2017-2020年江門地區(qū)兒童手足口病流行病學(xué)特征及非EV71型非CA16型腸道病毒型別分析

阮燕如 陸少顏

【摘要】 目的：分析廣東省江門市2017-2020年手足口病的流行特征，了解非EV71型非CA16型腸道病毒的分子流行病學(xué)特征，為本市進(jìn)一步臨床治療和防控工作提供科學(xué)依據(jù)。方法：通過全國傳染病報告信息管理系統(tǒng)收集2017-2020年本市手足口病患兒資料，收集整理2017-2020年本院信息系統(tǒng)報告的手足口病例及分析其流行特征，采用熒光RT-PCR法對疑似手足口病患者標(biāo)本同時進(jìn)行EV通用型、EV71型、CA16型檢測，并選取EV71型和CA16陰性而EV通用型陽性的標(biāo)本進(jìn)行型別鑒定，設(shè)計5非編碼區(qū)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行序列測定，最后對核苷酸的同源性進(jìn)行比對及確定病毒的型別。結(jié)果：2017-2020年江門市共報告HFMD總發(fā)病人數(shù)為31 709例，其中2017年報告病例數(shù)最高。4年內(nèi)共采集了因懷疑手足口病到本院就診患兒的2 587例標(biāo)本，并同時進(jìn)行EV通用型、EV71型、CA16型檢測，總陽性1 263例，總陽性率為48.82%。陽性主要以托幼兒童和男患兒為主。其中EV71核酸陽性173例，占13.70%;CA16核酸陽性282例，占22.33%;其他EV核酸陽性808例，占63.97%。在2017-2020年中確定屬于腸道病毒分型共87份，檢出的非EV71型非CA16型的腸道病毒有6種型別，分別為CA6、CA10、CA4、CA12、CA5、CA8，其中CA6是占主要的，為70.11%，其次是CA10占13.79%。結(jié)論：江門市手足口病的分布呈現(xiàn)出人群差異、季節(jié)差異，非EV71型非CA16型的腸道病毒病原譜有六種，病毒型別以CA6為主。應(yīng)持續(xù)進(jìn)行病原學(xué)檢測，掌握優(yōu)勢型別，為防控提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 手足口病 流行病學(xué) 病原學(xué)監(jiān)測 非EV71非CA16腸道病毒 病原譜

Epidemiological Characteristics of Hand Foot Mouth Disease and Analysis of Non EV71 and Non CA16 Enterovirus Types in Children in Jiangmen/RUAN Yanru， LU Shaoyan. //Medical Innovation of China， 2021， 18（12）： 0-101

[Abstract] Objective： To analyze the epidemiological characteristics of hand foot mouth disease （HFMD） in Jiangmen City， Guangdong Province from 2017 to 2020， and to understand the molecular epidemiological characteristics of non EV71 and non CA16 enterovirus， so as to provide scientific basis for further clinical treatment and prevention and control. Method： Through the national infectious disease reporting information management system to collect the information of HFMD cases in our city from 2017 to 2020， the HFMD cases reported in our hospital from 2017 to 2020 were collected and sorted out and their epidemic characteristics were analyzed. The samples of suspected HFMD patients were detected by fluorescent RT-PCR， and EV71 and CA16 were selected as negative， while EV universal was positive， 5 non coding region specific primers were designed. RT-PCR was used to amplify the 5 non coding region specific primers， and then the sequences were determined. Finally， the nucleotide homology was compared and the virus type was determined. Result： A total of 31 709 HFMD cases were reported in Jiangmen City from 2017 to 2020， among which the highest number was reported in 2017. A total of 2 587 samples of suspected HFMD patients in our hospital were collected in 4 years， and EV universal， EV71， CA16 were detected at the same time， the total positive rate was 48.82% （1 263 cases）. The positive rate was mainly in children and men. Among them， 173 cases were EV71 nucleic acid positive， accounting for 13.70%; 282 cases were CA16 nucleic acid positive， accounting for 22.33%; 808 cases were other EV nucleic acid positive， accounting for 63.97%. A total of 87 enterovirus genotypes were identified in 2017-2020， six types （CA6， CA10， CA4， CA12， CA5， CA8） of enterovirus were detected， including non EV71 and non CA16， among which CA6 was the main， accounting for 70.11%， followed by CA10， accounting for 13.79%. Conclusion： The distribution of HFMD in Jiangmen City shows population and seasonal differences， there are six kinds of enterovirus spectrum of non EV71 and non CA16， and CA6 is the main virus type. The pathogen detection should be carried out continuously to master the dominant types and provide the basis for prevention and control.

[Key words] HFMD Epidemiology Etiology monitoring Non EV71 and non CA16 enterovirus Pathogen spectrum

First-authors address： Jiangmen Maternity and Child Health Care Hospital， Jiangmen 529000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.12.023

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒（EV）感染引起的兒童常見傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，臨床癥狀主要為發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)水皰，個別患兒可發(fā)生心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等致命性疾病[1-2]。2008年，我國將手足口病定為丙類傳染病。自1957年報道HFMD疫情以來，腸道病毒71型（enterovirus71，EV71）和柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus16，CA16）是兩種主要的HFMD病原體，但近年來全國手足口病病原譜發(fā)生了改變，因而非EV71型非CA16型腸道病毒引起的HFMD同樣不容忽視[3]。近年來，有關(guān)非EV71型非CA16型腸道病毒引起手足口病的報道在國內(nèi)乃至全球成逐年上升的趨勢。近年來我國局部地區(qū)有小暴發(fā)，特別是在2008年我國全國首次出現(xiàn)大規(guī)模的手足口病暴發(fā)，2008年至今感染手足口病例多達(dá)幾百萬人次。因此，為了更進(jìn)一步了解手足口病流行特征和病原變化趨勢，掌握近年來手足口病的流行特征，評價和改進(jìn)現(xiàn)行的防治措施，本研究將對2017-2020年江門地區(qū)HFMD病原檢測結(jié)果進(jìn)行總結(jié)分析以及分子流行病學(xué)分析，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2017-2020年江門市手足口病患兒資料，資料來源于全國傳染病報告信息管理系統(tǒng)的手足口病疫情數(shù)據(jù)。收集2017年1月-2020年12月因懷疑手足口病到本院就診患兒的2 587份標(biāo)本，標(biāo)本大部分為肛拭子（約占90%），其中少量為咽拭子、腦脊液、大便和皰疹液，年齡10 d～6歲，其中男1 568例，女1 019例。嚴(yán)格按照《手足口病預(yù)防控制指南（2014年版）》要求采集標(biāo)本、運(yùn)輸、保存和處理標(biāo)本。病原學(xué)標(biāo)本均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查和患者家屬簽署知情同意書后采集。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 使用西安天隆NP968型全自動核酸提取儀及配套的腸道病毒RNA試劑提取RNA。

1.2.2 病原學(xué)熒光RT-PCR方法檢測 2 587份標(biāo)本均同時進(jìn)行腸道病毒通用型、CA16型、EV71型檢測，試劑使用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)的手足口病腸道病毒實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒，對CA16型、EV71型陰性而腸道病毒通用型陽性的標(biāo)本作為本次研究的對象。使用美國ABI7500型實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，結(jié)果按照說明書進(jìn)行判斷。

1.2.3 非EV71型、非CA16型腸道病毒的PCR檢測 對腸道病毒基因組的5，端非編碼區(qū)設(shè)計特異性引物[4]。使用RNA快速純化試劑盒提取病毒RNA作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄再進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳，把電泳片段符合大小的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因進(jìn)行測序，最后對核苷酸的同源性進(jìn)行比對及確定病毒的型別。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用流行病學(xué)方法分析手足口病流行特征，數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010軟件。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)特征

2.1.1 時間分布 2017-2020年江門市共報告HFMD總發(fā)病人數(shù)為31 709例，其中，2017年報告病例數(shù)最高12 476例。手足口病發(fā)病每個月均有病例報告，從總體曲線分析，2017-2018年每年2-3月發(fā)病人數(shù)最低，隨后逐漸上升，到6月達(dá)到高峰，隨后慢慢下降，8月降至最低，隨后又有上升趨勢，到冬季又出現(xiàn)高峰。2019年6月達(dá)到高峰后，病例逐漸減少，冬季也沒有再出現(xiàn)高峰，而2020年本市HFMD病例一直維持低發(fā)病水平，流行曲線表現(xiàn)為非流行狀態(tài)，發(fā)病強(qiáng)度始終保持在基線以下，原因與新冠肺炎疫情影響有關(guān)。2017-2020年江門市HFMD發(fā)病的時間分布，見圖1。

2.1.2 人群分布 收集2017年1月-2020年12月因懷疑HFMD到本院就診患兒的2 587份標(biāo)本。2 587份標(biāo)本均同時進(jìn)行腸道病毒通用型、CA16型、EV71型檢測，總陽性1 263份。1 263例手足口病患兒以托幼兒童為主，905例（905/

1 263，71.65%）;散居兒童，315例（315/1 263，24.94%）;學(xué)生43例（43/1 263，3.41%），見圖2。年齡分布，出現(xiàn)HFMD年齡最小2個月，最大6歲，其中發(fā)病集中在0～5歲兒童，1～3歲是高發(fā)年齡，占比由高到低為2～3歲（543/1 263，42.99%），1～2歲（347/1 263，27.47%），3歲以上（212/1 263，16.78%），0～1歲（161/1 263，12.75%）。性別分布，各年齡段HFMD男患兒均多于女患兒，在總腸道病毒陽性的1 263例患者中，男患兒806例，女患兒457例，男女性別比例為1.76︰1。

2.2 病原學(xué)檢測 2017-2020年同時進(jìn)行3類病毒檢測的手足口病標(biāo)本2 587份，總陽性1 263份，總陽性率為48.82%，全陰性標(biāo)本為1 324份，占51.18%。其中EV71核酸陽性173份，占13.70%;CA16核酸陽性282份，占22.33%;其他EV核酸陽性808份，占63.97%。不同年份的優(yōu)勢病原具有不同的流行趨勢，CA16和EV71等腸道病毒同時存在，交替流行。2017-2020年其他EV占當(dāng)年檢出病毒的構(gòu)成比依次為59.69%、55.86%、73.55%、76.67%，見表1。均無重癥病例和死亡病例。

2.3 非EV71非CA16腸道病毒擴(kuò)增及分析 2017-2020年同時進(jìn)行3類病毒檢測的手足口病標(biāo)本

2 587份，總陽性1 263份，其中其他EV核酸陽性808例，實(shí)驗室對這些標(biāo)本進(jìn)行隨機(jī)抽取實(shí)驗，2017-2020年每年各隨機(jī)選取了45份標(biāo)本提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行普通PCR，2017年成功擴(kuò)增32份，2018年成功擴(kuò)增28份，2019年成功擴(kuò)增33份，2020年成功擴(kuò)增23份，電泳片段符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送深圳華大基因測序，序列進(jìn)行比對后，確定屬于腸道病毒分型共87份標(biāo)本，其中CA6在非EV71型非CA16型腸道病毒中占主要病原，檢出率為70.11%，第二位是CA10病毒，檢出率為13.79%。各型別病原譜，見表2。

3 討論

手足口病是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛流行的嬰幼兒高發(fā)性腸道傳染病，因其嚴(yán)重威脅嬰幼兒的健康而越來越被各國政府和衛(wèi)生部門所重視。我國不同地區(qū)也已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的流行，因此手足口病已成為我國日益關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[5]。以前，國內(nèi)手足口病病原學(xué)研究大多集中在EV71型和CA16型[6]，近年來，非EV71型和非CA16型其他非傳統(tǒng)型別的優(yōu)勢病原引起的手足口病逐漸受到關(guān)注，其中，CA6、CA10等已在我國引起過較大規(guī)模的疫情。Guan等[7]對2009-2013年的山東濟(jì)南地區(qū)的非EV71和非CA16型別的腸道病毒流行情況研究時發(fā)現(xiàn)手足口病感染的主要病原是CA6和CA10，而不是EV71和CA16。因此，對非EV71型和非CA16型別的腸道病毒進(jìn)行研究已逐漸達(dá)成共識。在此背景下，本研究對2017-2020年引起手足口病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和了解手足口病的病原學(xué)構(gòu)成研究，對其傳播危險因素疫情預(yù)警等進(jìn)行分析，以便采取有效的預(yù)防控制措施，降低手足口病的發(fā)生率，更好地為臨床提供依據(jù)。

本次研究結(jié)果表明，2017-2020年本市手足口病曲線呈季節(jié)性，在每年的5-7月形成高峰，在9-11月又出現(xiàn)一個小高峰，這與文獻(xiàn)[8-10]報道相一致。因腸道病毒適合濕熱條件下生長，而每年的5-7月氣溫上升，環(huán)境濕度較大，病毒易于生存且容易傳播，所以發(fā)病的季節(jié)性與病毒的流行特征相符合，呈正相關(guān)關(guān)系[11]。2020年疑似病例報告數(shù)和腸道病毒檢出率大幅下降，排除疫苗接種的影響，更重要的原因是受到新冠肺炎疫情的影響，大家的防控意識增強(qiáng)。

發(fā)病人群分布結(jié)果顯示，男患兒發(fā)病率遠(yuǎn)高于女患兒，手足口病發(fā)病率在性別上的差異目前暫無科學(xué)的研究，大多數(shù)認(rèn)為可能與男性好動，更容易接觸病毒有關(guān)[12]。發(fā)病年齡以5歲以下兒童多見，與其自身免疫系統(tǒng)尚未完善、此年齡段的兒童活潑好動、個人衛(wèi)生習(xí)慣不到位有關(guān)。而1歲以內(nèi)嬰幼兒活動范圍受限，加上從母體獲得免疫力，因此1歲以內(nèi)的嬰幼兒的發(fā)病率相對較低。托幼兒童是本市手足口病發(fā)病最多的群體，占發(fā)病總數(shù)的71.65%，其次是散居兒童，占發(fā)病總數(shù)的24.94%，兩者占所有發(fā)病人數(shù)的96.59%。由于腸道病毒通過糞-口途徑傳播和接觸傳播，由于托幼兒童容易聚集，交叉接觸，因而針對托幼機(jī)構(gòu)，相關(guān)部門要加強(qiáng)監(jiān)督管理，加強(qiáng)老師和管理者的防控觀念，及時采取有效的預(yù)防措施，同時教育兒童養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣，避免發(fā)生暴發(fā)流行。

2017-2020年共收集和檢測了因懷疑手足口病到本院就診患兒的2 587例標(biāo)本，并同時進(jìn)行EV通用型、EV71型、CA16型檢測，分析EV71型、CA16型、非EV71型和非CA16型腸道病毒在手足口患者中的流行情況。EV71病毒在這四年中的標(biāo)本陽性平均檢出率為10.21%，EV71所占病原構(gòu)成比總體上呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能與EV71疫苗在全國大范圍推廣有關(guān)，而CA16在四年中的檢出率相對平穩(wěn)。非EV71型和非CA16型腸道病毒在2017-2020年手足口病病原中占比一直都很高，已成為手足口病感染的主要病原體，其中2017-2020年的非EV71型和非CA16型腸道病毒的檢出率分布為59.69%、55.86%、73.55%、76.67%，從本統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然這四年的手足口病沒有前幾年大規(guī)模流行，但引起手足口病的病原體已經(jīng)有了較大的變化，非EV71型和非CA16型的其他腸道病毒已經(jīng)成為主要病原，這與國內(nèi)一些研究相同[13-15]。

為了進(jìn)一步分析非EV71型和非CA16型腸道病毒具體型別，2017-2020年每年隨機(jī)抽取了腸道病毒通用型陽性而EV71型和CA16型陰性的標(biāo)本各45例，再提取RNA及測序分析。確定屬于腸道病毒分型共87份標(biāo)本，共確定了6種型別，其中CA6在非EV71型非CA16型腸道病毒中占主要病原，檢出率為70.11%，第二位是CA10病毒，檢出率為13.79%，這與國內(nèi)外許多學(xué)者的研究相一致，如張穎等[16]對廣州地區(qū)在2010-2015年手足口病原檢測和流行分析研究時發(fā)現(xiàn)CA6的比例是非EV71型和非CA16型的腸道病毒最高，其次是CA10。而國內(nèi)部分地區(qū)結(jié)果顯示CA10是非EV71型和CA16型腸道是病毒的首位，如王海濱等[17]對北京市朝陽區(qū)手足口非EV71型非CA16型腸道病毒的基因型分析CA10為EV-U的首位;孫國清等[18]對河南省安陽市手足口病相關(guān)柯薩奇病毒研究發(fā)現(xiàn)近年來CA10的流行水平較CA6高并存在總體上升的風(fēng)險。

目前，隨著EV71疫苗的廣泛應(yīng)用，對手足口病的流行特征和病原譜帶來了顯著的變化，如何根據(jù)這些變化而做出相應(yīng)的防控措施，還待進(jìn)一步研究。自2008年手足口病暴發(fā)以來，EV71和CA16成為主要病原體[19-20]。但近年來，非EV71型非CA16型腸道病毒比例逐漸上升，或?qū)⑷〈鶨V71、CA16成為主要病原體，因而如何確定型別，加強(qiáng)對手足口病原譜的日常監(jiān)測，掌握其分子流行病學(xué)特征，為手足口病的防控和臨床治療提供可靠的依據(jù)。

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（收稿日期：2021-02-02） （本文編輯：程旭然）