基于高內(nèi)涵細(xì)胞影像分析系統(tǒng)的多種中藥成分肝毒性篩選與評(píng)價(jià)

余 璇馬 喆王 萌

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津301617）

肝臟是人體藥物代謝的重要器官，也是藥源性損傷的主要靶器官之一［1］。中藥在發(fā)揮藥效的同時(shí)，一些有效成分或配伍中的其他成分會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生一定的損害甚至造成藥源性肝損傷——指藥物及其活性代謝物通過脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞因子平衡失調(diào)而導(dǎo)致線粒體功能障礙，膜通透性改變，對(duì)細(xì)胞凋亡或壞死進(jìn)行觸發(fā)，從而引起肝細(xì)胞損傷［2?3］。

中藥因其自身成分、作用機(jī)制復(fù)雜等因素，其藥源性肝損傷評(píng)價(jià)成本較高、試驗(yàn)周期較長(zhǎng)且結(jié)果爭(zhēng)議較大［4?5］。近年來，應(yīng)用于肝毒性研究評(píng)價(jià)的新方法和新技術(shù)不斷發(fā)展，如肝細(xì)胞和亞細(xì)胞模型體外實(shí)驗(yàn)法，精密肝切片法，斑馬魚模型，以及基于基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，但部分方法因儀器價(jià)格昂貴、技術(shù)要求較高等原因難以大范圍的使用［6?7］。

高內(nèi)涵影像分析（HCA）是一種在細(xì)胞水平上的多系統(tǒng)、多途徑、多靶標(biāo)的動(dòng)態(tài)篩選技術(shù)，能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，利用不同的熒光染料同時(shí)檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)和細(xì)胞功能的影響，具有高通量、多指標(biāo)、自動(dòng)化、可定量等優(yōu)點(diǎn)［8?9］。目前，HCA技術(shù)已用于肝毒性［10?11］、腎毒性［12?13］、心臟毒性［14］和神經(jīng)毒性［15?16］的化合物篩選和研究。其中用于肝毒性檢測(cè)的報(bào)道較多，常見的篩選細(xì)胞株主要有HepG2，HepaRG，人原代肝細(xì)胞等［10?11］。其中HepG2 易于培養(yǎng)，分化程度較高，所含的生物轉(zhuǎn)化酶與人正常肝細(xì)胞具有同源性，是最為常用的藥物評(píng)價(jià)篩選工具細(xì)胞［17］。課題組前期建立了HepG2 的HCA 肝毒性評(píng)價(jià)方法，測(cè)定丹紅注射液、復(fù)方苦參注射液等四種臨床常用中藥注射液的肝毒性，并通過動(dòng)物毒性試驗(yàn)對(duì)HCA 結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得出該測(cè)定方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確［18］。另外，正常人肝細(xì)胞L02 具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，更適用于谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）滲漏率等多種肝損傷相關(guān)酶類的檢測(cè)［19］。近年來，利用該細(xì)胞對(duì)中藥成分進(jìn)行HCA肝毒性篩選評(píng)價(jià)也可見報(bào)道［20］。有研究表明，同一成分在HepG2 和L02 上的敏感性不一致，如紫莖澤蘭對(duì)L02 的肝毒性作用大于HepG2［21］，而藤黃酸對(duì)HepG2 的毒性則大于L02［22］。另外，其抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制也有一定區(qū)別。如補(bǔ)骨脂素對(duì)HepG2 和L02 均具有肝毒性但作用機(jī)制不一致，在L02 細(xì)胞上通過將細(xì)胞阻滯于S 期以抑制增殖，降低生存率，而在HepG2 上并無周期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［23］。

本實(shí)驗(yàn)在之前工作的基礎(chǔ)上，利用三種熒光探針建立并優(yōu)化了基于L02 細(xì)胞的HCA 肝毒性評(píng)價(jià)方法。此外，選取2015 版《中國(guó)藥典》 中記載有大毒的藥物13 種，有毒的藥物50 種，有小毒的藥物35 種（表1），對(duì)除動(dòng)物藥材（蜈蚣、蘄蛇）和礦物藥材（膽礬、紅粉、砒石、雄黃、鉛丹、密陀僧、朱砂）外的89 種植物藥進(jìn)行文獻(xiàn)分析，根據(jù)報(bào)道確定了其中56 種可能具有潛在毒性的活性成分（表2）。通過建立的HCA 肝毒性檢測(cè)方法分別在人源性肝癌細(xì)胞HepG2 和人正常肝細(xì)胞L02 上進(jìn)行肝毒性快速評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，使用Hoechst 33342 熒光分子探針對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，利用HCA 技術(shù)同時(shí)考察藥物對(duì)細(xì)胞生存率和細(xì)胞核面積的影響，并將兩種細(xì)胞株上的結(jié)果對(duì)比分析，以期對(duì)具有潛在肝毒性的藥物進(jìn)行更準(zhǔn)確的早期篩選。

表1 《中國(guó)藥典》 記錄的肝毒性藥物

表2 潛在肝毒性中藥成分

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞HepG2、人正常肝細(xì)胞L02，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑 DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)1996842）、胰酶（批號(hào)1676922）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清（批號(hào)1658396）購(gòu)自以色列Biological Industry 公司；青鏈霉素（批號(hào)1697550）購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司；Hoechst 33342（批號(hào)1801208）、Mito Tracker Deep Red FM（批 號(hào)1941460）、Rhodamine123（批號(hào)R?22420）熒光分子探針購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMSO 購(gòu)自美國(guó)Sigma?Aldrich 公司。

1.3 儀器 IL?161HI CO2恒溫培養(yǎng)箱（施都凱儀器設(shè)備有限公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer 公司）。

1.4 藥物 陽性藥碳酰氰?4?三氟甲氧基苯腙（FCCP）（批 號(hào)024M4003V）、對(duì)乙酰 氨基酚（APAP）（批 號(hào)061M0042V）購(gòu)自美國(guó)Sigma?Aldrich 公司。56 種藥品及其代碼見表2，三七皂苷R1 購(gòu)自天津一方科技有限公司，異常山堿、青藤堿、野百合堿購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，其余藥品均購(gòu)自天津中新藥業(yè)股份有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2 和人正常肝細(xì)胞L02均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 藥物配制 FCCP 用DMEM 完全培養(yǎng)基分別稀釋至0.032、0.16、0.8、4、20、100 μmol／L，APAP 分別稀釋至0.032、0.16、0.8、4、20、100 mmol／L。各中藥活性成分經(jīng)DMSO 溶解后，分別用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋至濃度1.0×10－6mol／L。

2.3 L02 細(xì)胞HCA 多指標(biāo)肝毒性篩選方法的建立 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，L02 調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105／mL，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)基，加入以DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋的各濃度陽性藥（100 μL／孔），每組3 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h。之后向每孔加入分別含Hoechst 33342 1 μg／mL、Mito Tracker Deep Red FM 0.25 μg／mL、Rhodamine123 1 μg／mL的DMED 完全培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5% CO2下避光培養(yǎng)30 min，用DMEM 漂洗2 次。采用HCA，選擇Hoechst 33342、Mito Tracker Deep Red FM、Rhodamine123 三個(gè)通道對(duì)細(xì)胞進(jìn)行影像學(xué)分析，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核面積、線粒體質(zhì)量和線粒體膜電位4 項(xiàng)指標(biāo)，考察陽性藥對(duì)細(xì)胞核數(shù)量、形態(tài)以及線粒體功能的影響。

2.4 多種中藥活性成分對(duì)HepG2 細(xì)胞和L02 細(xì)胞的肝毒性 在已建立的HCA 肝毒性檢測(cè)方法上進(jìn)行簡(jiǎn)化。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，HepG2 和L02 的細(xì)胞培養(yǎng)方式同“2.3”項(xiàng)下。1×10－6mol／L 是在藥物篩選中較常用的起效濃度［24?25］，而阿霉素，順鉑等陽性藥在該濃度下也已表現(xiàn)出較明顯的毒性作用［12，26］，故各中藥活性成分以該濃度加入至各孔中，培養(yǎng)24 h，以Hoechst 33342 熒光探針進(jìn)行染色，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行影像學(xué)分析，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞核面積，考察各中藥成分對(duì)細(xì)胞核數(shù)量和形態(tài)的影響。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Harmony 3.0、Columbus 軟件（美國(guó)Perkin Elmer公司）對(duì)HCA 圖像進(jìn)行分析。通過GraphPad Prism 8.0、SPSS 21.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基于L02 細(xì)胞的HCA 肝毒性檢測(cè)方法 基于L02 細(xì)胞的HCA 肝毒性檢測(cè)結(jié)果見圖1～2。FCCP 對(duì)細(xì)胞生存率的半數(shù)抑制劑量（IC50）為3.560 μmol／L。在0.032～100 μmol／L濃度范圍內(nèi)，可見細(xì)胞核面積隨濃度升高有明顯皺縮，線粒體質(zhì)量明顯升高，線粒體膜電位發(fā)生改變，這與FCCP 能夠抑制線粒體呼吸鏈有關(guān)［27］。APAP 的IC50為5.389 mmol／L，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［28?30］。L02 細(xì)胞線粒體質(zhì)量和線粒體膜電位均有顯著下降。且細(xì)胞核面積在0.032～4 mmol／L 濃度范圍內(nèi)有腫大趨勢(shì)，這是APAP 誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和繼發(fā)性壞死而引起細(xì)胞器腫脹的形態(tài)學(xué)特征［31］。FCCP 與APAP 在L02 細(xì)胞上的多種指標(biāo)表明，該方法準(zhǔn)確可靠，可以用于潛在肝毒性藥物的快速篩選。

圖1 陽性藥對(duì)L02 細(xì)胞形態(tài)影響的HCA 代表圖像

圖2 FCCP 和APAP 對(duì)L02 細(xì)胞數(shù)目、線粒體質(zhì)量、線粒體膜電位和細(xì)胞核面積的量效關(guān)系圖（n＝3）

3.2 中藥成分肝細(xì)胞毒性快速篩選研究 本實(shí)驗(yàn)分別利用HepG2 和L02 的HCA 肝毒性檢測(cè)方法，以最直觀的細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞核面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析56 種成分對(duì)兩種細(xì)胞的生存率和細(xì)胞核面積的影響，HCA 形態(tài)學(xué)代表圖見圖3，采用origin 2019b 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制熱圖，見圖4。在HepG2細(xì)胞上，各中藥活性成分濃度1 μmol／L 時(shí)，A3、B3、A4、C3、D7、E4、E5、E6、E7、F1、F5、F6、G5、G6、H6 等15 種成分能夠引起細(xì)胞數(shù)目的下降，與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01），表明它們對(duì)HepG2 有一定的增殖抑制作用；A3、A4、C3、E4、G5 等5 個(gè)成分的細(xì)胞核面積與空白組相比均有不同程度的減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明它們能夠引起HepG2 細(xì)胞核的皺縮。

圖3 兩種中藥活性成分對(duì)HepG2 細(xì)胞形態(tài)影響的HCA 代表圖像

圖4 各中藥活性成分（1 μmol／L）對(duì)HepG2 細(xì)胞生存率（A）、L02 細(xì)胞生存率（B）、HepG2 細(xì)胞核面積（C）、L02 細(xì)胞核面積（D）的影響（n＝3）

在L02 細(xì)胞上，A3、B3、C3、E7、E6、F1、F6、G5、G6、G7、H3、H6 等12 種成分會(huì)引起細(xì)胞數(shù)目的下降，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），表明它們對(duì)L02 細(xì)胞有一定的毒性作用。另外，A3、B3、C3、E4、E5、E6、E7、F5、F6、G5、G6、G7、H6、H7 等14種成分能夠引起L02 細(xì)胞核不同程度的皺縮。

綜合分析各中藥活性成分在HepG2 和L02 上的HCA 肝毒性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 μmol／L 濃度下能導(dǎo)致兩細(xì)胞株的細(xì)胞生存率均降低的藥物有雷公藤紅素（A3）、雷公藤甲素（B3）、雷公藤內(nèi)酯酮（C3）、地高辛（E6）、杠柳次苷（E7）、鬼臼毒素（F1）、洋地黃毒苷（F6）、藤黃酸（G5）、西地蘭（G6）和去乙酰毛花苷（H6）。在對(duì)細(xì)胞生存率分析的基礎(chǔ)上，觀察各成分細(xì)胞核形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)L02 的細(xì)胞核經(jīng)Hoechst 染色后核面積明顯減小，皺縮程度劇烈，且均顯著高于HepG2，表明在同一藥物的影響下，L02 細(xì)胞可以更明顯的體現(xiàn)出細(xì)胞核形態(tài)的變化，對(duì)肝毒性評(píng)價(jià)的結(jié)果具有更清晰的指示性。

此外，補(bǔ)骨脂素（G7）可同時(shí)導(dǎo)致L02 細(xì)胞生存率的降低和細(xì)胞核面積減小，吳茱萸堿（H3）和補(bǔ)骨脂酚（H7）則分別對(duì)L02 的細(xì)胞生存率和細(xì)胞核形態(tài)產(chǎn)生明顯影響，且以上三種成分同一濃度下在HepG2 細(xì)胞上的生存率和細(xì)胞核形態(tài)均無顯著變化。而吳茱萸次堿（A4）和杠柳毒苷（D7）能夠?qū)е翲epG2 細(xì)胞生存率的降低。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)首先建立了HCA 肝毒性檢測(cè)方法，F(xiàn)CCP 是一種氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑，通過破壞膜電位，抑制ATP 的生成，影響線粒體功能引起細(xì)胞損傷，產(chǎn)生肝毒性［32］。APAP 是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，在代謝過程中，過量的高活性中間產(chǎn)物N?乙酰亞胺醌會(huì)與細(xì)胞蛋白尤其是線粒體蛋白中的巰基結(jié)合，引起氧化應(yīng)激功能障礙導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死［33］。實(shí)驗(yàn)分別選擇了這兩種不同肝毒性機(jī)理的藥物作為陽性藥，并通過HCA 分析其細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞核面積、線粒體質(zhì)量和線粒體膜電位4 項(xiàng)指標(biāo)的變化，表明兩種陽性藥對(duì)細(xì)胞核和線粒體功能均產(chǎn)生了一定的影響，與已報(bào)道的文獻(xiàn)相符，檢測(cè)方法快速可行。

利用已建立的HCA 肝毒性檢測(cè)方法，對(duì)56 種中藥活性成分進(jìn)行肝毒性檢測(cè)，有報(bào)道［25］表示細(xì)胞數(shù)目是藥物肝毒性檢測(cè)中最敏感的指標(biāo)，在細(xì)胞凋亡早期即可檢測(cè)到，適合作為藥物毒性的篩選指標(biāo)，而細(xì)胞核面積的變化是直觀反應(yīng)細(xì)胞調(diào)亡和壞死的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞核面積，對(duì)具有潛在肝毒性的中藥成分進(jìn)行初步快速篩選。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，對(duì)HepG2 和L02 細(xì)胞均有明顯毒性的成分主要有雷公藤中所含的雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯酮，強(qiáng)心苷類成分洋地黃毒苷、西地蘭、地高辛、去乙酰毛花苷和杠柳次苷，以及藤黃酸、鬼臼毒素等。有關(guān)雷公藤毒副作用的報(bào)道較為常見，主要有藥物性肝炎、肝功能異常、腎衰竭等，其中肝毒性的發(fā)生率最高，雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷公藤內(nèi)酯均是已被明確報(bào)道的主要毒性成分［34］。藤黃酸具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，有研究表明藤黃酸對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2（IC50為5.29 μmol／L）的毒性較大，而對(duì)人正常肝細(xì)胞株L02 作用相對(duì)較弱（IC50為27.96 μmol／L）［22，35］，與本文的研究結(jié)果一致。另外，強(qiáng)心苷類的治療窗窄、毒性作用強(qiáng)［36］，鬼臼毒素類［37］、吳茱萸堿［38］、吳茱萸次堿［39］、補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚［40］等成分具有細(xì)胞毒性或抗腫瘤作用也均有報(bào)道。由于本實(shí)驗(yàn)使用了HepG2 和L02 兩種肝細(xì)胞株且藥物作用濃度較低（1×10－6mol／L），故馬錢子堿、士的寧等有嚴(yán)重神經(jīng)毒性的藥物［41］以及中烏頭堿、次烏頭堿等對(duì)心肌細(xì)胞更為敏感［42?43］的有毒藥物并未被篩選出來，也說明該方法具有一定的準(zhǔn)確度和靈敏性。雖然HCA 檢測(cè)方法能夠從細(xì)胞水平上對(duì)藥物進(jìn)行篩選，并多層次、多靶點(diǎn)的深入探討中藥的作用機(jī)制，但其是否能夠代表藥物在體內(nèi)的代謝過程以及其毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)毒性相關(guān)性的綜合分析仍有待探討。

本實(shí)驗(yàn)篩選出的十種能同時(shí)導(dǎo)致HepG2 和L02 細(xì)胞生存率明顯降低的藥物中，其L02 上細(xì)胞核皺縮的程度均明顯高于HepG2，說明L02 可以更明顯的體現(xiàn)出細(xì)胞核形態(tài)的變化，對(duì)肝毒性評(píng)價(jià)的結(jié)果具有更清晰的指示性。因此，我們認(rèn)為兩種細(xì)胞株在肝毒性藥物的篩選上有一定差異，其綜合分析結(jié)果更具有代表性。本實(shí)驗(yàn)成功建立了HCA 肝毒性檢測(cè)方法，并對(duì)56 種中藥活性成分的肝毒性進(jìn)行快速評(píng)價(jià)，初步構(gòu)建了中藥潛在肝毒性組分庫。該方法操作簡(jiǎn)單，快速，穩(wěn)定，特別適用于中藥復(fù)雜化學(xué)體系的初步毒性篩選評(píng)價(jià)。