獼猴桃潰瘍病枝條揮發(fā)物的GC-MS分析

周良強(qiáng) 汪洋 張景榮 陳莉 唐立忠 李臻 卓明 黃昭賢

摘 要 為了研究獼猴桃感染潰瘍病后枝條揮發(fā)物的組分特征，給探索獼猴桃潰瘍病的病理和抗性機(jī)制提供參考，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)鑒定健康枝條和感病枝條揮發(fā)物的化學(xué)成分，采用離子流峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對含量。結(jié)果：從獼猴桃健康和感病枝條的揮發(fā)物中分別鑒定出73 和 67個揮發(fā)性化合物，合計(jì)81種成分，二者相同組分59個，包括烷烴類、烯烴類、醇類、酚類、醛類、酮類、苯環(huán)類化合物、雜環(huán)類化合物、呋喃類和含氮化合物，其中烷烴類化合物和苯環(huán)類化合物為獼猴桃枝條的主要成分。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，感病枝條中含有2-乙基甲苯、2，3，5，6-四甲基苯酚等8種特有物質(zhì)，且4-乙基甲苯、十八烷等物質(zhì)比健康枝條含量明顯降低。

關(guān)鍵詞 獼猴桃潰瘍病;枝條;揮發(fā)物;GC-MS分析

中圖分類號：S436.634 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.10.001

獼猴桃（Actinidia Lindl.）富含多種氨基酸、礦物質(zhì)和維生素C，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值與保健功效，現(xiàn)已成為許多地區(qū)的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)[1-3]。獼猴桃果肉顏色多樣，其中，紅心獼猴桃口感佳、色彩美，頗受消費(fèi)者青睞。自1997年世界上首個紅心獼猴桃品種——中華獼猴桃‘紅陽育成以來，紅肉品種的選育成為了研究熱點(diǎn)。爾后，以‘紅陽獼猴桃為材料選育出一系列紅肉新品種，如‘紅華‘晚紅‘東紅‘紅什1號 [4-7]，已作為我國獼猴桃育種中最主要的骨干親本[8]。紅心類型的獼猴桃品種，雖然其食用品質(zhì)優(yōu)異，但大多對潰瘍病敏感[9]，目前，主流學(xué)者認(rèn)為該病由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae，Psa）引起。獼猴桃潰瘍病具有傳播快、致病力強(qiáng)、難治愈等特點(diǎn)，是一種毀滅性的病害，可導(dǎo)致短期內(nèi)大面積植株死亡，給生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[10]。四川是全國獼猴桃主要產(chǎn)區(qū)之一，近年全省獼猴桃種植面積逐年增加，產(chǎn)量位居全國前列，其中，紅心獼猴桃產(chǎn)量占全國紅心獼猴桃的90%以上[11]。獼猴桃潰瘍病在四川省各大栽培區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，近年來呈現(xiàn)逐步蔓延、病情不斷加重的趨勢。以往對獼猴桃潰瘍病的研究多側(cè)重于防治策略，包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治方法[12-13]。最近，李亞巍等對該病菌在田間感病獼猴桃植株上的分布情況及侵染后的傳播規(guī)律進(jìn)行了報(bào)道[14];李靖等鑒定了四川主栽獼猴桃品種對潰瘍病的抵抗能力[15]。

獼猴桃潰瘍病會導(dǎo)致植株產(chǎn)生抗感生理反應(yīng)，引起體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化。迄今對獼猴桃組織中揮發(fā)性病理產(chǎn)物的研究尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS System）分別分析了‘紅陽獼猴桃健康植株枝條與感潰瘍病枝條的韌皮部、木質(zhì)部及髓心組織中揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的種類和含量差異，旨在為探索獼猴桃潰瘍病的病理和抗性機(jī)制提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

2020年3—5月，值獼猴桃潰瘍病高發(fā)期，分別于雅安市的名山區(qū)、雨城區(qū)、蘆山縣采集‘紅陽獼猴桃感病枝條;在成都雙流一個9年未發(fā)生潰瘍病的獼猴桃園區(qū)采集健康枝條。采后，先用超純水洗去枝條表面的灰塵和雜質(zhì)，待晾干后在健康和染病枝條部位分離出韌皮部、木質(zhì)部、髓部三類組織，染病枝條在節(jié)間處病斑取樣，對照選取與感病枝條同等枝齡和粗度的健康枝條。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 樣品處理

每個樣品取0.2 g放入裝有吸附劑PorapakQ80/100的提取管中，密閉吸附48 h后，去除樣品，加入適量正己烷浸泡30 min。取上清液再經(jīng)微孔過濾膜過濾后置于進(jìn)樣瓶中待測。

1.2.2? 揮發(fā)物檢測

采用安捷倫7890B-7000D氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為HP-5MS （30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣量為1 μL，升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min，之后以每分鐘上升6 ℃到280 ℃，保持3 min，最后以每分鐘上升6 ℃到310 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣。離子源溫度為280 ℃，質(zhì)譜掃描范圍m/z為50～500。

1.2.3? 揮發(fā)物定性與半定量

根據(jù)GC/MS總離子圖，對各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，通過檢索比對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)庫（NIST14），并結(jié)合匹配分?jǐn)?shù)、各成分的保留時間、質(zhì)譜裂片圖及文獻(xiàn)查對，鑒定其化學(xué)成分。采用離子流峰面積歸一化法計(jì)算各揮發(fā)物組分的相對含量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 健康和潰瘍病獼猴桃枝條揮發(fā)物總離子流圖

通過動態(tài)頂空吸附法+氣相色譜-質(zhì)譜法分離到多種化學(xué)成分，得到健康和潰瘍病獼猴桃枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心樣品揮發(fā)物成分檢測的總離子流圖（見圖1、圖2）。

通過CAS號檢索和文獻(xiàn)核對，在健康枝條和潰瘍病枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心中共鑒定出81個化合物（見表1），其中苯環(huán)類化合物25個、烷烴類23個、烯烴類11個、醇類4個、酚類4個、酯類3個、呋喃類3個、雜環(huán)類化合物2個、酮類2個、醛類2個，含氮和含碘化合物各1個。按離子流峰面積歸一化計(jì)算各揮發(fā)物組分的相對含量，結(jié)果顯示在健康和感病枝條的韌皮組織、木質(zhì)組織和髓心中，均以1，2-二乙苯含量最高，達(dá)65%以上。

2.2? 健康與感病枝條揮發(fā)性化合物組分差異

由表1可知，健康枝條與感病枝條3種不同組織的化學(xué)成分組成存在明顯差異的有22個，包括苯環(huán)類化合物、醇類、酚類、烷烴類、烯烴類，其中，4-丙基甲苯（C10H14）、1-丁烷-2-基-2，4-二甲基苯（C12H18）、香芹酚（C10H14O）、乙酸橙花叔醇酯（C17H28O2）、柏木腦（C15H26O）和3，4-環(huán)氧四氫呋喃（C20H30O4）等14個成分僅存在于健康獼猴桃枝條中，而2-乙基甲苯（C9H12）、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯（C10H12）、5-甲基-2，3-二氫-1H-茚（C10H12）、2，3，5，6-四甲基苯酚（C10H14O）和2，6，11，15-四甲基十六烷（C20H42）等8個化合物僅存在于潰瘍病獼猴桃枝條中。

2.3? 健康與感病枝條揮發(fā)性化合物相同組分含量變化

健康獼猴桃枝條與潰瘍病獼猴桃枝條共有59個相同揮發(fā)性化合物，其中有些成分的含量在二者中存在較大的差異。與健康枝條相比，在感病枝條中，對二乙基苯（C10H14）含量大幅增高，而4-乙基甲苯（C9H12）、3-乙基苯甲醛（C10H12）、4-異丙基苯甲醇（C10H14O）、正十七烷（C17H36）和正十八烷（C18H38）等含量明顯降低。

3? 結(jié)論與討論

本研究采用頂空固相微萃取與氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）的方法，分析了獼猴桃健康和感潰瘍病枝條揮發(fā)物的成分。從健康和感病枝條中，共測定出苯乙烯（C8H8）、正丙基苯（C9H12）、油酸酰胺（C18H35NO）等81種揮發(fā)物組分，結(jié)果表明健康和感潰瘍病獼猴桃枝條揮發(fā)物的主要成分為1，2-二乙苯（C10H14）、2，4-二甲基苯乙烯（C10H12）和對乙基苯乙酮（C10H12O），二者揮發(fā)性化學(xué)物種類差異較大，且部分相同化合物的含量也存在明顯差異。在枝條的木質(zhì)組織中，揮發(fā)物中的萘（C10H12）、油酸酰胺（C18H35NO）和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（C15H24O）3種物質(zhì)含量感病枝比健康枝低，感病枝分別為健康枝的23%、19%和16%。而2-乙基甲苯（C9H12）、1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）苯（C10H12）、2，3，5，6-四甲基苯酚（C10H14O）、5-甲基-2，3-二氫-1H-茚（C10H12）等8個化合物僅在感病枝中檢測出。由此可見，獼猴桃枝條感染潰瘍病后其揮發(fā)物的含量發(fā)生了明顯的變化。有研究表明，植物受到病蟲害的侵害時，會產(chǎn)生許多次生代謝物質(zhì)來進(jìn)行調(diào)節(jié)，以抵抗病蟲害的侵襲[16]。

關(guān)于獼猴桃潰瘍病的致病機(jī)制，普遍認(rèn)為是丁香假單孢細(xì)菌感染所致。而本研究中，在染病枝條中還發(fā)現(xiàn)真菌侵染。本文發(fā)現(xiàn)的差異揮發(fā)物可能是獼猴桃在遭受病原侵害后的病理代謝產(chǎn)生，也可能由病原代謝的合成或降解所產(chǎn)生。有研究者在感病枝條中普遍發(fā)現(xiàn)小蠹蟲，從而認(rèn)為該病害是由小蠹蟲為害引起[17]。大量的研究證實(shí)，植物揮發(fā)物對昆蟲產(chǎn)生引誘或驅(qū)避作用[18-20]。本研究中，感染潰瘍病后枝條的特有揮發(fā)物質(zhì)，也可能與植物驅(qū)避小蠹蟲等昆蟲的生理生化作用有關(guān)。有關(guān)上述問題的科學(xué)解答，還需要進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）