降28.9%,當(dāng)瓊脂增加為0.10%時(shí),結(jié)晶指數(shù)為1.53,下降幅度達(dá)到最高51.3%?？梢?jiàn),搖瓶培養(yǎng)時(shí),添加瓊脂大大降低了BC的結(jié)晶指數(shù),其原因可能是搖瓶培養(yǎng)時(shí),瓊脂能更好地吸附于BC上從而嚴(yán)重干擾BC的結(jié)晶。

瓊脂對(duì)BC的結(jié)構(gòu)影響與培養(yǎng)方式有關(guān):從對(duì)DP影響的角度看:瓊脂在靜態(tài)培養(yǎng)中的影響較小(<4%),但在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中卻加劇DP下降;從對(duì)結(jié)晶度影響的角度看:瓊脂在兩種培養(yǎng)方式中都導(dǎo)致BC結(jié)晶度極顯著下降(P<0.01),只是相較靜態(tài)培養(yǎng),動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中下降的幅度更大。

2.3 瓊脂對(duì)培養(yǎng)液中K. xylinus的纖維素酶活力影響

靜態(tài)及搖瓶培養(yǎng)中皆檢測(cè)到纖維素酶活力(見(jiàn)圖6),這與Kenji等[24]的結(jié)論一致,兩種培養(yǎng)方式中,纖維素酶活力沒(méi)有差異,而瓊脂的添加對(duì)纖維素酶活力也沒(méi)有影響。

圖6 K. xylinus培養(yǎng)液中纖維素酶活力Fig.6 Activities of cellulase in K. xylinus culture

3 結(jié)論與討論

K.xylinus靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中,培養(yǎng)液中添加瓊脂阻止其發(fā)生自發(fā)變異,從而提高了BC產(chǎn)量,由于瓊脂靜態(tài)培養(yǎng)液連續(xù)轉(zhuǎn)接過(guò)程很穩(wěn)定,適合于制備種子液。結(jié)構(gòu)方面來(lái)說(shuō),瓊脂對(duì)靜態(tài)培養(yǎng)產(chǎn)生的BC的DP影響較小,但極顯著(P<0.01)下降BC的結(jié)晶度;對(duì)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中的BC的DP和結(jié)晶度都極顯著(P<0.01)下降。

Coucheron[25]發(fā)現(xiàn)G.xylinusATCC 23769(或K.xylinusATCC 23769)中具有插入序列IS1031,該序列的存在導(dǎo)致K.xylinus易變異,當(dāng)培養(yǎng)條件改變時(shí),產(chǎn)BC的正常菌(Cellulose+,Cel+)或不產(chǎn)BC的變異菌(Cellulose-,Cel-)具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì):a.靜態(tài)培養(yǎng)時(shí),BC膜使Cel+漂浮在氧氣充足的氣-液界面,而Cel-則處于液體中,因缺氧而漸亡[26]。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),靜態(tài)培養(yǎng)中,氣-液界面有完整BC膜(0.05%和0.10%瓊脂及泡沫顆粒培養(yǎng)液)的培養(yǎng)液中沒(méi)有出現(xiàn)變異菌,而無(wú)完整BC膜(對(duì)照)的培養(yǎng)液中分離到變異菌株,但對(duì)于為何對(duì)照實(shí)驗(yàn)中會(huì)產(chǎn)生不完整的BC膜尚無(wú)定論;b.動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí),充足的氧氣使Cel+過(guò)度生長(zhǎng),Cel-產(chǎn)生的概率增加,同時(shí)Cel+被所形成的BC包裹,而Cel-呈游離狀態(tài),轉(zhuǎn)接時(shí)吸取的液體中,Cel-占有數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì),所以多次轉(zhuǎn)接后只剩下Cel-[27]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中易出現(xiàn)變異菌株,培養(yǎng)液中變異菌的百分含量隨轉(zhuǎn)接次數(shù)的增加而增加直至全部為變異菌,但0.10%瓊脂加入至培養(yǎng)液中時(shí),盡管瓊脂干擾了BC球的形成,使BC呈粉狀,按上述觀點(diǎn),轉(zhuǎn)接過(guò)程中Cel+和Cel-應(yīng)共存,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示轉(zhuǎn)接至第四次時(shí),培養(yǎng)液中只有Cel-;Jung等通過(guò)透射電鏡證明,Cel-比Cel+有更完整的雙層膜結(jié)構(gòu),動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí),Cel-能承受剪切力而得以富集[28]。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)液添加0.10%瓊脂在初次培養(yǎng)時(shí)只有Cel+,轉(zhuǎn)接一次時(shí),也只有Cel+,且總量與初次培養(yǎng)時(shí)相近,說(shuō)明0.10%瓊脂足以消除剪切力對(duì)Cel+破壞,但隨后的轉(zhuǎn)接過(guò)程中Cel+卻逐漸消失。

瓊脂對(duì)K.xylinus自發(fā)變異的控制的可能原因在于瓊脂消除了BC對(duì)細(xì)胞的脅迫:靜態(tài)培養(yǎng)時(shí),一方面,氣-液界面層是菌體生長(zhǎng)繁殖最活躍層,菌體分泌出BC后,BC仍附著在細(xì)胞膜上[1],而B(niǎo)C的密度(3.2 g/L)促使攜帶BC的細(xì)胞沉降,另一方面,K.xylinus是嚴(yán)格好氧菌[6],有向氣-液界面上浮的趨勢(shì),于是攜帶BC的菌體處于反復(fù)的沉-浮運(yùn)動(dòng)狀態(tài),BC就成為細(xì)胞的負(fù)擔(dān)或脅迫,該脅迫促使相關(guān)的維素合成酶的基因序列或表達(dá)向著不產(chǎn)BC方向變異。靜態(tài)培養(yǎng)中,培養(yǎng)液在培養(yǎng)容器中的高度是導(dǎo)致變異發(fā)生的關(guān)鍵因素:淺層培養(yǎng)時(shí),BC的產(chǎn)生及膜的形成縮小甚至消除了細(xì)胞沉-浮運(yùn)動(dòng)的空間,因而消除了BC脅迫;深層培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞沉-浮運(yùn)動(dòng)有足夠的空間,長(zhǎng)時(shí)間的BC脅迫導(dǎo)致變異發(fā)生,Cel-一旦產(chǎn)生,便占據(jù)氣-液界面,與正常菌在營(yíng)養(yǎng)和空間上競(jìng)爭(zhēng),致BC膜不能完整形成。吳謙等[13]的實(shí)驗(yàn)也表面靜態(tài)培養(yǎng)中的變異與培養(yǎng)液在培養(yǎng)容器中的高度緊密相關(guān)。瓊脂增加液體的粘度而抑制細(xì)胞的沉-浮行為,泡沫顆粒使菌體被固定在氣-液界面而消除細(xì)胞的沉-浮行為,因此靜態(tài)培養(yǎng)中,培養(yǎng)液中添加瓊脂或者泡沫顆粒就能控制K.xylinus自發(fā)變異;動(dòng)態(tài)培養(yǎng)時(shí),一方面,0.10%瓊脂使BC的結(jié)晶度極顯著(P<0.01)下降,同時(shí),纖維素酶更易和BC接觸,這兩個(gè)因素使BC極易被纖維素酶水解,從而使BC的聚合度極顯著下降。低聚合度意味著低BC脅迫,從而抑制K.xylinus在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中的變異,但轉(zhuǎn)接培養(yǎng)導(dǎo)致低BC脅迫長(zhǎng)時(shí)間存在,故變異發(fā)生。