體外亞硝化模擬體系優(yōu)選阻斷NPYR生成的復(fù)合香辛料精油配比

陳文靜,任小青,楊 華,馬儷珍,*

(1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384; 2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384)

近年來,隨著我國經(jīng)濟(jì)實(shí)力的迅速增長,食品加工行業(yè)的安全問題也愈來愈被重視。在肉制品的加工領(lǐng)域,亞硝酸鹽作為食品添加劑被廣泛使用,這是因?yàn)閬喯跛猁}可以使肉制品呈現(xiàn)穩(wěn)定的紅色,抑制有害細(xì)菌的生長繁殖,并且在貯藏過程中可以抑制產(chǎn)品中脂類的氧化,進(jìn)而延緩食品的腐敗,還可以改善肉類的風(fēng)味[1-2]。但是,亞硝酸鹽在弱酸性條件下,極易與腌肉制品中富含的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物——胺類化合物發(fā)生亞硝化反應(yīng),最終生成具有致癌致畸致突變的危害物(N-亞硝胺)[3]。因此,在腌肉制品加工中,常常通過添加亞硝化抑制劑來減少或抑制N-亞硝胺的生成[4]。

目前,國內(nèi)外對于如何控制N-亞硝胺的形成研究主要集中在尋找天然亞硝化抑制劑,如VC、VE、茶多酚[5]、香辛料精油(Spices essential oil,SEO)[6-8]等,其中SEO不僅具有獨(dú)特的氣味,可以矯味、增色,還具有抑菌、防腐、抗氧化等作用[9-11]。SEO阻斷N-亞硝胺的機(jī)理是利用其抗氧化成分(如醛類、醇類、烯類等),通過反硝化途徑,將亞硝化試劑N2O3還原為N2、NO等,進(jìn)而有效清除亞硝酸鹽殘留量,阻斷N-亞硝胺的生成。黃建蓉等[12]研究發(fā)現(xiàn),花椒精油與八角精油按一定比例復(fù)配后,其對亞硝酸鈉的清除能力具有協(xié)同增效作用。尹立輝等[8]研究發(fā)現(xiàn),0.2%的八角精油和0.2%的丁香精油對臘腸中N-二甲基亞硝胺(N-nitrosodimethylamine,NDMA)的阻斷率分別為87%和79%。汪思順等[13]將3.81 mL的大蒜提取液分別加入到腌肉和腌魚中,其對亞硝酸鹽的清除率為85.04%和80.79%。丁城等[14]研究發(fā)現(xiàn)50 mL 2%的辣椒提取液對亞硝酸鹽的清除率高達(dá)98.6%。

前期研究中,考慮到NDMA是N-亞硝胺中毒性很強(qiáng)的一種,且我國在GB 2762-2017《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中對NDMA限量做出了規(guī)定,肉及肉制品(肉制罐頭除外)中含量不得超過3.0 μg/kg,所以本實(shí)驗(yàn)室將優(yōu)選的阻斷NDMA生成的復(fù)合香辛料精油(Compound spices essential oil,CSEO)[15]應(yīng)用到西式培根加工中,發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低西式培根中NDMA以及其他幾種N-亞硝胺的含量[16]。但是,西式培根產(chǎn)品中N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine,NPYR)的含量偏高(3.89～7.39 μg/kg),雖然我國未頒布相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定肉及肉制品中NPYR的含量,但美國食品藥品監(jiān)管局規(guī)定在美國市場上銷售的肉制品所含有的NPYR不得超過10 μg/kg[17]。因此,從保證西式培根的安全品質(zhì)考慮,本試驗(yàn)以阻斷NPYR的形成為考核目標(biāo),篩選能夠有效阻斷NPYR的CSEO。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法[18-20]是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并通過試驗(yàn)得到數(shù)據(jù),采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù),解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法。本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法,先從肉制品中常用的8種市售SEO(花椒、八角、青花椒、丁香、迷迭香、黑胡椒、姜油、當(dāng)歸風(fēng)味生姜、砂仁)中選出對NPYR抑制率較好的5種,再用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出這5種SEO的最佳配比。最后,將優(yōu)選的CSEO進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),除對NPYR的抑制效果外,也同時(shí)考察了對NDMA的抑制率,目的是為CSEO將來在西式培根等腌肉制品中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售常用的8種超臨界萃取SEO(花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油、迷迭香精油、黑胡椒精油、當(dāng)歸風(fēng)味姜油、砂仁精油) 天津市春合科技開發(fā)有限公司;乳化劑(PEG8000)、檸檬酸鈉、鹽酸、α-萘胺、無水乙醇、無水對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉、二甲胺鹽酸鹽、碳酸鈉 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

STARTER3100酸度計(jì) 美國Ohaus公司;18Basic勻漿機(jī) 德國IKA公司;XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋 上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;NO.NU-425-400E超凈工作臺 天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外模擬亞硝化乳化體系的制備 參照馬儷珍等[21]的方法,并稍作修改。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì),分別吸取不同體積的SEO至50 mL帶螺帽的離心管內(nèi),均加入0.05 g PEG8000,再加入一定體積的0.5 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH3.0),使其總體積為10.0 mL。用勻漿機(jī)B擋(13000 r/min)乳化處理1 min后,取1.0 mL配制好的乳液至50 mL帶螺帽的離心管中,依次加入0.5 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液(pH3.0)5.0 mL,1 mmol/L亞硝酸鈉0.5 mL,1 mmol/L吡咯烷鹽酸鹽0.5 mL,3 mL的緩沖液,使反應(yīng)體系的總體積為10.0 mL,在37 ℃下水浴反應(yīng)1 h。

1.2.2 NPYR的測定方法 按照1.2.1體外模擬亞硝化反應(yīng)結(jié)束后,參照馬儷珍等[21]的方法,取1.0 mL反應(yīng)的溶液至玻璃試管中,加入0.5%碳酸鈉溶液0.5 mL終止其反應(yīng),將其置于超凈工作臺內(nèi)的15 W紫外燈下照射15 min(試管液面距燈管之間的距離為15 cm),取出立即依次加入1%對氨基苯磺酸1.5 mL(搖勻)、0.1%α-萘胺1.5 mL(搖勻)、0.5 mL緩沖液至溶液體積精確至5.0 mL,搖勻,靜置15 min 顯色后在波長525 nm下比色測定其吸光度。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 研究不同體積濃度的8種SEO乳液對NPYR的抑制率。按1.2.1的方法將8種SEO分別吸取0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,使每種SEO在體外模擬亞硝化反應(yīng)中的終濃度分別為0.0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL/L,反應(yīng)結(jié)束后,按1.2.2進(jìn)行NPYR的測定,空白對照組為不加香辛料精油的空白乳液,計(jì)算每一種SEO在對應(yīng)體積濃度時(shí)對NPYR的抑制率,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,最終以花椒精油體積濃度(A,330.0～470.0 μL/L)、八角精油體積濃度(B,300.0～370.0 μL/L)、青花椒精油體積濃度(C,13.0～20.0 μL/L)、丁香精油體積濃度(D,10.0～17.0 μL/L)和迷迭香精油體積濃度(E,100.0～170.0 μL/L)為影響因素水平,以NPYR抑制率為響應(yīng)值,使用Design-Expert 7.0軟件,依據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn)。因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼值Table 1 Response surface test factors and level coding values

1.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照1.2.4將響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的CSEO最優(yōu)配比添加到體外模擬NPYR形成的體系中,進(jìn)行6次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。為了解所優(yōu)選CSEO對NDMA的抑制效果,也同時(shí)測定了CSEO對體外模擬體系中NDMA形成的抑制率。

1.2.6 NPYR和NDMA抑制率的計(jì)算

式中:A0為不加入SEO的空白乳液時(shí)的吸光度值；Ax為加入SEO乳液時(shí)的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 Microsoft Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,Statistix 8.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通過Turkey test程序進(jìn)行顯著性差異(P<0.05),Sigmaplot 10.0作圖。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design-Expert 7.0設(shè)計(jì)并進(jìn)行結(jié)果分析,通過建立回歸方程、繪制等高線和響應(yīng)面圖,對任意兩種因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析評價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

8種不同添加濃度SEO對NPYR抑制率變化見表2。由表2可知,除砂仁精油外,其他7種SEO對NPYR的形成均有不同程度的抑制效果。其中,迷迭香精油對NPYR的抑制率最強(qiáng),在0.5～20.0 mL/L的體積濃度范圍內(nèi),隨著體積濃度的增加,抑制作用也顯著增強(qiáng)(P<0.05)；花椒精油在0.5～20.0 mL/L的體積濃度范圍內(nèi),從0.5 mL/L增加到5.0 mL/L時(shí),對NPYR的抑制率從57.93%迅速增加到74.76%(P<0.05),之后隨著體積濃度的增加,抑制率僅有很小幅度的升高(從74.76%升高到77.52%),說明花椒精油在5.0～10.0 mL/L體積濃度就可以達(dá)到較好的抑制效果；而當(dāng)青花椒精油的體積濃度僅為0.5 mL/L時(shí),對NPYR的抑制率就已達(dá)到79.37%,若體積濃度繼續(xù)增加,則對NPYR抑制率反而呈降低趨勢；丁香精油和八角精油在0.5～15.0 mL/L的體積濃度范圍內(nèi),對NPYR的抑制率與其濃度均呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系；黑胡椒精油體積濃度從0.5 mL/L增加到5.0 mL/L時(shí),對NPYR的抑制率從15.70%迅速增加到45.23%(P<0.05),之后隨著體積濃度的增加,抑制率反而呈顯著降低趨勢(P<0.05)；當(dāng)歸風(fēng)味姜油與黑胡椒精油的變化趨勢基本一致。

表2 8種不同濃度香辛料精油添加對NPYR抑制效果Table 2 Inhibition effect of 8 different concentrations of essential oils on NPYR

由于SEO風(fēng)味醇香濃厚,單一使用某一種SEO需要較高的濃度(除青花椒精油外,花椒精油、八角精油、迷迭香精油、丁香精油的體積濃度應(yīng)在15.0 mL/L以上,如表2所示)才能對NPYR的抑制率達(dá)到組內(nèi)最大值,然而在實(shí)際應(yīng)用中要考慮到產(chǎn)品的復(fù)合風(fēng)味,不可能添加如此高濃度的單一SEO。此外,雖然當(dāng)歸風(fēng)味姜油在每一個(gè)體積濃度上,對NPYR的抑制率都高于八角精油,但是當(dāng)歸添加到肉制品中的風(fēng)味微苦,而八角是肉制品加工中常用的一種香辛料,具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[22],所以最終確定在響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,以花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油為自變量進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。這5種超臨界萃取SEO復(fù)配時(shí)零水平的濃度確定原則,主要是根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表2可知,花椒精油和八角精油的體積濃度在5.0 mL/L左右即可以達(dá)到較好的抑制效果；青花椒精油的體積濃度為0.5 mL/L時(shí),抑制效果最佳；丁香精油和迷迭香精油的體積濃度在0.5～5 mL/L之間的抑制效果較好；綜合考慮,最終確定其單因素實(shí)驗(yàn)的體積濃度分別為6.0、5.0、0.25、2.0、2.0 mL/L,在此基礎(chǔ)上因?yàn)槭?種超臨界萃取SEO復(fù)配且超臨界萃取SEO風(fēng)味濃郁醇厚,所以只選取單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)體積濃度的1/15,而丁香精油(香氣濃郁)的體積濃度為迷迭香精油最終體積濃度的1/10。最終確定花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油復(fù)配時(shí)零水平的體積濃度分別為400.0、335.0、16.5、13.5和135.0 μL/L。

2.2 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),選取花椒精油(A)、八角精油(B)、青花椒精油(C)、丁香精油(D)和迷迭香精油(E)5個(gè)因素為自變量,使用Design-Expert 7.0軟件,通過中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行5因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化分析試驗(yàn),研究其對NPYR抑制率(Y)的影響。

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface center combination test

利用軟件Design-Expert 7.0對上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析,可建立抑制率(Y)對花椒精油(A)、八角精油(B)、青花椒精油(C)、丁香精油(D)和迷迭香精油(E)的二次回歸方程:Y=70.01+0.013A+0.022B+0.026C+0.031D+0.030E+0.058AB+0.085AC+0.017AD+0.058AE-0.037BC+0.075BD+0.010BE+2.500E-003+0.035CE+0.043DE-0.55A2-0.54B2-0.51C2-0.54D2-0.55E2。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface test regression model

2.2.2 響應(yīng)曲面和等高線圖分析 通過Design-Expert 7.0軟件繪制的響應(yīng)曲面和等高線圖,可以更為直觀地反映出研究因素及其交互作用對NPYR抑制率的影響,響應(yīng)曲面圖中曲線彎曲度越大,說明研究因素對NPYR抑制率影響越大[28-29]；等高線呈現(xiàn)橢圓形,則說明研究的各因素之間交互作用顯著,而圓形則說明交互作用不顯著[30-31]。通過擬合模型的回歸方程所作的各因素之間交互作用的響應(yīng)面分析見圖1所示。如圖1所示,花椒精油和青花椒精油之間的交互作用顯著,將花椒精油的體積濃度固定后,NPYR抑制率隨著青花椒體積濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低趨勢,且其等高線圖呈橢圓形,青花椒精油的體積濃度一定時(shí),NPYR抑制率隨著花椒精油體積濃度的增加先升高后降低。圖1顯示,八角精油和丁香精油之間的交互作用也達(dá)到了顯著水平(P<0.05),當(dāng)八角精油在一定體積濃度時(shí),對NPYR的抑制效果隨著丁香精油體積濃度的增加先升高后降低,反之,也呈現(xiàn)相同的變化趨勢。這就說明,花椒精油和青花椒精油、八角精油和丁香精油之間的交互作用對NPYR的抑制作用都比較大,該分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖1 花椒和青花椒、八角和丁香精油相互作用對NPYR抑制率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots of the interaction between pepper and green pepper,star anise and clove essential oil on NPYR inhibition rate

2.2.3 最佳工藝條件預(yù)測與驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Design-Expert 7.0軟件預(yù)測得出抑制NPYR的CSEO最優(yōu)配比,為花椒精油441.0 μL/L、八角精油337.0 μL/L、青花椒精油17.0 μL/L、丁香精油14.0 μL/L和迷迭香精油137.0 μL/L。此時(shí),NPYR抑制率的預(yù)測結(jié)果為69.84%。將此條件下的CSEO在體外模擬NPYR形成的體系中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)測得NPYR抑制率為68.40%±0.33%,與預(yù)測值基本相符,說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。再將此最優(yōu)配比在體外模擬NDMA形成的體系中進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),試驗(yàn)測定對NDMA抑制率為66.69%±0.43%。

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)配比,對NPYR的抑制率為68.40%±0.33%(驗(yàn)證試驗(yàn)值)。此結(jié)果比單因素實(shí)驗(yàn)中最高的NPYR抑制率(迷迭香的體積濃度為20.0 mL/L,對NPYR的抑制率為85.70%)要略低,這是因?yàn)榭紤]到在肉制品的實(shí)際生產(chǎn)加工中SEO添加量對肉制品風(fēng)味的影響,篩選的最優(yōu)配比中各SEO的體積濃度均遠(yuǎn)低于使用單一SEO時(shí)的最高濃度。

3 結(jié)論

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在體外模擬亞硝化體系中,除砂仁精油外,其他7種SEO對NPYR的生成均有不同程度的抑制作用,抑制率大小與其添加濃度有一定關(guān)系。響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到由5種SEO組合的CSEO,最優(yōu)體積濃度配比為:當(dāng)花椒精油、八角精油、青花椒精油、丁香精油和迷迭香精油的體積濃度分別為441.0、337.0、17.0、14.0和137.0 μL/L時(shí),由模型優(yōu)選得出對NPYR抑制率的預(yù)測值為69.84%,驗(yàn)證試驗(yàn)得出的抑制率為68.40%±0.33%,說明得到的模型與實(shí)際擬合度較好,具有實(shí)用價(jià)值。此配比對NDMA的抑制率為66.69%±0.43%。