楓槭葉酶解液美拉德反應(yīng)及其揮發(fā)性成分分析

王宣靜,張?zhí)毂?蘇海洋,梁佳欣,陳治岍,周鵬飛,許春平,*

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南鄭州 450000; 2.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,江蘇南京 210019)

香精香料作為一種添加劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到食品生產(chǎn)中,它可以彌補(bǔ)食品本身的缺陷,增加食品的香味,掩蓋食物的不良?xì)庀ⅰ＝陙?以天然植物的提取物為原料,利用微生物發(fā)酵技術(shù)[1]、生物酶解技術(shù)[2-3]、美拉德反應(yīng)[4-5]等制備食用香精的研究被廣泛報(bào)道。徐達(dá)等[6]以白玄參為原料,采用復(fù)合酶對白玄參進(jìn)行酶解提取,將酶解液進(jìn)行濃縮后加入氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)制備煙用香料,并進(jìn)行工藝優(yōu)化,評吸結(jié)果表明,該美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以有效掩蓋雜氣,減輕刺激性,中和苦味,增加津甜的口感。白家峰等[7]以煙草花蕾酶解液為原料,通過進(jìn)行不同時(shí)間的美拉德反應(yīng)得到各美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,并利用主成分分析和感官評吸的方法對不同美拉德反應(yīng)時(shí)間的產(chǎn)物的揮發(fā)性香味成分進(jìn)行探究,找到最佳的美拉德反應(yīng)時(shí)間,為煙草花蕾制備煙用香料提供了新方法。鄭家倫等[8]以大豆粕為原料,通過酶解進(jìn)而利用美拉德反應(yīng)制備咸味香精,研究了酶的添加順序?qū)γ附庖盒再|(zhì)的影響,通過測定大豆粕酶解液的水解度、還原糖含量、氨基氮含量等指標(biāo),確定酶的添加順序,提高了產(chǎn)物的感官質(zhì)量。

楓槭浸膏是楓槭葉粉末經(jīng)乙醇提取濃縮后得到的產(chǎn)物,多為深褐色膏體,具有焦香、甜香特征,在食品與卷煙工業(yè)中多有應(yīng)用。蘇東贏[9]對楓槭浸膏不同溫度下的熱解產(chǎn)物進(jìn)行了定性定量分析,并將其加入卷煙中發(fā)現(xiàn)突出了卷煙的焦甜香韻,改善了卷煙的抽吸品質(zhì)。菜莉莉等[10]對市售的5種楓槭浸膏的揮發(fā)性成分進(jìn)行HS-SPME-GC/MS分析,并采用單因素方差分析和主成分分析比較了其揮發(fā)性成分的差異。但現(xiàn)階段對以天然植物楓槭為原料結(jié)合美拉德反應(yīng)制備食品香精的研究還很少。本文對楓槭葉粉末酶解后的酶解液進(jìn)行不同溫度梯度(90、100、110 ℃)的美拉德反應(yīng),選用GC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合主成分分析對楓槭葉粉末酶解液的美拉德反應(yīng)樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究,以期充分發(fā)揮天然植物楓槭的可用性價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楓槭 廣東梅州2017年產(chǎn);纖維素酶(50000 U/g)、果膠酶(100000 U/g)、半纖維素酶(200000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(6000 U/mg) 北京索萊寶科技有限公司;1,2-丙二醇、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、無水乙醇(AR) 天津市富宇化工有限公司;0. 8211 mg/mL乙酸苯乙酯(色譜純) 美國Sigma-Aldrich公司。

Q-100A3高速多功能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司;DGX-9143電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TGL-16 M離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司;同時(shí)蒸餾萃取裝置 鄭州科技玻璃儀器廠;Agilent GC6890-MS5973N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司;QYC-200搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理 將干燥的楓槭葉粉碎過300目篩,置5～10 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 樣品酶解處理 根據(jù)相關(guān)酶解研究[11-13],將預(yù)處理后的楓槭葉粉末以料液比1∶10加150 mL水制成水提取物,取部分水提取物在預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)酶條件下:酶解溫度50 ℃,酶解體系pH為7,酶解加酶量為楓槭的質(zhì)量的1.5%(四種酶分別為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶,加酶比例分別為1∶1∶1∶1),酶解5 h。

1.2.3 美拉德反應(yīng) 以楓槭葉粉末酶解水提取物為原料進(jìn)行美拉德反應(yīng)，在150 mL酶解水提取物的樣品中加入濃度為30%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7。將楓槭葉粉末酶解液于90、100、110 ℃的油浴鍋中進(jìn)行美拉德反應(yīng)3 h,其反應(yīng)產(chǎn)物分別記為A1、S1、B1;將楓槭葉粉末水提取物放置于100 ℃的油浴鍋中進(jìn)行美拉德反應(yīng)3 h,其反應(yīng)產(chǎn)物記為S2。

1.2.4 蒸餾萃取提取香味物質(zhì) 在同時(shí)蒸餾萃取裝置的平底燒瓶中加入各個(gè)美拉德反應(yīng)樣品150 mL,再加入100 mL蒸餾水,搖勻,調(diào)節(jié)電子調(diào)溫電熱套溫度,使得平底燒瓶中物質(zhì)處于微沸狀態(tài),在裝置的另一端蒸餾瓶中加50 mL二氯甲烷,在60 ℃水浴鍋中加熱。觀察加熱過程,當(dāng)二氯甲烷與水出現(xiàn)分層時(shí)開始計(jì)時(shí)2.5 h后萃取結(jié)束,待冷卻后,在二氯甲烷萃取液中加入10 g無水硫酸鈉和1 mL濃度為0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(內(nèi)標(biāo)物),靜置過夜。然后在35～40 ℃的水浴鍋中進(jìn)行濃縮。濃縮樣品至約1 mL轉(zhuǎn)至1.5 mL樣品瓶中,在2～4 ℃下密封保存,待用于GC/MS進(jìn)行定量分析[14-17]。利用Nist 11譜庫將質(zhì)譜圖中各色譜峰進(jìn)行檢索,同時(shí)進(jìn)行人工解析,對化學(xué)成分進(jìn)行定性分析(匹配度>80%)。采用內(nèi)標(biāo)法對物質(zhì)進(jìn)行定量。揮發(fā)性物質(zhì)含量(μg/g)=[內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量(μg)×揮發(fā)性物質(zhì)峰面積]/[內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品質(zhì)量(g)][18]

1.2.5 GC-MS條件 色譜條件:色譜柱為HP-5MS色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm);載氣:氦氣;載氣流量為:3 mL/min;進(jìn)樣口溫度:280 ℃;分流比10∶1;進(jìn)樣量 1 μL;升溫程序?yàn)?初起始溫度50 ℃,以4 ℃/min升至280 ℃;質(zhì)譜條件:EI源;接口溫度270 ℃,電子能量:70 eV,四極桿溫度:150 ℃;采集模式:掃描;質(zhì)量掃描范圍:35～550 amu。

1.2.6 主成分分析方法 使用SPSS軟件進(jìn)行主成分分析(PCA),計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣,主成分特征值和累積貢獻(xiàn)率。根據(jù)進(jìn)行了不同時(shí)間的美拉德反應(yīng)的楓槭酶解液中相關(guān)成分的含量標(biāo)準(zhǔn)化值與特征根、特征向量,計(jì)算出各主成分值,并以此作出散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 二種不同處理方式的樣品香味成分的GC/MS結(jié)果分析

根據(jù)S1與S2的GC/MS分析結(jié)果作圖1和圖2,觀察圖1可知,S1與S2相比,揮發(fā)性成分醇類、烯類、酮類、酯類、醛類、酚類、雜環(huán)類的種類數(shù)都有所增加;觀察圖2可知S1的揮發(fā)性成分總量為178.70 μg/g,S2的揮發(fā)性成分總量為87.40 μg/g,S1與S2相比,美拉德反應(yīng)后樣品的揮發(fā)性成分含量增加了91.30 μg/g。由此得出,楓槭葉酶解后進(jìn)行美拉德反應(yīng),產(chǎn)物中包含了更多的揮發(fā)性成分,使產(chǎn)物風(fēng)味更為獨(dú)特。

圖1 S1和S2楓槭樣品揮發(fā)性成分種類數(shù)Fig.1 Species of volatile components of maple samples S1 and S2

圖2 S1和S2楓槭樣品的揮發(fā)性成分含量Fig.2 Histogram of volatile components of maple samples S1 and S2

2.2 不同溫度的美拉德反應(yīng)樣品GC-MS數(shù)據(jù)的分析

楓槭葉酶解液90 ℃條件下的美拉德反應(yīng)樣品A1、100 ℃條件下美拉德反應(yīng)物樣品S1、110 ℃條件下美拉德反應(yīng)物樣品B1的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS檢測結(jié)果見表1。

表1 楓槭葉酶解液不同溫度的美拉德反應(yīng)樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量(μg/g)Table 1 Content of volatile matter in Maillard reaction samples of maple leaf enzymatic hydrolysate at different temperatures(μg/g)

對楓槭葉粉末酶解液在不同溫度下美拉德反應(yīng)樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行GC-MS分析。從GC-MS的分析結(jié)果(表1)可以看出,已鑒定出揮發(fā)性成分主要包括酸類、醇類、萜烯類、酮類、酯類、酚類、醛類、雜環(huán)類和其他類。A1、S1、B1中已鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)種類分別有67種、55種、50種,其中反應(yīng)溫度為90 ℃(A1)中揮發(fā)性成分種類最多;揮發(fā)性成分總量從多到少所對應(yīng)的樣品依次為A1、S1、B1,揮發(fā)性成分總量分別為235.9、178.7、174.7 μg/g,其中反應(yīng)溫度為90 ℃(A1),鑒定出的揮發(fā)性成分含量最多。

續(xù)表

續(xù)表

楓槭葉粉末酶解液進(jìn)行美拉德反應(yīng)后,樣品的揮發(fā)性成分中酸類化合物在A1中含量最高,為47.6 μg/g,其中肉豆蔻酸含量最高,為17.4 μg/g,肉豆蔻酸是具有花香、甜香等香味特征的化合物[19];醇類化合物的含量在A1、S1、B1中相差不大;萜烯類化合物、酮類化合物在A1中含量最高,其中1-石竹烯在S1萜烯類化合物中含量最高,為16.7 μg/g,4-甲基-1-(1-甲基乙基)-雙環(huán)[3.1.0]己-3-烯-2-酮在A1酮類化合物中含量最高,為12.1 μg/g,這些物質(zhì)本身都帶有獨(dú)特的香味,對整體風(fēng)味起到一定修飾作用;酯類化合物含量S1略高于A1,其中二氫獼猴桃內(nèi)酯在A1酯類化合物中含量最高,為8.1 μg/g,二氫獼猴桃內(nèi)酯具有典型的木香、茶香和桃子香氣的特征[20],對香氣有較好的影響。

2.3 楓槭酶解液不同溫度美拉德反應(yīng)特征致香成分分析

美拉德反應(yīng)又稱為羰氨反應(yīng),是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸)間的反應(yīng),其產(chǎn)物能賦予食品愉快的香味。表1雜環(huán)類中1-丁基-1H-吡咯、2-戊基呋喃、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪為美拉德反應(yīng)的特征致香成分[21]。

美拉德反應(yīng)特征致香成分總量在A1中含量最高為25.0 μg/g,其中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高為23.5 μg/g,吡嗪類物質(zhì)的形成是氨基親核進(jìn)攻羰基并發(fā)生加成和脫水反應(yīng)的結(jié)果[22],一般具有堅(jiān)果、燒烤等風(fēng)味特征[23],能夠增加食品的甜香和焦香香韻;2-戊基呋喃、1-丁基-1H-吡咯在A1中含均為0.6 μg/g,2-戊基呋喃是具有豆香、果香、清香的化合物[24-25],1-丁基-1H-吡咯是具有烘烤香韻的化合物,這些化合物整體閾值較低,對楓槭美拉德特征香味的形成有著重要的影響。A1中雜環(huán)類占比(10.60%)相對于酸類(20.18%)、醇類(22.26%)、烯類(20.26%)、酮類(15.35%)較低,可能是因?yàn)樗O(shè)置的美拉德反應(yīng)的時(shí)間較短,還未形成足夠的特征性風(fēng)味物質(zhì)。

2.4 主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 21軟件因子分析模塊中的降維分析[26],用主成分分析分析不同溫度美拉德反應(yīng)后的楓槭酶解液中86種揮發(fā)性成分,得到主成分載荷矩陣表(見表2)、特征值和貢獻(xiàn)率(見表3)。

表2 主成分載荷矩陣Table 2 Principal component load matrix

表3 2種主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 3 Characteristic values and contribution rates of 2 main components

由主成分載荷矩陣表(表2)可以得出,在主成分1中,載荷值較高的正影響揮發(fā)性成分有3,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醛、金合歡基丙酮、萜品烯、棕櫚酸、丁香酚,載荷值依次是0.999、0.996、0.996、0.987、0.983,主要指向醛、酮類物質(zhì);負(fù)影響最大的為反油酸,載荷值為-0.999。在主成分2中,載荷值較高的正影響揮發(fā)性成分有左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮等物質(zhì)載荷較高,載荷值依次是0.997、0.996、0.986、0.980、0.962,主要指向烯、醇類物質(zhì);負(fù)影響最大的為3-甲基-6-(1-甲基亞乙基)-環(huán)己烯,載荷值為-0.994。主成分載荷矩陣顯示了各變量與各主成分之間的關(guān)系,數(shù)值的絕對值越大,表明該指標(biāo)與某一主成分的聯(lián)系緊密程度越大,反映了該指標(biāo)在該主成分上的載荷程度;載荷值小的揮發(fā)性成分對楓槭的揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)小,同時(shí)也表明它的含量極低或未檢出。

由表3可知,主成分1、2的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到100%,則說明這86種揮發(fā)性成分可以分別用主成分1、主成分2進(jìn)行主成分分析。綜合表2可認(rèn)為3,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醛、金合歡基丙酮、萜品烯、棕櫚酸、丁香酚、左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮為楓槭揮發(fā)性成分的主要特征化合物。

根據(jù)表1中三個(gè)進(jìn)行不同美拉德溫度處理的樣品中86種香氣成分的相對含量、表3中2種主成分的特征值和表2中86種香氣成分的載荷值計(jì)算出三個(gè)樣品中的第一、第二主成分值,然后以第一主成分為X標(biāo),第二主成分為Y坐標(biāo),做主成分分散圖(圖3)、散點(diǎn)圖(圖4)。圖4中的86種香氣成分對應(yīng)于表1中的香氣成分。

圖3 美拉德處理溫度不同的三個(gè)樣品的主成分分散圖Fig.3 Principal component dispersion diagram of three samples with different Maillard treatment temperature注:1為美拉德反應(yīng)90 ℃的樣品,2為美拉德反應(yīng) 100 ℃的樣品,3為美拉德反應(yīng)110 ℃的樣品。

圖4 不同美拉德處理溫度的86種香氣成分散點(diǎn)圖Fig.4 Scatter diagram of 86 aroma components with different Maillard treatment temperature

由圖3可知,3個(gè)樣品根據(jù)距離遠(yuǎn)近可分為3個(gè)區(qū)域,美拉德反應(yīng)90、100、110 ℃的樣品彼此距離較遠(yuǎn),表明3個(gè)樣品的主成分差異均較大。通過觀察圖4可知,美拉德反應(yīng)90 ℃的香氣主成分集中在第二象限,對其特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括正十五酸、十四烷酸、葉綠醇等;美拉德反應(yīng)100 ℃的香氣成分主成分集中第一象限,對其特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括(+)-香橙烯、亞油酸乙酯、4,6,6-三甲基二環(huán)[3.1.1]庚-3-烯-2-酮等香味物質(zhì);美拉德反應(yīng)110 ℃的香氣成分主成分集中在第四象限,對其特征香氣影響較大的香味物質(zhì)主要包括棕櫚酸甲酯、左旋-alpha-蒎烯、環(huán)乙烯甲醛等香味物質(zhì)。

GC-MS數(shù)據(jù)結(jié)果表明,90 ℃時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的含量和種類最多,主成分分析同樣發(fā)現(xiàn)90 ℃美拉德反應(yīng)樣品揮發(fā)性物質(zhì)分布最多,多為酸類、醇類、酮類物質(zhì),酸類物質(zhì)本身帶有獨(dú)特的香氣;飽和醇風(fēng)味閾值較高,香味不明顯,不飽和醇閾值較低,具有蘑菇香氣;酮類物質(zhì)具有一定的果香味,有研究表明一些酮類物質(zhì)在低閾值時(shí)與醛類或其他物質(zhì)存在相互作用,產(chǎn)生氣味增強(qiáng)或改變現(xiàn)象[27]。結(jié)合上述結(jié)果可認(rèn)為美拉德反應(yīng)溫度為90 ℃時(shí)得到的樣品具有最佳的風(fēng)味和感官品質(zhì)。

3 結(jié)論

本文分別以楓槭葉水提取物、楓槭葉酶解液為原料進(jìn)行美拉德反應(yīng),與楓槭葉水提取物的美拉德反應(yīng)樣品相比,楓槭酶解液美拉德反應(yīng)樣品的揮發(fā)性成分種類和含量都有所增加。楓槭葉酶解液經(jīng)不同溫度的美拉德反應(yīng)后香味成分的種類和含量變化較大,美拉德反應(yīng)90 ℃的樣品揮發(fā)性香味成分的種類最多為67種,主要包括酸類、醇類、萜烯類、酮類、酯類、酚類、醛類、雜環(huán)類和其他類。其中美拉德反應(yīng)90 ℃時(shí)樣品揮發(fā)性物質(zhì)總量含量最高,達(dá)235.9 μg/g。通過主成分分析可知美拉德反應(yīng)90、100、110 ℃的樣品彼此距離較遠(yuǎn),表明其主成分差異均較大,90 ℃美拉德反應(yīng)揮發(fā)性物質(zhì)分布最多,且認(rèn)為3,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醛、金合歡基丙酮、萜品烯、棕櫚酸、丁香酚、左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮為楓槭揮發(fā)性成分的主要特征化合物。結(jié)合上述結(jié)果可認(rèn)為在美拉德反應(yīng)溫度為90 ℃時(shí)得到的樣品具有最佳的風(fēng)味和感官品質(zhì)。