枸杞多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎活性及NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用

馮 晨,于 洋

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121001)

枸杞(LyciumbarbarumL.)是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材,素有“紅寶”美稱,富含植物多糖、蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分?，F(xiàn)代科學(xué)研究顯示,枸杞具有降低血糖、延緩衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、神經(jīng)保護(hù)等藥理作用,而其藥理特性和生物活性與其主要成分枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)具有很大的相關(guān)性[1]。研究發(fā)現(xiàn),LBP在保護(hù)視力,免疫調(diào)節(jié),抗腫瘤抗衰老,保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[2]等方面具有重要作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著一種重要的巨噬細(xì)胞,被稱為小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia,MG),小膠質(zhì)細(xì)胞可處于靜息或激活兩種狀態(tài),在靜息狀態(tài),小膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有吞噬病變組織的能力,但可為神經(jīng)元分泌多種生長(zhǎng)因子,并能夠調(diào)節(jié)免疫功能;而在激活狀態(tài),輕度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可正常發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用,但過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放出大量的炎癥因子,一定程度上造成炎癥反應(yīng)加重,從而引起神經(jīng)元的炎癥損傷[3-4],而神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的主要誘發(fā)因素[5]。因此,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活可以減少炎癥因子的分泌,有利于消除神經(jīng)炎癥,這對(duì)治療常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病提供了新思路[6]。目前研究結(jié)果顯示,LBP在抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的釋放方面具有一定的作用。

關(guān)于LBP對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制是研究的熱點(diǎn),付松等[7-8]在細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LBP能經(jīng)HSP60-TLR-4途徑抑制LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體4(TLR-4)和熱休克蛋白60(HSP60),從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。王億龍等[9]觀察了枸杞多糖對(duì)放射性腦損傷海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用及氧化應(yīng)激和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)LBP能夠抑制放射性腦損傷海馬神經(jīng)元的凋亡,其作用可能與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和氧化應(yīng)激有關(guān),具備神經(jīng)保護(hù)作用,然而LBP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用及其機(jī)制還不清楚。

本研究以BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象,以LPS為激活劑激活靜息狀態(tài)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,以LBP為研究藥劑,進(jìn)行有關(guān)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞活力、炎癥因子、細(xì)胞中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、NF-κB信號(hào)通路的多重實(shí)驗(yàn),探索LBP的干預(yù)對(duì)細(xì)胞炎癥因子的影響,為神經(jīng)退行性病變的改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞多糖 北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào):SP9310純度≥50%;BV2小膠質(zhì)細(xì)胞系 上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，貨號(hào):C0147;脂多糖(LPS) 上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，貨號(hào)Js11060;MTT檢測(cè)試劑盒 英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)C0009;ELISA試劑盒(PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α) 上海卓康生物科技有限公司;BCA檢測(cè)試劑盒 上海睿時(shí)生物科技有限公司，貨號(hào)23225;ROS檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)s0033;鼠抗人p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65、羊抗鼠IgG單克隆抗體 上海博湖生物科技有限公司。

MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司;VS-840-1潔凈工作臺(tái) 博訊實(shí)業(yè)(上海)有限公司;DMIL熒光倒置顯微鏡 徠卡顯微鏡(上海)有限公司;Primo R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Heraeus公司;BYC2-24D垂直電泳槽(小型) 美國(guó)伯樂(lè)公司;UVP GDS-8000紫外凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 解凍BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104ind/mL,將100 μL細(xì)胞懸液接種在含有100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)3～4 h至貼壁生長(zhǎng)。

1.2.2 分組及給藥 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BV2細(xì)胞,計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整至1.0×106～2.0×106ind/mL,然后將細(xì)胞按1 mL每孔接種到96孔板。24 h后細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,棄培養(yǎng)基,PBS緩沖液漂洗2遍,實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control),激活組(LPS),實(shí)驗(yàn)組(200 μg/mL LBP+LPS、400 μg/mL LBP+LPS、600 μg/mL LBP+LPS、800 μg/mL LBP+LPS),每組均設(shè)5復(fù)孔。對(duì)照組添加相應(yīng)的培養(yǎng)基,激活組添加濃度為1 μg/mL的LPS溶液100 μL,實(shí)驗(yàn)組先用相應(yīng)濃度LBP預(yù)保護(hù)1 h,然后再用濃度為1 μg/mL的LPS溶液100 μL共同孵育,均在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.3 MTT法檢測(cè)LBP對(duì)細(xì)胞活力的影響 每孔去除培養(yǎng)基,加入10 μL的MTT溶液(5 mg/mL),置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μL,振蕩混勻后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率[10]。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)炎癥因子的分泌 收集每孔培養(yǎng)液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作來(lái)測(cè)定各組培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞上清液中炎性因子PGE2、IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)水平[11]。

1.2.5 H2DCFDA染色結(jié)合FCM檢測(cè)LBP對(duì)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響 每孔去除培養(yǎng)基,用終濃度為5 μmol/L的H2DCFDA染液,每孔200 μL染液避光室溫染色30 min。將細(xì)胞培養(yǎng)板中的染液收集于流式管,每孔再用100 μL終濃度為0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞30 min,將細(xì)胞板中的細(xì)胞收集于流式管中,每管加2 μL的PBS將細(xì)胞洗滌1遍,1000 r/min,4 ℃離心5 min,棄上清,用200 μL的PBS將細(xì)胞重懸,立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)[12]。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)各蛋白的表達(dá)

1.2.6.1 提取細(xì)胞總蛋白 收集細(xì)胞,PBS洗滌后,2500 r/min離心10 min。棄上清后用PBS洗滌干凈。加入10 μL磷酸酶抑制劑和2 μL蛋白酶抑制劑,以及200 μL PMSF的裂解液,冰上充分裂解30 min,4 ℃下將裂解液和細(xì)胞碎片混合物轉(zhuǎn)移到離心管中,10000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀于-20 ℃保存。

1.2.6.2 BCA法測(cè)蛋白定量 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液(牛血清蛋白)(0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL)。96孔板每組3個(gè)復(fù)孔,分別加入待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品。加入配制好100 μL的BCA工作液(1∶50),在60 ℃環(huán)境下反應(yīng)15 min,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出目標(biāo)樣品濃度。

1.2.6.3 蛋白變性、分離、轉(zhuǎn)膜和封閉 各組蛋白樣品調(diào)整至等濃度上樣,110 V恒壓電泳,待溴酚藍(lán)跑出可終止電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用5%牛奶室溫封閉活性基團(tuán)1 h。TBST洗膜3次每次10 min。

1.2.6.4 孵育 加入一抗(鼠抗人p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65單克隆抗體,體積稀釋比1∶1000)4 ℃孵育過(guò)夜后,TBST洗膜3次每次10 min。二抗(羊抗鼠IgG抗體,體積稀釋比1∶1000)室溫孵育1 h,洗膜3次每次10 min。

1.2.6.5 顯影 ECL化學(xué)發(fā)光液顯示,將ECL試劑盒中的A液和B液等體積混勻制成混合液,混合液與PVDF膜表面充分接觸1 min,將膜移至另一保鮮膜上,于暗室進(jìn)行顯影。采用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析蛋白條帶定量,并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0及Origin 5.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理比較,數(shù)據(jù)用Means±SD表示,組間數(shù)據(jù)對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有顯著意義。將數(shù)據(jù)通過(guò)Graphpad Prism 7.0繪圖軟件制作成直方圖的形式表現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異,通過(guò)比較法推測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MTT法檢測(cè)LBP對(duì)細(xì)胞活力的影響

采用LPS和不同濃度的LBP分別處理細(xì)胞24 h后,LPS組及LBP不同濃度各組的細(xì)胞存活率均與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異(P>0.05),表明LPS和不同濃度LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的活力沒(méi)有明顯影響,無(wú)明顯細(xì)胞度毒性作用,因此,建立在不同濃度梯度的LBP處理后以LPS誘導(dǎo)激活小膠質(zhì)細(xì)胞模型進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)是可行的,見(jiàn)圖1。

圖1 LBP作用下BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的存活率Fig.1 Survival rate of BV2 microglia induced by LBP注:與Contol比較,#P<0.05,與LPS比較, *P<0.05,圖2～圖8同。

2.2 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子的影響

2.2.1 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α的影響 經(jīng)ELISA法檢測(cè),與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞上清液中TNF-α含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α炎癥因子較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少更加明顯(P<0.05),說(shuō)明LBP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α起到抑制作用,見(jiàn)圖2。

圖2 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌 炎癥因子TNF-α表達(dá)的影響Fig.2 Effect of LBP on the expression of inflammatory factor TNF-α secreted by BV2 microglia

2.2.2 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β的影響 經(jīng)ELISA法檢測(cè),與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞上清液中IL-1β含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少,說(shuō)明LBP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1β起到抑制作用,見(jiàn)圖3。

圖3 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌 炎癥因子IL-1β表達(dá)的影響Fig.3 Effect of LBP on the expression of inflammatory factor IL-1β secreted by BV2 microglia

2.2.3 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6的影響 經(jīng)ELISA法檢測(cè),與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞上清液中IL-6含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6炎癥因子較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少,說(shuō)明LBP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6起到抑制作用,見(jiàn)圖4。

圖4 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌 炎癥因子IL-6表達(dá)的影響Fig.4 Effect of LBP on the secretion of inflammatory factor IL-6 by BV2 microglia

2.2.4 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子PGE2的影響 經(jīng)ELISA法檢測(cè),與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞上清液中PGE2含量顯著增高(P<0.05)。不同濃度LBP各組,與LPS共同處理24 h后,小膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2因子較LPS組均顯著減少(P<0.05),且隨著LBP濃度的增加減少,說(shuō)明LBP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌PGE2起到抑制作用,見(jiàn)圖5。

圖5 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)分泌PGE2因子表達(dá)的影響Fig.5 Effect of LBP on the secretion of factor PGE2 by BV2 microglia

2.3 LBP對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)H2DCFDA染色后,采用FCM檢測(cè),結(jié)果表明,在LPS的誘導(dǎo)下,LPS組小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量ROS,明顯高于Control組(P<0.05)。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)不同濃度LBP處理24 h后,ROS含量較LPS組顯著降低(P<0.05),且降低幅度隨著LBP濃度增加而增加,說(shuō)明LBP能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS的含量以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,見(jiàn)圖6。

圖6 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分泌ROS含量的影響Fig.6 Effects of LBP on ROS secretion by BV2 microglia

2.4 LBP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

經(jīng)LBP激活小膠質(zhì)細(xì)胞后,LPS組及不同濃度的LBP組,四種NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白均高于Control組(P<0.05)。但不同濃度的LBP組對(duì)應(yīng)的p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65蛋白表達(dá)均低于LPS組,且與LBP濃度成反比,見(jiàn)圖7。研究以LPS誘導(dǎo)激活不同濃度LBP處理過(guò)的小膠質(zhì)細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)p65蛋白表達(dá),LPS組和LBP組均顯著低于Control組(P<0.05),且隨著LBP濃度增加而增加;細(xì)胞核內(nèi)p65蛋白表達(dá),LPS組和LBP組均顯著高于Control組(P<0.05),且隨著LBP濃度增加而降低,說(shuō)明LBP可抑制p65蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移,見(jiàn)圖8。

圖7 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的影響Fig.7 Effect of LBP on the related proteins of NF-kappa B signaling pathway in BV2 microglia

圖8 LBP對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p65表達(dá)情況的影響Fig.8 Effect of LBP on p65 expression in BV2 microglia

3 討論

神經(jīng)炎癥一般是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中出現(xiàn)的神經(jīng)發(fā)炎。其誘因包含多種因素,如物理創(chuàng)傷、化學(xué)毒素、病毒感染、缺氧等均可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生,并一定程度造成神經(jīng)元變性及退化[14]。研究發(fā)現(xiàn),在多種刺激因素作用下,原本處于警戒狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞游走至受攻擊的神經(jīng)元,并黏附在神經(jīng)元表面。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放白細(xì)胞介素等多種細(xì)胞炎癥因子,產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放更多的炎癥因子,誘導(dǎo)發(fā)生神經(jīng)退行性病變。小鼠腦內(nèi)IL-1共可分為IL-1α和IL-1β兩種類型,而小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)元的外環(huán)境,是IL-1β的主要分泌細(xì)胞[15]。IL-6是一種全身性炎癥因子,可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)二者之間的相互作用,是神經(jīng)系統(tǒng)的主要細(xì)胞因子[16]。TNF-α主要來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞,腦機(jī)械性損傷后神經(jīng)細(xì)胞TNF-α蛋白和mRNA增高,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TNF-α有加重繼發(fā)性腦損傷的作用[18]。PGE2是一種脂質(zhì),能高效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力,研究顯示,PGE2可介導(dǎo)炎癥反應(yīng),加重小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,分泌更多的炎性IL-1β、TNF-α物質(zhì),導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[19]。因此,研究LBP對(duì)此四種炎癥因子的抑制效果,可以更好地查明其對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎活性的影響。本研究結(jié)果顯示,不同濃度的LBP對(duì)由LPS激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的典型炎癥因子具有顯著的影響(P<0.05)。四種炎癥因子在LPS的誘導(dǎo)下釋放明顯增多,而經(jīng)過(guò)LBP預(yù)處理組,小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2四種炎癥因子均較LPS組顯著降低,且隨著LBP濃度的增加而降低。說(shuō)明LBP能有效的降低小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子,由此推測(cè)可用于治療神經(jīng)炎癥。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病的另一原因,正常情況下,機(jī)體的ROS處于動(dòng)態(tài)平衡中,能夠有效地參與細(xì)胞活動(dòng),但當(dāng)存在外環(huán)境改變導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)多的ROS時(shí),會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷,引起包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病在內(nèi)的諸多疾病,因此及時(shí)有效的清除體內(nèi)多余的ROS,防治氧化應(yīng)激帶來(lái)?yè)p傷是神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的思路之一。研究發(fā)現(xiàn),多糖具有抗氧化、保護(hù)生物膜、延緩衰老、增強(qiáng)抗氧化酶活性、有效清除自由基及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用,LBP系多糖,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用。LBP可對(duì)小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生影響,經(jīng)LBP處理能有效減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),阻止神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化和視網(wǎng)膜神經(jīng)元死亡,破壞血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)[20]。在本研究中,采用不同劑量LBP處理過(guò)的小膠質(zhì)細(xì)胞在經(jīng)LPS激活后,ROS表達(dá)在顯著下降(P<0.05),且LBP濃度越高,ROS表達(dá)越低,說(shuō)明LBP能對(duì)ROS的激活產(chǎn)生抑制效果。ROS是巨噬細(xì)胞在激活時(shí)發(fā)揮氧化效應(yīng)的重要物質(zhì),激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量的ROS,ROS的蓄積可引起脂肪氧化,蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷,能量代謝衰竭,甚至細(xì)胞死亡[21]。本研究中LBP能有效降低激活后小膠質(zhì)細(xì)胞ROS含量,具有抗ROS氧化應(yīng)激的作用,可能會(huì)作為神經(jīng)退行性病變的治療選擇。

NF-κB是一種影響廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子最早是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的,并與很多復(fù)雜的因子調(diào)節(jié)存在密切的聯(lián)系,尤其是參與到炎癥的調(diào)節(jié)過(guò)程[22]。NF-κB與炎癥反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,具體包括潛伏、誘導(dǎo)、應(yīng)答及消退4個(gè)階段。潛伏階段NF-κB的活化會(huì)引起主要包括生長(zhǎng)因子的基因、免疫功能、炎癥刺激相關(guān)的細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素基因等諸多基因的表達(dá)[23],NF-κB潛伏階段表現(xiàn)為形成p65-p50異二聚體并與IκB結(jié)合。誘導(dǎo)階段是NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核的過(guò)程。當(dāng)促炎因子較少時(shí)進(jìn)入消退階段,此時(shí) NF-κB的表達(dá)也相應(yīng)減少[24]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激酶1(Transforming growth factor-β(TGF-β)activated kinase-1,TAK1)、磷酸化TAK1(P-TAK1)是炎癥、免疫、腫瘤等過(guò)程中關(guān)鍵調(diào)控因子,通過(guò)多種形式參與NF-κB的活化。在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路泛素降解途徑使IκB由p65-p50異二聚體解聚,從而激活了NF-κB,調(diào)控炎癥基因發(fā)生炎癥反應(yīng)[25]。

本研究采用LPS作為小膠質(zhì)細(xì)胞的激活劑進(jìn)行神經(jīng)炎癥造模,經(jīng)不同濃度LBP處理的小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子顯著降低(P<0.05),說(shuō)明LBP可以有效抑制NF-κB通路的活化,從NF-κB通路激活過(guò)程中p65的轉(zhuǎn)移特點(diǎn)看,經(jīng)LBP處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中p65由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移情況較未處理的有所降低,LBP濃度越高,這種降低越明顯,也說(shuō)明NF-κB通路激活受到了抑制,且抑制作用與LBP的濃度相關(guān)。作為炎癥反應(yīng)的重要通路,大量研究已表明,NF-κB參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程,研究顯示,IKK抑制劑對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用,進(jìn)一步驗(yàn)證了NF-κB信號(hào)通路在神經(jīng)退行性病變中發(fā)揮作用[26]。本研究中證實(shí)了LBP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB通路抑制作用,但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討研究,因此下一步需要針對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路作用的機(jī)制進(jìn)行研究。鑒于NF-κB信號(hào)通路參與了炎癥反應(yīng),在本研究中LBP可能通過(guò)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制,進(jìn)而表現(xiàn)出抗炎作用,本研究可為中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗炎治療提供參考。

4 結(jié)論

本研究以LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象,探討了枸杞多糖對(duì)LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用,對(duì)于LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)具有抑制作用,可有效抑制LPS刺激后BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子PGE2、IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放,能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中ROS的含量以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用,可以有效地抑制LPS刺激后細(xì)胞內(nèi)p-TAK1、iκB、p-iκB及p-p65的表達(dá),提示枸杞多糖可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)。