肺炎克雷伯菌CRP蛋白表達與純化及生物學(xué)特征分析

徐 麗,邱雪梅,駱海龍,3,楊 靖,李 蓓,汪靜杰,4,*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖北十堰 442000; 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院,湖北十堰 442000; 3.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)與工程學(xué)院,湖北十堰 442000; 4.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點實驗室,湖北十堰 442000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)屬腸桿菌科,為革蘭氏陰性菌,在自然界中分布廣泛,也可寄居人體的呼吸道、腸道、鼻咽等多個部位[1-3]。研究表明可從零售肉類、海產(chǎn)品、蔬菜及家畜體內(nèi)分離得到肺炎克雷伯菌[4-8],可經(jīng)污染食品或吸入等途徑進入腸道造成機體感染[5,7]。肺炎克雷伯菌是導(dǎo)致院內(nèi)感染中最為流行的致病因子之一,還能引發(fā)社區(qū)獲得性感染[9-10];所致感染包括化膿性肝膿腫、肺炎、尿道等,同時還可引起腦膜炎、眼內(nèi)炎等并發(fā)癥[11-12]。肺炎克雷伯菌作為院內(nèi)感染中6種危害性最大的病原菌之一,其威脅程度僅次于大腸埃希菌[13-14]。故研究揭示肺炎克雷伯菌的致病及調(diào)控機制具有重要意義。

細菌轉(zhuǎn)錄因子在其生長代謝及毒力等方面具有重要作用,通過調(diào)控特定靶基因而發(fā)揮相應(yīng)功能。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等眾多細菌中均存在由轉(zhuǎn)錄因子間、轉(zhuǎn)錄因子與靶基因間組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò),能參與其生長、毒力及生物膜形成等許多生物過程而發(fā)揮重要作用[15-16]。肺炎克雷伯菌作為腸道致病細菌,可污染食物與肉類通過食源途徑引起感染,嚴重威脅人的健康[5-6]。研究肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,尤其是在致病性及與腸道因子互作過程中具體調(diào)控功能,對于揭示肺炎克雷伯菌致病機制具有重要作用。

肺炎克雷伯菌中存在較多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,如RcsCDB、TreC、Fur、MhbR等參與調(diào)控毒力因子的表達及其致病性[17-22]。肺炎克雷伯菌crp基因(KP1_RS23625)編碼的環(huán)磷酸腺苷受體(Cyclic AMP receptor protein,CRP)蛋白;CRP為全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在較多細菌中普遍存在且與病原菌致病性密切相關(guān),如鼠疫耶爾森菌、霍亂弧菌的CRP蛋白可調(diào)控毒力因子靶基因的表達,促進細菌致病性[23-24]。研究表明肺炎克雷伯菌CRP蛋白能調(diào)控其毒力因子莢膜、菌毛等以影響細菌毒力,還可使細菌逃逸宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用[25]。肺炎克雷伯菌CRP調(diào)控相關(guān)靶基因的具體機制不甚清楚,有待深入研究;且目前關(guān)于CRP蛋白功能、結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)等特征尚不明確。為了進一步揭示全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CRP調(diào)控肺炎克雷伯菌毒力的機制,本研究克隆了crp基因并成功構(gòu)建CRP蛋白的外源重組表達載體pET-28a-crp。同時進行了重組蛋白的原核誘導(dǎo)表達與純化,并通過生物信息手段對CRP蛋白相關(guān)的多個重要特征與指標進行了預(yù)測分析;以期為后續(xù)肺炎克雷伯菌CRP蛋白的生物學(xué)功能及其致病調(diào)控機制研究提供重要參考,同時也為預(yù)防食源性肺炎克雷伯菌的感染性疾病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肺炎克雷伯菌(NTUH-K2044) 分離自臨床肝膿腫患者,為K1血清型,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所贈送;大腸埃希菌BL21(DE3)和DH5(及表達質(zhì)粒pET-28a 由本實驗室保存;酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂 英國Oxoid公司;T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、dNTPs Takara公司(中國大連);核酸產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、Ni-NTA柱 德國Qiagen公司;限制性內(nèi)切酶BamHI和HindIII 美國NEB公司;蛋白分子質(zhì)量Marker 美國Thermo Fisher公司;核酸分子質(zhì)量Marker、蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液 中國碧云天公司;PCR擴增引物 上海生工生物公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;THZ-82B型恒溫搖床 常州國旺儀器設(shè)備有限公司;5424R高速離心機 德國Eppendorf公司;恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 利用Primer 5.0軟件設(shè)計crp基因序列上下游引物,同時在引物兩端分別添加BamHI和HindIII酶切位點及相應(yīng)的保護堿基,引物對詳細序列為:GCGGGATCCATGGTGCTTGGC AAACCG/GCGAAGCTTTTAACGGGTGCCGTAGACG;下劃線處分別為BamHI與HindIII酶切位點。

1.2.2 克隆載體的構(gòu)建與驗證 以肺炎克雷伯菌野生株的基因組DNA為模板進行PCR擴增,獲得crp基因編碼區(qū)片段。提取pET-28a質(zhì)粒,分別對pET-28a和PCR產(chǎn)物進行雙酶切,酶切產(chǎn)物用試劑盒純化回收,然后利用T4連接酶將純化回收的pET-28a與PCR產(chǎn)物在室溫下連接4 h。制備大腸埃希菌 BL21 感受態(tài)細胞,并通過化學(xué)熱激法將連接產(chǎn)物pET-28a-crp轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞內(nèi),轉(zhuǎn)化產(chǎn)物立即37 ℃,200 r/min,活化2 h,取200 μL涂布于含卡那霉素的LB固體平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落100 ℃,10 min取上清作為模板,以方法1.2.1中引物對進行PCR擴增,瓊脂糖電泳鑒定重組克隆菌;將結(jié)果陽性的單克隆菌進一步測序驗證。

1.2.3 CRP蛋白的表達與純化 挑取測序驗證正確、無突變的陽性克隆接種于含卡那霉素的3 mL LB肉湯中,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)過夜,取1 mL菌液轉(zhuǎn)接于加入200 mL LB肉湯中,繼續(xù)培養(yǎng)3～6 h至對數(shù)期,加1 mmol/L IPTG后20 ℃,110 r/min,誘導(dǎo)表達6 h,8000 r/min,2 min收集菌體加入預(yù)冷的PBS重懸洗滌兩次,加入15 mL Lysisbuffer充分混勻菌體,在冰浴中超聲破碎細菌,4 ℃,12000 r/min離心30 min,取上清液。

將上清液經(jīng)預(yù)冷裂解液平衡過的鎳柱Ni-NTA緩慢地流下3～5次,用pH9.5的Washbuffer(咪唑濃度分別為20和40 mmol/L)梯度法洗去雜蛋白,隨后用洗脫液(含250 mmol/L的咪唑)洗下目的蛋白,并將洗脫的蛋白溶液加入透析袋以PBS透析過夜獲取純化蛋白,通過BSA法蛋白定量后分裝、-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量純化的CRP蛋白按比例與蛋白上樣緩沖液混勻,100 ℃水浴10 min,12000×g離心10 min后取15 μL上清液加至12% SDS-PAGE膠中進行蛋白電泳,考馬斯染色、脫色后分析蛋白純度。

1.2.4 CRP蛋白生物信息學(xué)分析 運用ProtParam分析CRP蛋白的理化性質(zhì);Protscale分析蛋白的疏水性;SignalP4.1 Service分析蛋白的信號肽;TMHMM Server v.2.0分析蛋白的跨膜區(qū)域;SOPMA預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu);SWISS-MODEL對CRP蛋白進行三級結(jié)構(gòu)同源建模;利用NCBI的CDD(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫預(yù)測CRP蛋白的結(jié)構(gòu)域;Net Phos 3.1 Sever 在線工具預(yù)測CRP蛋白的磷酸化位點;利用ATRING 11.0數(shù)據(jù)庫分析與CRP蛋白的互作蛋白。

1.3 數(shù)據(jù)處理

蛋白濃度測定采用BSA方法,每組重復(fù)3次;蛋白三級結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL在線軟件基于與數(shù)據(jù)庫中已知結(jié)構(gòu)比對利用串線法運算建模;蛋白磷酸化位點分析基于Net Phos 3.1 Sever軟件對目的蛋白氨基酸包含的殘基與激酶位點預(yù)測數(shù)值進行String 字符串算法。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-28a-crp的構(gòu)建及鑒定

以肺炎克雷伯菌的DNA為模板,PCR擴增crp基因,電泳檢測其大小約600 bp。將PCR產(chǎn)物純化連接至表達質(zhì)粒pET-28a,獲得重組載體pET-28a-crp,挑取單菌落進行PCR驗證和測序驗證重組載體構(gòu)建成功。PCR結(jié)果如圖1所示,且重組質(zhì)粒目的基因片段測序結(jié)果與肺炎克雷伯菌crp基因序列大小一致,說明重組表達載體構(gòu)建成功。

圖1 克隆PCR的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of crp gene PCR amplification注:M:DL2000 DNA Maker,1:PCR擴增crp基因產(chǎn)物。

2.2 CRP蛋白的表達純化

肺炎克雷伯菌CRP蛋白由菌株的crp基因編碼,預(yù)測的分子量為23.655 kDa(Dalton,Da)。按照方法1.2.3的步驟表達并純化獲得了CRP蛋白(圖2),SDS-PAGE電泳檢測所得目的蛋白分子量大小與通過DNAStar軟件分析預(yù)測的重組蛋白總大小相符,約為27 kDa(包括組氨酸標簽蛋白等約4 kDa)、蛋白純度,且具有較高濃度(約為0.8 mg/mL),說明本研究中采用的原核表達純化目的蛋白方法合適、滿足實驗要求,可為候選深入研究CRP對候選基因的調(diào)控作用以及與宿主互作、肺炎克雷伯菌感染疾病的防控靶點研究奠定基礎(chǔ)。

圖2 純化CRP蛋白的電泳結(jié)果Fig.2 Purified CRP protein was analyzed by SDS-PAGE注:M:蛋白分子質(zhì)量標準;1:CRP重組蛋白。

2.3 CRP蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 CRP蛋白的基本理化性質(zhì) 利用ExPASy中的ProtParam軟件預(yù)測CRP蛋白的分子式為C1049H1703N291O309S10,相對分子質(zhì)量為23656.43,理論等電點(pI)為8.38,原子總量為3362;哺乳動物體外半衰期約為30 h,酵母體內(nèi)>20 h,大腸埃希菌體內(nèi)>10 h。不穩(wěn)定系數(shù)為31.78,小于穩(wěn)定蛋白閾值40,說明CRP為穩(wěn)定蛋白;親水性平均系數(shù)為-0.222,可能為親水性蛋白;脂肪族指數(shù)為97.48。

CRP蛋白由20種氨基酸構(gòu)成,其中Ile(I)含量占8.1%,Leu(L)含量占10.5%,Trp(W)含量占1.0%,具體見表1;帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為26,帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為24。

利用Protscale在線分析CRP蛋白的親水性,選用Kyte & Doolittle模式計算方法,設(shè)置氨基酸親水與疏水性峰值分析圖譜間隔的長度值為21,所得結(jié)果見圖3;圖3中負值“低谷”峰區(qū)域表示親水峰,正值高峰區(qū)域代表疏水峰,根據(jù)所預(yù)測氨基酸的親水峰與疏水峰值綜合結(jié)果可知,CRP蛋白序列中親水的氨基酸區(qū)域多于疏水區(qū)域,且親水峰的數(shù)值總體上高于疏水峰的值;表明CRP蛋白為親水蛋白,與ProtParam預(yù)測結(jié)果一致;同時通過原核誘導(dǎo)表達、純化及電泳檢測獲得可溶性目的蛋白結(jié)果所驗證。

表1 CRP蛋白質(zhì)的氨基酸組成分布情況Table 1 Amino acid composition of CRP protein

圖3 CRP蛋白的親水性分析Fig.3 Hydrophilicity analysis of CRP protein

2.3.2 CRP蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽 利用TMHMM Server v.2.0軟件對CRP蛋白的跨膜拓撲結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,預(yù)測的跨膜螺旋數(shù)值為0,說明CRP蛋白不存在跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。Exp number of AAs in TMHs(預(yù)期的膜內(nèi)螺旋氨基酸數(shù))為0.00166(數(shù)值>18可能為跨膜蛋白),說明CRP蛋白為非跨膜蛋白(圖4)。利用SignalP 4.0 Server軟件對CRP蛋白的信號肽進行預(yù)測分析,結(jié)果見圖5,圖5中所示表征含信號肽的參數(shù)S值(信號肽長度預(yù)測值)、C值(氨基酸切割位點數(shù)值)、Y值(S值與C值組合)均較低;此外D值(S值與Y極值的加權(quán)平均值)為0.119,小于含信號肽蛋白D值的基本值0.500。綜合以上結(jié)果,說明目的蛋白無信號肽,不屬于分泌蛋白。

圖4 CRP蛋白的跨膜螺旋區(qū)預(yù)測Fig.4 Transmembrane domain prediction of CRP protein

圖5 CRP蛋白的信號肽預(yù)測Fig.5 Signal peptide predictionof CRP protein

2.3.3 CRP蛋白的二級結(jié)構(gòu) 利用SOPMA在線分析對CRP蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,結(jié)果見圖6。CRP蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋(Alpha helix,Hh)占43.81%,延伸鏈(Extended strand,Ee)占23.33%,β-轉(zhuǎn)角(Beta turn,Tt)占7.62%,無規(guī)則卷曲(Random coil,Cc)占25.24%。

圖6 CRP蛋白的二級結(jié)構(gòu)Fig.6 Schematic diagram of secondary structure of CRP protein注:藍、紫、紅、綠區(qū)域分別代表α-螺旋、 無規(guī)卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角。

2.3.4 CRP蛋白的三級結(jié)構(gòu) 利用ExPASy中SWISS-MODEL蛋白數(shù)據(jù)庫對CRP蛋白進行三級結(jié)構(gòu)同源建模,模板序列為1g6n.1.A,序列相似度為99.52%,結(jié)果見圖7。

圖7 CRP蛋白的三維模型Fig.7 Three-dimensional model of CRP protein

2.3.5 CRP蛋白的結(jié)構(gòu)域 利用NCBI的CDD(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫預(yù)測CRP蛋白的結(jié)構(gòu)域,結(jié)果見圖8。CRP蛋白含有一個結(jié)構(gòu)域,屬于PRK11753超級家族。

圖8 CRP蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.8 Prediction of the domain of CRP protein

2.3.6 CRP蛋白磷酸化位點 利用Net Phos 3.1 Sever 在線工具預(yù)測CRP蛋白的磷酸化位點,結(jié)果見圖9。CRP蛋白有多個磷酸化位點,磷酸化能力超閾值的有9個絲氨酸,6個蘇氨酸,5個酪氨酸,即CRP蛋白共有20個磷酸化位點,unsp(26/41/42/91/99/100/118/129)、PKC(29/91/99/141/169/183)、Cdc2(180)、INSR(24)、SRC(41)、PKA(47)、DNAPK(119)、RSK(119)。

圖9 CRP蛋白的磷酸化位點預(yù)測Fig.9 Prediction of phosphorylation site of CRP protein

2.3.7 CRP蛋白的交互作用 利用ATRING 11.0交互式數(shù)據(jù)庫對CRP蛋白進行蛋白質(zhì)交聯(lián)分析,結(jié)果顯示:JG24-23620為其同源蛋白,且與CRP蛋白作用的蛋白質(zhì)主要為RNA聚合酶σ因子rpoD與rpoS、RNA聚合酶α亞基rpoA、RNA聚合酶β亞基rpoB 與JG24-26820、RNA聚合酶ω亞基rpoZ,及腺苷酸環(huán)化酶cyaA、假定蛋白JG24-23625、環(huán)磷酸腺苷磷酸二酯酶JG24-21680、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子JG24-26120等。CRP作為細菌全局轉(zhuǎn)錄因子在其生長與毒力方面可發(fā)揮眾多重要作用[23-25],基于此并結(jié)合該交互分析結(jié)果暗示CRP蛋白發(fā)揮相關(guān)功能時可能協(xié)同其他多個蛋白參與特定的生理生化途徑。

圖10 CRP蛋白的相互作用蛋白預(yù)測Fig.10 Interaction protein prediction of CRP protein

3 結(jié)論

肺炎克雷伯菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CRP蛋白與毒力密切相關(guān),且CRP正調(diào)控細菌致病性以及重要的毒力因子菌毛與莢膜的生成。結(jié)合以上研究背景,本研究首先克隆crp基因并成功構(gòu)建外源重組蛋白表達載體,同時誘導(dǎo)蛋白表達、純化出了目的蛋白;進一步利用生信方法對CRP蛋白的生理生化特征進行了預(yù)測分析,結(jié)果顯示:CRP蛋白為親水蛋白,與體外誘導(dǎo)表達后為可溶性表達形式檢測結(jié)果一致;無信號肽、跨膜區(qū)域;屬PRK11753超家族蛋白;二級結(jié)構(gòu)較松散,主要由α螺旋與不規(guī)則卷曲構(gòu)成;含有多個磷酸化位點,可與包括具有重要調(diào)控功能在內(nèi)的多個蛋白發(fā)生互作,推測與CRP蛋白作為全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在發(fā)揮多種調(diào)控功能過程中協(xié)同其他蛋白質(zhì)發(fā)揮重要作用有關(guān)。本研究所獲得CRP蛋白的一些關(guān)鍵生物學(xué)特征的結(jié)果可為后續(xù)肺炎克雷伯菌CRP功能與致病機制研究提供理論依據(jù),也為其感染疾病的防控奠定了基礎(chǔ)。