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    環(huán)狀RNAFBXW7在三陰乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

    2021-06-16 03:32:04黃俊高關(guān)鳳曾艷唐海林楊鳳姣
    中國普通外科雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系孵育編碼

    黃俊,高關(guān)鳳,曾艷,唐海林,楊鳳姣

    (1.邵陽學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 邵陽 422000;2.中山大學(xué) 腫瘤防治中心,廣東 廣州 510000)

    乳腺癌是全世界婦女最常見的惡性腫瘤之一[1]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌的一種亞型,不表達(dá)HER-2 受體、雌激素受體(ER)及孕激素受體(PR)。臨床上采取綜合治療方法,對(duì)早期TNBC的治療可以起到一定的效果,而對(duì)于中期或晚期患者則以化學(xué)療法為主[2]。但晚期患者化療的反應(yīng)期和總體生存期(OS)都較短,且易產(chǎn)生毒性和耐藥性[3-6]。盡管TNBC患者僅占乳腺癌患者的12%~17%[7],但與其他類型的乳腺癌相比,TNBC是侵襲性和轉(zhuǎn)移性最強(qiáng)的亞型,且由于缺乏有效的治療靶點(diǎn)而被認(rèn)為是預(yù)后最差的亞型[8-9]。毫無疑問,研發(fā)更為有效的分子靶標(biāo)和新型生物標(biāo)志物是完善TNBC治療和監(jiān)測(cè)的當(dāng)務(wù)之急。新標(biāo)靶的探索及相關(guān)機(jī)制對(duì)治療TNBC具有重要意義。

    最近,環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)對(duì)癌癥進(jìn)展和復(fù)發(fā)的復(fù)雜影響引起了醫(yī)學(xué)界極大的研究興趣[10]。circRNA是一類內(nèi)源單鏈非編碼RNA分子,在人類細(xì)胞中廣泛分布且種類,可以調(diào)節(jié)真核生物中的基因表達(dá)[11]。circRNA作為一種調(diào)控性RNA,可以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)選擇性剪接,抑制miRNA的成熟,促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用以及充當(dāng)miRNA的海綿[12]。它是一種穩(wěn)定表達(dá)的非編碼RNA,circRNA的失調(diào)在人類癌癥發(fā)病機(jī)理中也起著至關(guān)重要的作用[13]。越來越多的報(bào)道表明circRNA與多種人類腫瘤相關(guān),例如乳腺癌[14],肺癌[15],肝細(xì)胞癌[16],膀胱癌[17],腎細(xì)胞癌[18]和乳腺癌[19]。有研究報(bào)道,來自F-box和WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域的circRNA(circFBXW7)通過編碼新型21 kDa蛋白FBXW7-185aa在人腦中的發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用?;騀BXW7部分外顯子來源的circRNA編碼的蛋白可與FBXW7 mRNA編碼的蛋白協(xié)同作用,調(diào)控原癌基因Myc的穩(wěn)定性,從而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展[20]。最近,一項(xiàng)研究認(rèn)為circFBXW7可通過競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-197-3p并編碼FBXW7-185aa蛋白上調(diào)FBXW7基因表達(dá),從而抑制乳腺癌的進(jìn)展[21]。然而,circFBXW7在TNBC的作用及機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討circFBXW7對(duì)TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲性的影響。

    1 材料與方法

    1.1 臨床標(biāo)本與資料

    臨床標(biāo)本收集了從2005年3月3日—2011年9月26日于中山大學(xué)腫瘤防治中心被確認(rèn)為TNBC患者的240例新鮮腫瘤樣本,患者的隨訪時(shí)間5年以上或者截止到死亡結(jié)局發(fā)生時(shí)。所有切除的組織均立即浸入RNAlater(Ambion,TX)中;患者定期隨訪,并記錄臨床數(shù)據(jù)。這項(xiàng)研究經(jīng)中山大學(xué)腫瘤防治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并根據(jù)赫爾辛基宣言進(jìn)行。參與本研究前已獲得所有患者書面知情同意。240例患者的基本臨床資料見表1。

    表1 240 例患者的基本臨床資料[n(%)]Table 1 The general data of the 240 patients[n(%)]

    1.2 細(xì)胞株及主要試劑

    人類TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231、HCC1806購自美國ATCC細(xì)胞庫,經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)并傳代不超過10代。MDA-MB231和HCC1806細(xì)胞系均無支原體及其他污染物感染。RPMI1640和DMEM(4.5 g)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000,TRIzol購自美國Invitrogen公司,SYBRSuper Mix試劑購自日本Takara,PCR引物購自GeneCopoeia有限公司。CCK-8試劑盒購自日本Dojindo,Transwell小室(孔徑3.0 μm)購自美國Corning公司,Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。circFBXW7 shRNA購自GeneCopoeia有限公司。

    1.3 qRT-PCR 法檢測(cè)circFBXW7 在TNBC 組織中的表達(dá)

    乳腺癌組織和細(xì)胞用按照試劑說明書用TRIzol裂解提取總RNA,按照GeneCopoeia反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA,用SYBRPremix Ex Taq進(jìn)行qRT-PCR。以GAPDH為內(nèi)參。利用各實(shí)驗(yàn)組目的基因及內(nèi)參基因的Ct值,按照公式ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因,以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,所有qRT-PCR分析均使用Bio-Rad IQTM5多色實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國)進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL,每個(gè)樣本重復(fù)3次。

    1.4 載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

    載體的合成和轉(zhuǎn)染人circ FBXW7 的全長cDNA,并將其克隆到pCDNA3.0 載體中以構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒,通過q RT-PCR 評(píng)估效率,用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長至約50%密度;室溫下孵育20 min,使形成脂質(zhì)體復(fù)合體;往復(fù)合體中加入無血清的培養(yǎng)液,溫和混勻,加入到待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)瓶中;細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24~48 h后,收集細(xì)胞,抽提總RNA,蛋白。microRNA抑制劑和模擬物由GeneCopoeia公司合成。

    1.5 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

    制備單細(xì)胞懸液:取對(duì)數(shù)增殖期的MDAMB-231和HCC1806以103細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中,每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,孵育48 h后。每個(gè)孔中加入10 μLCCK-8溶液添加至鋪板的細(xì)胞中,將其在37 ℃,5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng),孵育2 h。使用微量滴定板讀數(shù)器評(píng)估450 nm波長的吸光度。

    1.6 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲能力

    通常,使用遷移室進(jìn)行Transwell分析,收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,以2×104個(gè)懸浮細(xì)胞重懸于無血清的培養(yǎng)基中,每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,然后轉(zhuǎn)移到水合基質(zhì)膠室中。并將20%胎牛血清作為趨化劑添加到下室中在37 ℃和5%CO2孵育48 h后,用棉簽刮擦上表面的細(xì)胞,將膜底部的浸潤細(xì)胞在室溫下用甲醇固定30 min,然后在室溫下用結(jié)晶紫染色,計(jì)數(shù)并成像。

    1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

    消化重懸細(xì)胞至適宜密度,以1×103個(gè)細(xì)胞每孔的數(shù)量接種于六孔板中并在溫箱中孵育7~14 d,待肉眼可觀察到細(xì)胞集落形成終止培養(yǎng)。用PBS洗去殘余的培養(yǎng)基后,甲醇固定細(xì)胞集落10 min,倒去甲醇開蓋晾干剩余的甲醇,加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min。之后,對(duì)集落進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組之間的比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行,根據(jù)Kaplan-Meier方法繪制OS和無病生存(DFS)曲線,并使用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較,從手術(shù)當(dāng)天起開始計(jì)算存活時(shí)間。使用Cox回歸分析circFBXW7單因素和多因素與生存的關(guān)系,以及風(fēng)險(xiǎn)值(HR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 circFBXW7 表達(dá)與TNBC 患者預(yù)后的關(guān)系

    240 例TNBC 患者新鮮癌組織標(biāo)本中circ FBXW7 的平均表達(dá)水平為1.043±0.268。以平均表達(dá)水平定義為臨界值,將患者分為高表達(dá)組(表達(dá)量>1.043)和低表達(dá)組(表達(dá)量≤1.043),其中高表達(dá)組100例,低表達(dá)組140例,低表達(dá)組死亡為28 例,復(fù)發(fā)為30 例;高表達(dá)組死亡10例,復(fù)發(fā)12例。Kaplan-Meier生存分析顯示,低circFBXW7組患者的OS和DFS均明顯短于高circFBXW7組患者(均P<0.05)(圖1)。

    圖1 不同circFBXW7 表達(dá)水平TNBC 患者的OS 和DFS 曲線Figure 1 The OS and DFS curves of TNBC patients with different circFBXW7 expression levels

    2.2 TNBC 患者預(yù)后因素分析

    單因素Cox回歸分析顯示,組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、circFBXW7表達(dá)是TNBC患者預(yù)后的影響因素(均P<0.05);多因素Cox回歸分析顯示,組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、circFBXW7表達(dá)是TNBC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(均P<0.05)(表2)。

    表2 單因素和多因素Cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis

    2.3 circFBXW7 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖的影響

    為了研究circFBXW7在TNBC細(xì)胞中的生物學(xué)功能和作用,構(gòu)建了circFBXW7過表達(dá)載體,并驗(yàn)證了其在MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞系中的作用,結(jié)果顯示,過表達(dá)組TNBC細(xì)胞株(MDAMB-231、HCC1806)的circFBXW7表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)(圖2)。細(xì)胞增殖測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,circFBXW7的過表達(dá)的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和HCC1806)的增殖能力明顯降低(均P<0.05)(圖3)。

    圖2 circFBXW7 在TNBC 細(xì)胞株中過表達(dá)驗(yàn)證Figure 2 Verification of circFBXW7 over-expression of in TNBC cell lines

    圖3 過表達(dá)circFBXW7 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of circFBXW7 over-expression on proliferation of TNBC cells

    2.4 circFBXW7 對(duì)TNBC 細(xì)胞的遷移、侵襲的影響

    Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,circFBXW7的過表達(dá)明顯抑制了這兩種TNBC細(xì)胞系的遷移能力(均P<0.05)(圖4),加入基質(zhì)膠后檢測(cè)過表達(dá)circFBXW7后兩種TNBC細(xì)胞系的侵襲能力(均P<0.05)(圖5)。

    圖4 過表達(dá)circFBXW7 對(duì)TNBC 細(xì)胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of circFBXW7 over-expression on migration ability of TNBC cells

    圖5 過表達(dá)circFBXW7 對(duì)TNBC 細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 5 Effect of circFBXW7 over-expression on invasion ability of TNBC cells

    2.5 過表達(dá)circFBXW7 對(duì)miR-197-3p 表達(dá)的影響

    q RT-PCR 結(jié)果顯示,過表達(dá)組TNBC 細(xì)胞(MDA-MB-231、HCC1806)中的miR-197-3p表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(均P<0.05)(圖6)。

    圖6 過表達(dá)circFBXW7 對(duì)miR-197-3p 表達(dá)的影響Figure 6 Influence of circFBXW7 overexpression on miRNA-197-3p expression

    2.6 抑制miR-197-3p 對(duì)circFBXW7 敲除所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)的影響

    在敲除circ FBXW7 的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-197-3p抑制劑,再進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,抑制miR-197-3 p 后可減少由于circ FBXW7 敲低所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力的增強(qiáng)(均P<0.05)(圖7)。該結(jié)果提示,circFBXW7可能是通過miR-197-3p發(fā)揮作用,通過吸附miR-197-3 p,減少其表達(dá),抑制腫瘤的發(fā)展。

    圖7 抑制miR-197-3p 對(duì)circFBXW7 敲除所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)的影響 A:克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)增殖能力;B:Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力Figure 7 Influences of miR-197-3p inhibition on the increased proliferation and invasion abilities induced by circFBXW7 knockdown A:Colony formation assay for determining proliferation ability;B:Transwell assay for determining invasion ability

    3 討論

    盡管診斷和治療手段得到了一定的發(fā)展,但是乳腺癌仍然是女性人群癌癥中死亡的主要原因[22]。circRNA是人類癌癥中重要的調(diào)節(jié)因子[23]。隨著下一代測(cè)序和生物信息技術(shù)的迅速發(fā)展,人們已經(jīng)闡明了circRNA在人類癌癥中起著至關(guān)重要的作用,并表現(xiàn)出作為生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的巨大潛力[24-26]。circRNA與傳統(tǒng)的線性RNA相比,通過反向剪接產(chǎn)生的共價(jià)閉合環(huán)沒有5'-cap或3'-poly(A)尾巴,屬于內(nèi)源性非編碼RNA的新興亞組。其特征是組織特異性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[27-30]。迄今為止,已有不同研究小組篩選和鑒定了多種與癌癥(包括乳腺癌在內(nèi))相關(guān)的功能性circRNA[31]。這些circRNA在多種癌癥中起癌基因或抑癌作用[32]。據(jù)報(bào)道[21,33]circFBXW7具有抑癌作用,在正常腦組織中大量表達(dá),在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中下調(diào)[20]。但是,TNBC中circFBXW7的生物學(xué)功能和作用仍然不清楚。本研究探討了circFBXW7在TNBC中的作用機(jī)制及臨床價(jià)值,使用Kaplan-Meier方法分析了240例TNBC患者的circFBXW7表達(dá)水平來評(píng)判OS和DFS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低circFBXW7水平的乳腺癌患者的OS和DFS較差。且Cox分析結(jié)果顯示,高表達(dá)circFBXW7患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)明顯升高。這些結(jié)果表明circFBXW7的低表達(dá)與TNBC患者較差的臨床預(yù)后密切相關(guān)。由此可以推斷circFBXW7可能是TNBC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

    筆者在之前的研究中檢測(cè)了TNBC 細(xì)胞系(MDA-MB-231 和HCC1806)中circ FBXW7的表達(dá)水平,其表達(dá)水平較低,通過過表達(dá)circFBXW7后,用CCK8法檢測(cè)MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞增殖情況并使用Transwell小室法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中,過表達(dá)MDA-MB-231 和HCC1806 細(xì)胞中circFBXW7水平后,顯著抑制了MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞的增殖、侵襲能力,同時(shí),兩種細(xì)胞的miR-197-3p表達(dá)水平也明顯降低。然而,使用miR-197-3p抑制劑后,circFBXW7表達(dá)降低所致的細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)被明顯抑制。以上結(jié)果提示,circFBXW7可能通過吸附miR-197-3p,減少其表達(dá),抑制腫瘤的發(fā)展。

    總之。本研究表明,circ FBXW7 可以抑制TNBC 的發(fā)生發(fā)展,其作用機(jī)制可能與通過miRNA海綿作用吸附miR-197-3p的作用有關(guān),circFBXW7有望成為TNBC預(yù)后生物標(biāo)志物及潛在治療靶標(biāo)。

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