基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究龍血竭對原發(fā)性高血壓食蟹猴血壓和生化指標的影響

方雪灣鐘建雄岳桂華林發(fā)全熊萬娜黎 芳梁健欽

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧530001； 2.梧州市人民醫(yī)院，廣西 梧州543000； 3.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，廣西 南寧530023； 4.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530021； 5.廣西中醫(yī)藥大學中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧530001； 6.廣西優(yōu)勢中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧530001）

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是一種常見的心血管系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)以體循環(huán)動脈壓升高為主，可誘發(fā)及促進冠狀動脈粥樣硬化、腦血管意外、心肌梗死等病的發(fā)生，具有患病率高、并發(fā)癥多的特點，中醫(yī)認為EH 屬“中風”“頭痛”“眩暈”等范疇。課題組通過流行病學調(diào)查方法分析632 例高血壓病患者的中醫(yī)癥狀與證候要素的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)高血壓病的中醫(yī)證候要素分布中瘀證占47.9%［1］，在另外一項調(diào)查中［2］發(fā)現(xiàn)痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)3 種體質(zhì)體現(xiàn)出EH 患者的民族差異性，可見血瘀是高血壓患者一個重要證型。因此，中西醫(yī)結(jié)合治療高血壓可從改善靶器官微循環(huán)著手，活血化瘀在治療中具有重要意義［3］，臨床發(fā)現(xiàn)活血化瘀方法治療EH 獲得良好療效［4?5］。龍血竭是從植物劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis（Lour.）S.C.Chen 的含脂木材中提取得到的樹脂［6］，是傳統(tǒng)名貴中藥和壯藥，具有抗血栓、抗炎、抗菌、活血、止血、活血化瘀等作用［7?11］。課題組［12］證實龍血竭還有降血壓作用。本文考察龍血竭對EH 食蟹猴血壓及血小板、凝血酶的影響，評價龍血竭的降壓作用和對凝血的影響，最后借助網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，構(gòu)建成分靶點、EH 疾病靶點的互作網(wǎng)絡(luò)，挖掘EH 的發(fā)病機制，預測龍血竭的藥理作用和機理，預測龍血竭治療EH 的化學成分、作用靶點和作用通路，以期為龍血竭的藥效物質(zhì)研究提供基礎(chǔ)，同時為后續(xù)作用機制的驗證實驗提供的理論依據(jù)，對龍血竭藥理作用的發(fā)現(xiàn)以及新藥研發(fā)具有重要意義。

1 材料

1.1 藥物 龍血竭（廣西中醫(yī)藥大學制藥廠，批號20150301）；卡托普利片（湖南湘雅制藥有限公司，批號1511111）。

1.2 儀器 日立7600?020 全自動生化分析儀（日本日立公司）；ST16R 型臺式低速溫離心機（美國Thermo 公司）；MDF?UT386S 型－80 ℃超低溫冰箱（日本SANYO 公司）；Dash 2500 監(jiān)護儀［通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)（中國）有限公司］。

1.3 動物 EH 食蟹猴（符合WHO?ISH 《高血壓治療指南》 公布的診斷標準：收縮壓≥140 mmHg 和／或舒張壓≥90 mmHg）、正常血壓食蟹猴，均由廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司提供，動物使用許可證號SYXK（桂）2014?0004。

1.4 數(shù)據(jù)庫及軟件 TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php ）、PubChem Compound 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、TTD 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／db.idrblab.org／ttd／）、String 數(shù)據(jù)庫（version 11.0，https：／ ／string?db.org／）、Drugbank 數(shù)據(jù)庫（version 5.1.1，https：／ ／www.drugbank.ca／）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.uniprot.org／）、DRAR?CPI 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／cpi.bio?x.cn／）、PubMed 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／pubmed／）、CNKI 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.cnki.net）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.genecards.org／）、MalaCards數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.malacards.org／）、RCSB PDB（https：／ ／www.rcsb.org／）、Venny2.1.0（https：／ ／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny／index.html）、Cytoscape（version 3.7.2）、SPSS（ver?sion 17.0）。

2 方法

2.1 EH 食蟹猴入選 入選EH 模型的食蟹猴須同時滿足以下條件（1）非同日連續(xù)6 d 測得平均血壓≥140／90 mmHg；（2）剔除繼發(fā)性高血壓的、EH 并發(fā)其他疾病的、現(xiàn)仍服用藥物或服藥后未過洗凈期的、不配合血壓檢測的。最終，從324 只成年食蟹猴中篩選得到16 只EH 食蟹猴，雄性14 只、雌性6 只，年齡（18.8±3.7）歲，體質(zhì)量（7.9±1.9）kg。

2.2 動物分組與給藥 EH 食蟹猴隨機分為龍血竭高劑量組（0.72 g／kg）、龍血竭低劑量組（0.18 g／kg）、卡托普利陽性對照組（7.52 mg／kg）和模型組，每組4 只，正常血壓食蟹猴4 只（雄、雌各半）為空白對照組，各組均自由進食、飲水，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%。除空白對照組、模型組灌胃給予安慰劑（由食用色素、水調(diào)配至顏色與CDB 相近，即得）外，其他各組灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1 次、每周連續(xù)給藥6 d，4 周為1 個療程，共4 個療程。

2.3 指標測定 在食蟹猴清醒狀態(tài)下測定收縮壓、舒張壓，連續(xù)6 次取平均值，隔1 d 測定1 次，比較組間及治療前后血壓的變化情況。在食蟹猴空腹狀態(tài)下，分別于給藥治療前、每周最后1 次給藥后2 h 抽取血靜脈血各8 mL，采用全自動生化分析儀檢測血小板和凝血酶原時間。

2.5 龍血竭化學成分及其作用靶點分析 龍血竭包含多種化合物，主要包括黃酮類、查耳酮類、多聚查耳酮類、黃烷類、高異黃烷類、色原酮類、簡單酚類、甾體皂苷類、三萜類、脂肪醇及其酯類等［13?14］，通過TCMSP 和PubMed等數(shù)據(jù)庫搜索龍血竭成分，結(jié)合CNKI 及NCBI 文獻報道的龍血竭 主要化 學成分，通 過 TCMSP、ChemSpider、PubChem 等數(shù)據(jù)庫進行化合物結(jié)構(gòu)確證，最后以TCMSP 數(shù)據(jù)庫中化合物的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug?likeness，DL）≥0.18［15］以 及Lipinski 原則［16］為標準，篩選得出目標化合物，保存為mol2 格式文件，導入DRAR?CPI 數(shù)據(jù)庫預測成分靶點。以Z’ ?score＜－1.0 為標準［17］篩選出各成分對應(yīng)的靶蛋白。使用Uniprot 及RCSB PDB 數(shù)據(jù)，把PDB ID 及對應(yīng)的靶蛋白轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名稱（gene name），即靶點。若PDB ID對應(yīng)多個基因，則核對相對應(yīng)的靶蛋白進行選擇基因，確保靶蛋白和基因名一對一，并去除查找不出結(jié)果的PDB ID及對應(yīng)蛋白，匯總?cè)ブ?，最終得到成分靶點。

2.6 EH 疾病靶點分析 以“essential hypertension”為關(guān)鍵詞在TTD 中進行檢索，使用UniProt 數(shù)據(jù)庫對TTD 中獲取的疾病靶點進行認證，去除搜索結(jié)果為非“homo sapiens（Human）”的靶點及蛋白名和靶基因名（target Name）不一致靶點，最終獲得EH 病癥靶點。

2.7 KEGG、GO 富集分析和關(guān)聯(lián)的疾病分析 將靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，進行KEGG、GO 富集分析。提取前10 條信號通路，分別采用MalaCards 數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)疾病分析，對每條通路搜索結(jié)果的前200 個疾病進行匯總統(tǒng)計，得到相關(guān)性最大的前10 種疾病。

2.8 網(wǎng)絡(luò)可視化 Cytoscape 構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點的大小由degree 決定，degree 越大，節(jié)點越大；節(jié)點顏色由聚類系數(shù)決定，顏色相近的節(jié)點為同一類。

3 結(jié)果

3.1 組間收縮壓、舒張壓的比較 在收縮壓比較方面：（1）給藥前，各組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明入選的EH 食蟹猴的收縮壓高于普通食蟹猴的；（2）給藥后，與模型組比較，卡托普利陽性對照組、龍血竭高劑量組收縮壓降低（P＜0.05），龍血竭低劑量組組未顯示降低收縮壓的作用（P＞0.05）（3）給藥前后，龍血竭低劑量組組間均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在舒張壓比較方面：（1）給藥前，各組與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明入選的EH 食蟹猴的舒張壓高于普通食蟹猴的舒張壓；（2）給藥后，與模型組相比，卡托普利陽性對照組、龍血竭高劑量組可降低舒張壓（P＜0.05），但龍血竭低劑量組未顯示降低舒張壓作用（P＞0.05）。因此，龍血竭具有降低EH 食蟹猴收縮壓、舒張壓的作用。見表1。

表1 龍血竭對EH 食蟹猴血壓的影響（， n＝4，1 mmHg＝0.133 kPa）

表1 龍血竭對EH 食蟹猴血壓的影響（， n＝4，1 mmHg＝0.133 kPa）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

3.2 組間血小板計數(shù)的比較 龍血竭低劑量組對血小板計數(shù)沒有影響（P＞0.05），龍血竭高劑量組在給藥后第3、4周血小板計數(shù)水平降低（P＜0.05），說明龍血竭對血小板數(shù)有減少作用，但對高血壓狀態(tài)下血小板數(shù)減少作用的起效時間較長。見表2。

表2 龍血竭對EH 食蟹猴血小板數(shù)量的影響（， n＝4）

表2 龍血竭對EH 食蟹猴血小板數(shù)量的影響（， n＝4）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

3.3 組間活化部分凝血酶原時間的比較 龍血竭低劑量組在給藥后第2、3 周，龍血竭高劑量組在第3、4 周，縮短活化部分凝血活酶時間（P＜0.05）。以上說明，CDB 可縮短活化部分凝血活酶時間，這與龍血竭止血作用有關(guān)［18］，其作用機制可能與縮短活化部分凝血活酶時間有關(guān)。見表3。

表3 CDB 對EH 食蟹猴活化部分凝血活酶時間的影響（， n＝4）

表3 CDB 對EH 食蟹猴活化部分凝血活酶時間的影響（， n＝4）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

3.4 EH 疾病靶點及發(fā)病機制分析 通過TTD 數(shù)據(jù)庫搜索得到76 個疾病靶點，經(jīng)篩選得出EH 疾病靶點46 個，包括ACE、ADRA1B、ADRB2、ADRB3、AVPR1A、EDNRA、PTGIR、REN等。如圖1 所示，疾病靶點網(wǎng)絡(luò)由46 個節(jié)點及207 條邊組成，平均節(jié)點度為9，平均局部聚類系數(shù)為0.599。GO 分析發(fā)現(xiàn)EH 與血液循環(huán)、血管直徑的調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)、化學信號介導的系統(tǒng)性動脈血壓調(diào)節(jié)、第二信使介導的信號轉(zhuǎn)導等412 個生物過程相關(guān)；與G 蛋白偶聯(lián)受體活性、信號受體活性、跨膜信號受體活性、G 蛋白偶聯(lián)胺受體活性、腎上腺素能受體活性等51 個分子功能有關(guān)。KEGG 分析結(jié)果顯示疾病靶點主要富集在神經(jīng)活性配體?受體相互作用、鈣信號通路、cGMP?PKG 信號通路、腎素分泌、血管平滑肌收縮等29 條通路或途徑上，即EH 發(fā)病與上述通路異常有關(guān)。

圖1 疾病靶點?通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 CDB 的主要成分、作用靶點和疾病 經(jīng)篩選得出18個化合物，分別是龍血素A、龍血素B、龍血素C、龍血素D、2′?甲氧基異甘草素、2，4，4′?三羥基二氫查耳酮、刺甘草查耳酮、劍葉龍血素A、劍葉龍血素B、劍葉龍血素C、7，4′?二羥基黃酮、7，4′?二羥基黃烷、7，4′?二羥基?3′?甲氧基黃烷、甘草素、異甘草素、Farnisin、Broussin、柑橘素，成分作用靶點116 個。GO 分析發(fā)現(xiàn)CDB 主要成分與代謝過程、對化學物質(zhì)的反應(yīng)、對有機環(huán)狀化合物的響應(yīng)、對脂質(zhì)的反應(yīng)、有機氮化合物代謝過程等1 052 個生物過程相關(guān)；與催化活性、類固醇激素受體、核受體活性、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性等129 個分子功能有關(guān)。KEGG 分析結(jié)果顯示成分靶點主要富集在癌癥的途徑、代謝途徑、內(nèi)分泌抵抗、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK 信號通路、補體與凝血級聯(lián)等152 條通路或途徑上，即龍血竭主要成分通過調(diào)節(jié)上述通路治療系列疾病。對排名前10 的通路進行分析，發(fā)現(xiàn)龍血竭可能作用的疾病分別是血管疾病、高血糖、心臟病、肺病、缺血、白血病、癌癥、胰島素樣生長因子Ⅰ缺乏癥、肝病及細胞因子缺乏癥等。見圖2。

圖2 龍血竭的“成分?靶點?通路?疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

3.6 龍血竭對EH 的作用機制分析 將化學成分靶點及疾病靶點匯總?cè)ブ氐脜R總靶點158 個，二者共同靶點為4 個，利用Venny 2.1.0 繪制疾病靶點及成分靶點韋恩圖，如圖3所示。將158 個靶點導入String 數(shù)據(jù)庫建立蛋白互作關(guān)系，并將結(jié)果導入Cytoscape 構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），由158 個節(jié)點及750 條邊組成，平均節(jié)點度為9.49，平均局部聚類系數(shù)為0.445。GO 分析結(jié)果顯示龍血竭可調(diào)節(jié)血液循環(huán)、對化學物質(zhì)的反應(yīng)、對刺激的反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)、血管直徑的調(diào)節(jié)等1 262 個生物過程，以及分子功能與催化活性、分子換能器活性、信號受體活性、類固醇激素受體、核受體活性等158 個分子功能。KEGG 分析結(jié)果顯示龍血竭可調(diào)控神經(jīng)活性配體?受體相互作用、鈣信號通路、癌癥的途徑、cGMP?PKG 信號通路、cAMP 信號通路等158 條通路，可能通過調(diào)節(jié)上述生物過程及通路防治EH。

圖3 疾病靶點?成分靶點韋恩圖

圖4 龍血竭影響EH 的“成分?靶點?通路”網(wǎng)絡(luò)圖

4 討論

心血管疾病的治療成為當今中、西醫(yī)學界的研究熱點。治療高血壓病的西藥甚多，作用靶點明確，降壓速度較快，但副作用相對較大。中藥治療高血壓方面，降壓幅度雖不及西藥，但其作用持久。許多中藥及復方制劑被證實可以減輕患者左室肥厚，具有在降壓的同時影響血液流變學和脂質(zhì)代謝，從而降低冠心病患病率，減少靶器官的損害，中藥對于高血壓病的長期防治是重要的［19］。

血瘀是高血壓患者重要證型。研究表明，高血壓患者中血瘀者約占76.7%，且各期均出現(xiàn)不同程度的血瘀證候，并以III 期＞II 期＞I 期為趨勢，血瘀證貫穿于高血壓病的始終［20］。如前所述，課題組發(fā)現(xiàn)高血壓病的中醫(yī)證候要素分布中瘀證占47.9%［1］，且發(fā)現(xiàn)痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)3種體質(zhì)體現(xiàn)出EH 患者的民族差異性［2］。因此，中西醫(yī)結(jié)合治療高血壓的方法之一是活血化瘀法。傳統(tǒng)的活血化瘀中藥或復方的確顯示一定降壓作用［21?23］，其機制大多有擴張血管、改善微循環(huán)［24］、降低血栓素、升高前列腺素水平［25］、降低血管緊張素［26］等。本實驗分別給予龍血竭、卡托普利，考察龍血竭對EH 食蟹猴血壓的影響，證實龍血竭對EH 食蟹猴有降血壓作用，作用大小與劑量有關(guān)。

EH 與血液微循環(huán)功能障礙密切相關(guān)，可能伴隨血管內(nèi)皮損傷。血液微循環(huán)功能障礙會導致血管和微血管受損，導致血液中的血小板聚集增加，同時血管內(nèi)皮損傷的加劇會導致凝血功能出現(xiàn)問題。本實驗證實了龍血竭對EH 食蟹猴血小板有抑制作用，并可縮短活化部分凝血活酶時間，具有活血化瘀作用。

EH 食蟹猴的動物實驗中觀察到龍血竭可以降血壓，但是考慮到龍血竭是一種中藥提取物，其降壓的成份有效和作用靶點尚未清楚。因此，在藥效的基礎(chǔ)上，本文進一步借用網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究方法，通過數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)對生物系統(tǒng)進行分析，構(gòu)建藥物?靶點?疾病網(wǎng)絡(luò)互作圖，具有系統(tǒng)性、整體性，能較好地對CDB 的作用機理進行初步預測。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理對CDB 中的已知成份及作用靶點進行分析，發(fā)現(xiàn)龍血竭可治療包括心血管在內(nèi)的多種疾病，這與龍血竭的“活血化瘀”功效一致。通過GO 分析和KEGG 通路分析，又發(fā)現(xiàn)龍血竭可能通過對AVPR1A、GATM、F7 等靶點，參與調(diào)節(jié)血液循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、對脂質(zhì)的反應(yīng)、調(diào)節(jié)血壓等，參與腎素分泌、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體?受體相互作用等信號通路的調(diào)控。

綜上所述，龍血竭對EH 食蟹猴具有降壓作用，抑制高血壓狀態(tài)下的血小板聚集，縮短高血壓狀態(tài)下活化部分凝血酶原時間。龍血竭降壓作用可能通過作用于AVPR1A、GATM、F7 等靶點，調(diào)控鈣信號通路及神經(jīng)活性配體?受體相互作用等通路或途徑有關(guān)。龍血竭的藥理作用體現(xiàn)了CDB 治療EH 的“多成分?多靶點?多通路”的作用特點，從理論層面整體解釋了龍血竭影響血壓的機理，但其有效成份、作用靶點和通路仍需進一步驗證。