煮制時(shí)間對(duì)鵝肉蛋白結(jié)構(gòu)的影響

陳春梅,周惠健,沈銀涵,陸辰燕,劉 瑞,于 海,2,*,席 軍,林廣桃

(1.揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院,食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225000; 2.江蘇省淮揚(yáng)菜產(chǎn)業(yè)化工程中心,江蘇揚(yáng)州 225000; 3.江蘇長壽集團(tuán)有限公司,江蘇南通 226000; 4.江蘇省長壽特色肉制品加工工程技術(shù)研究中心,江蘇南通 226000; 5.揚(yáng)州星月農(nóng)產(chǎn)品有限公司,江蘇揚(yáng)州 225000)

近年來,消費(fèi)者對(duì)不同禽肉的需求不斷增加。同樣,消費(fèi)者從人類健康的角度尋找高質(zhì)量的肉類。從鵝肉的營養(yǎng)價(jià)值來看,其富含蛋白質(zhì)、維生素及無機(jī)鹽等,其中蛋白質(zhì)含量高達(dá)22.3%,脂肪含量僅為11%,不飽和脂肪酸含量高及膽固醇含量低[1],能夠很好的滿足人們的健康需求。相比較其他禽肉,鵝肉在外觀、質(zhì)地、口感等方面都占有一定的優(yōu)勢。Hamadani等[2]比較了鵝肉、雞肉和羊肉品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在整體接受度方面,消費(fèi)者更喜歡鵝肉。

肉在加熱過程中會(huì)發(fā)生一系列變化,而這些變化是由負(fù)責(zé)肉類質(zhì)量屬性的蛋白質(zhì)變化引起的[3]。熱處理可引起肌肉結(jié)構(gòu)的變化,主要是由于蛋白質(zhì)的變性。變性蛋白的疏水基團(tuán)暴露,導(dǎo)致蛋白的溶解度降低,肉的持水能力下降,影響肉的質(zhì)地[4]。蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生游離氨基酸不僅是重要的滋味物質(zhì),而且它們還會(huì)與其他物質(zhì)繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[5]。

目前,加熱對(duì)肉類品質(zhì)的影響已有相關(guān)報(bào)道。萬紅兵等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)牛肉的中心溫度高于80 ℃時(shí),隨著加熱時(shí)間的延長,牛肉嫩度值會(huì)下降。李思寧等[7]使用微波加熱的方式對(duì)牦牛肉進(jìn)行了處理,發(fā)現(xiàn)在功率一致的情況下,隨著加熱時(shí)間的延長,牛肉的損失率和剪切力增大(P<0.05),肌纖維出現(xiàn)了斷裂,肌束變得更加混亂。計(jì)紅芳等[8]研究了加熱溫度對(duì)鵝肉品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)溫度升高會(huì)導(dǎo)致增大蒸煮損失率、破壞肌纖維結(jié)構(gòu),最終得到較低的剪切力及較高的彈性。但是,關(guān)于鵝肉在加熱過程中發(fā)生的變化的研究幾乎沒有,因此本研究的目的就是為了模擬家庭燉煮過程中鵝肉蛋白發(fā)生的相關(guān)變化。本文研究了不同煮制時(shí)間對(duì)鵝肉對(duì)蒸煮損失率、剪切力、蛋白電泳、MFI、游離氨基酸及微觀結(jié)構(gòu)的影響,以揭示煮制時(shí)間對(duì)鵝肉蛋白特性的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一年鵝齡的揚(yáng)州老鵝,重量為4～5 kg 當(dāng)天購于揚(yáng)州歌鵝業(yè)發(fā)展有限公司;17種氨基酸1 nmol/μL標(biāo)準(zhǔn)品(天門冬氨酸、組氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸)、OPA、FMOC 均購于Sigma公司。

Ultra Turrax T25BASIS高速勻漿機(jī) 德國IKA公司;INFINITE 200 PRO多功能酶標(biāo)儀 美國Tecan公司;Sorvall ST 16R高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾科技公司;XL-30 ESEM環(huán)境掃描電子顯微鏡 荷蘭Philips公司;TMS-Pro食品質(zhì)構(gòu)儀 美國TMS公司;SC-80C全自動(dòng)色差儀 北京康光光學(xué)儀器有限公司;Gel DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂有限公司;GC-MS聯(lián)用儀(氣相色譜儀TRACE 1300,質(zhì)譜儀 ISQ LT) 美國Trace公司;LM 3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 北京天翔飛域科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 將鵝胸肉切成5 cm×5 cm×3 cm大小的塊狀,電磁爐設(shè)置溫度為100 ℃,所有樣品均冷水下鍋進(jìn)行焯水處理(3 min)。洗去浮沫后,使用濾紙出去多余水,在肉水比為1∶3的條件下進(jìn)行煮制。分別煮制0、30、60、90、120 min進(jìn)行3次重復(fù)分析測試。

1.2.2 蒸煮損失率 將樣品修整后使用濾紙擦干表面水分并記錄重量(m1),后將樣品按照上述方法進(jìn)行處理,取出處理后的樣品用濾紙擦干表面水分并記錄質(zhì)量(m2)。根據(jù)式(1)計(jì)算蒸煮損失率。

式(1)

式中:m1為蒸煮前擦干表面水分后的質(zhì)量,g;m2為蒸煮后擦干表面水分后的質(zhì)量,g。

1.2.3 剪切力的測定 測定前將樣品沿肌纖維方向切成10 mm×10 mm×30 mm,使用數(shù)顯式肌肉嫩度儀進(jìn)行測定。

1.2.4 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳 參照Han等[9]的方法。取肉樣1 g,剔除可視的結(jié)締組織和脂肪,切碎后,加4 mL 4 ℃的緩沖溶液A(30 mmol/L K2HPO4、30 mmol/L KH2PO4、1% TritonX、2 mmol/L EDTA、0.05%β-巰基乙醇、0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟,pH6.5)低速勻漿1 min,8800×g離心15 min,去上清液。沉淀用2 mL緩沖溶液B(100 mmol/L K2HPO4、100 mmol/L KH2PO4、0.7 mol/L KI、0.05%β-巰基乙醇,pH6.5),10000×g離心20 min。肌原纖維蛋白濃度用雙縮脲法測定。

將6 mg/mL肌原纖維蛋白樣品與2×上樣緩沖液以體積比1∶1混勻,于100 ℃下水浴10 min。采用4%濃縮膠、15%分離膠,上樣量為15 μL。濃縮膠時(shí)電壓90 V(30 min),分離膠時(shí)電壓120 V(60 min)。停止電泳后,取下膠使用考馬斯亮藍(lán)染色溶液進(jìn)行染色、搖床脫色及拍照成像。

1.2.5 MFI測定 參考Wang等[10]的方法稍作修修改。將肌肉組織在液氮中粉碎,稱取0.5 g肉,30 mL 25 mmol/L磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L KCl,1 mmol/L EGTA,pH7.0)冰浴勻漿(11000 r/min,60 s,每次10 s,中間間隔10 s)。勻漿后離心(1000×g、15 min、4 ℃)并棄掉上清液,再次加入30 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液將沉淀充分懸浮。再離心(1000×g、15 min、2 ℃)并棄掉上清液,沉淀用30 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液充分懸浮后,再用30 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液沖洗離心管并過濾,合并濾液得肌原纖維蛋白懸浮液。將蛋白質(zhì)濃度稀釋至0.5 mg/mL,并在540 nm下通過分光光度法測吸光度。MFI的計(jì)算方法是將讀數(shù)乘以150。

1.2.6 游離氨基酸的測定 參照常亞楠等[11]的方法略作修改,稱取一定量的待測樣品,用絞肉機(jī)絞碎并稱取5.0 g樣品,置于離心管中,加入去離子水30 mL,冰浴中于15000 r/min速率下勻漿3次(每次10 s,間隔10 s),加入20 mL 5%(v/v)三氯乙酸(TCA)水溶液,混合均勻,于4 ℃下放置12 h;以定性濾紙過濾,濾液先用4 mol/L KOH調(diào)pH至9.0,然后用去離子水定容至50 mL,取5 mL用0.45 μm濾膜過濾。上清液使用高效液相色譜進(jìn)行檢測,進(jìn)樣體積為20 μL。

離子交換色譜條件:Agilent Hypersil ODS柱(4.0 mm×250 mm×5 μm);反應(yīng)柱溫度40 ℃;紫外檢測器(VWD)檢測波長為338 nm,脯氨酸以262 nm檢測;流動(dòng)相流速為1.0 mL/min;氨基酸含量以外標(biāo)法定量。

洗脫程序:流動(dòng)相A(pH=7.2):27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃(500∶0.11∶2.5),流動(dòng)相B(pH=7.2):80.9 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈(1∶2∶2),流動(dòng)相流速:1.0 mL/min;檢測器:紫外檢測器(VWD),檢測波長為338 nm,其中脯氨酸的檢測波長為262 nm。

1.2.7 掃描電子顯微鏡樣品的制備和觀察 將樣品用液氮冷凍固定,用手術(shù)刀將樣品切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉粒,用2.5%戊二醛(由體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛溶液與0.1 mol/L pH6.8的磷酸鹽緩沖液按照1∶9 (V/V)混合)于4 ℃冰箱中固定12 h;漂洗:用pH6.8的磷酸緩沖液漂洗三次,每次15 min;鋨酸固定:在含1.0%四氧化鋨的磷酸緩沖液(pH6.8)中后固定2 h;再次漂洗:用0.1 mol pH6.8的磷酸緩沖液漂洗三次,每次10 min;脫水:分別用濃度為30%、40%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇進(jìn)行脫水,每次15 min,100%乙醇脫水兩次,每次15 min。脫完水以后用鑷子將樣品取出。粘樣:將樣品撕面作為觀察面,觀察面向上,用導(dǎo)電膠帶粘在掃描電鏡樣品臺(tái)上;鍍膜:用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍上一層15 nm厚的金屬膜;在掃描電鏡下觀察并拍照(加速電壓為5.00 kV)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行3次重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,均值之間采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較,在0.05水平上進(jìn)行顯著檢驗(yàn)(P<0.05),并使用SigmaPlot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煮制時(shí)間對(duì)鵝肉蒸煮損失率的影響

肉在烹飪過程中因排出液體而發(fā)生重量的變化。這主要是由于熱引起的蛋白質(zhì)和脂肪的變化以及肉的結(jié)構(gòu)變化[12]。從圖1中可以看出,隨著煮制時(shí)間的延長蒸煮損失率顯著增加(P<0.05),且煮制120 min時(shí)的蒸煮損失率(39.0%)約為煮制0 min(27.5%)的1.5倍。

圖1 煮制時(shí)間對(duì)鵝肉蒸煮損失率的影響Fig.1 Influence of cooking time on cooking loss rate of goose meat注:小寫字母不同,表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 煮制時(shí)間對(duì)鵝肉剪切力的影響

嫩度是決定肉制品品質(zhì)的重要因素之一,是對(duì)肉中各種蛋白質(zhì)總體結(jié)構(gòu)的概述[13]。剪切力法是測定肉類嫩度最古老的方法之一[14]。從圖2中可以看出,從0～30 min剪切力顯著升高(P<0.05)且在30 min時(shí)達(dá)到最高值53.9 N。從30～60 min處剪切力呈現(xiàn)下降(P<0.05),于90 min處出現(xiàn)最低值34.0 N。其中,60與90 min處的剪切力差異不顯著。90～120 min時(shí)剪切力又呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05)。Ali等[15]認(rèn)為肌纖維之間與肌纖維內(nèi)部存儲(chǔ)大量水分。在加熱過程中,蒸煮損失率的升高寓意著水分的減少,從而影響了水分的分布,水分分布的差異會(huì)影響肉的嫩度[16]。

圖2 煮制時(shí)間對(duì)鵝肉剪切力的影響Fig.2 Influence of cooking time on shear force of goose meat注:小寫字母不同,表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 鵝肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜

肌原纖維蛋白由肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)球蛋白和肌球蛋白等組成,對(duì)肉制品的凝膠特性有重要影響[17]。250 kDa處蛋白條帶顏色隨煮制時(shí)間的延長而變淺;130 kDa處蛋白條帶顏色隨煮制時(shí)間的延長而變淺,到煮制120 min時(shí),條帶消失;100 kDa處蛋白條帶顏色隨煮制時(shí)間的延長而變淺;70 kDa處蛋白條帶在煮制30 min時(shí),顏色變深,然而隨著煮制時(shí)間的延長則變現(xiàn)出變淺至消失;35 kDa處蛋白條帶在煮制0 min時(shí)顏色淺,煮制60 min時(shí)出現(xiàn)明顯的加深,90 min后條帶開始變淺;35～55 kDa處條帶寬而清晰,隨著煮制時(shí)間的延長條帶逐漸成變淺而細(xì);10～15 kDa處條帶隨煮制時(shí)間延長顏色變深,可能是鵝肉在加熱過程中蛋白質(zhì)不斷發(fā)生降解,導(dǎo)致小分子量蛋白、多肽增加[18]。

圖3 煮制過程中鵝肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE of myofibrillar proteins in goose meat during cooking

2.4 鵝肉肌原纖維小片化指數(shù)的變化

MFI是反映肌肉細(xì)胞內(nèi)肌原纖維及其細(xì)胞骨架蛋白完整性的指標(biāo)之一,MFI值與肉的嫩度相關(guān)性較高[19]。如圖4所示,鵝肉的MFI值隨著煮制時(shí)間的延長呈增大的趨勢,表明加熱過程中鵝肉的肌纖維發(fā)生不同程度的斷裂和溶出。0～60 min處呈現(xiàn)顯著性上升的趨勢(P<0.05),但60與90 min之間差異不顯著,但到120 min又發(fā)生顯著性上升(P<0.05)，其MFI值約為處理0 min時(shí)的2倍。這可能是由于加熱處理破壞了肌原纖維的結(jié)構(gòu),加速了肌原纖維蛋白的降解,從而引起MFI的升高。

圖4 鵝肉煮制過程中肌原纖維小片化指數(shù)的變化Fig.4 Changes of myofibril fragmentation index in goose meat cooking注:小寫字母不同,表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 鵝肉游離氨基酸含量的變化

鵝肉煮制過程中游離氨基酸含量的變化,如表1所示,鵝肉中共檢出三種呈味氨基酸。從總量看,苦味氨基酸的含量最多,甜味氨基酸含量次之,鮮味氨基酸含量最少。從種類上看,甜味氨基酸共檢出5種,苦味氨基酸檢出9種,鮮味氨基酸檢出3種。煮制過程中,這三類氨基酸總含量總體表現(xiàn)為隨煮制時(shí)間的延長而增加的趨勢,而甲硫氨酸和半胱氨酸這兩者的含量隨煮制時(shí)間的延長而減少。

甜味氨基酸可以增加鵝肉的鮮味,對(duì)豐富鵝肉的滋味起到重要的作用。煮制120 min時(shí)甜味氨基酸的含量(108.32 mg/100 g)顯著高于0 min時(shí)(43.72 mg/100 g)(P<0.05),其中丙氨酸(Ala)、脯氨酸(pro)和甘氨酸(gly)含量較多,分別為35.64、30.17和15.63 mg/100 g。鵝肉煮制120 min時(shí)(163.31 mg/100 g)苦味氨基酸的含量顯著高于0 min(52.08 mg/100 g)(P<0.05),其中亮氨酸(leu)、絡(luò)氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(phe)和纈氨酸(val)的含量超過20 mg/100 g,這5種游離氨基酸的檢出量均顯著增加(P<0.05)。鮮味氨基酸是紅燒老鵝重要的呈鮮味物質(zhì),主要有天冬氨酸和谷氨酸。其中谷氨酸的含量最高,也是鵝肉檢出的17種游離氨基酸中含量最高的,是鵝肉重要的呈鮮物質(zhì)。半胱氨酸和甲硫氨酸屬于含硫氨基酸,含硫氨基酸能參與美拉德反應(yīng)對(duì)肉品肉香風(fēng)味的形成具有重要作用[20]。

表1 鵝肉煮制過程中游離氨基酸含量的變化Table 1 Changes of free amino acid content in goose meat during cooking

圖5 煮制過程中鵝肉微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of the microstructure of goose meat during cooking注:A為放大500倍,B為放大2000倍;1：煮制0 min;2:煮制30 min;3:煮制60 min;4:煮制90 min;5:120 min。

游離氨基酸對(duì)熟肉制品風(fēng)味和滋味起到重要作用[21],游離氨基酸可以作為前體物質(zhì)與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng),是生成肉類風(fēng)味的重要反應(yīng)。加熱時(shí)間對(duì)肉類的食用品質(zhì)有很大影響,肉類會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)變性、肌纖維收縮或膠原蛋白溶解[22]。隨著加熱時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)逐漸降解成多肽或游離氨基酸,因此降解產(chǎn)物中游離氨基酸的含量會(huì)增加。甲硫氨酸和半胱氨酸為含硫氨基酸,隨加熱時(shí)間的延長而減少,含硫氨基酸是形成肉香味的重要物質(zhì)[23]。

2.6 鵝肉加熱過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化

由圖5可知,煮制過程中,肌束排列規(guī)則性明顯地發(fā)了變化,使肌纖維之間的空隙表現(xiàn)出先變大后減小到粘成一塊。同時(shí),肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性也發(fā)生了變化,肌束膜在煮制過程中發(fā)生了不同程度的變化。煮制0 min時(shí)肌纖維束結(jié)構(gòu)完整、排列較為松散、肌束間界限分明且空隙較大、紋理清晰。煮制30 min時(shí),鵝肉組織結(jié)構(gòu)完整性遭到輕度破壞、肌纖維明顯收縮。煮制60 min時(shí),鵝肉肌纖維結(jié)構(gòu)開始變得疏松、肌內(nèi)膜開始破裂,肌束膜遭到破壞會(huì)導(dǎo)致肌肉組織完整性喪失,致密結(jié)構(gòu)被破壞,肌纖維束間空隙變小,使肌肉保水性下降,導(dǎo)致水分更易滲出而帶來嚴(yán)重的汁液流失。煮制90 min時(shí),肌纖維排列更加混亂、肌束間隙進(jìn)一步減小、肌纖維邊界更加模糊并伴有明顯的斷裂等。煮制120 min時(shí),蛋白進(jìn)一步降解及凝膠化加劇,導(dǎo)致肌束膜被嚴(yán)重破壞,進(jìn)而導(dǎo)致部分肌纖維束發(fā)生崩塌使它們相互黏成一塊,肌肉橫截面紋理也變得很不規(guī)則。據(jù)報(bào)道[24-25],隨著烹飪溫度的升高和時(shí)間的延長,結(jié)締組織會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的變性形成凝膠。這些變性凝膠和其他微粒物質(zhì)填補(bǔ)了空隙,導(dǎo)致肌肉緊繃。QI和Benjakul等[26-27]也在文中也提到了類似的結(jié)論,高溫加工會(huì)使肉的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化。

3 結(jié)論

本文研究了煮制時(shí)間對(duì)鵝肉蒸煮損失率、剪切力、游離氨基酸構(gòu)成、蛋白電泳及微觀結(jié)構(gòu)的影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著煮制時(shí)間的延長,蒸煮損失率逐漸增大,剪切力則呈現(xiàn)先上升后下降再上升的的趨勢,蛋白質(zhì)會(huì)降解成分子量更小的蛋白質(zhì)、多肽或游離氨基酸。游離氨基酸對(duì)熟肉制品風(fēng)味和滋味起到重要作用,隨著煮制時(shí)間的延長,蛋白質(zhì)逐漸降解成多肽或游離氨基酸,從總量看,苦味氨基酸的含量最多,甜味氨基酸含量次之,鮮味氨基酸含量最少。煮制過程中,這三類氨基酸總含量總體表現(xiàn)為隨煮制時(shí)間的延長而增加的趨勢。鮮味氨基酸是鵝肉中主要的呈鮮物質(zhì),甜味氨基酸能夠進(jìn)一步促進(jìn)鮮味。在電鏡圖中,肌束排列規(guī)則性明顯地發(fā)了變化,使肌纖維之間的空隙表現(xiàn)出先變大后減小到粘成一塊。同時(shí),肌纖維結(jié)構(gòu)的完整性也發(fā)生了變化,肌束膜在煮制過程中發(fā)生了不同程度的變化。肌纖維束間空隙變小,使肌肉保水性下降,水分滲出從而帶著更多的汁液流失。因此,鵝肉的煮制時(shí)間以90 min為宜。