太空養(yǎng)心丸對(duì)模擬失重大鼠心血管功能的影響

尤金枝范雪梅王義明*梁瓊麟羅國安李勇枝

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006； 2.清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084； 3.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京100094）

隨著現(xiàn)代航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，伴隨而來的是對(duì)宇航員健康的維護(hù)問題。已有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)中醫(yī)理論指導(dǎo)組方而成的太空養(yǎng)心丸能夠有效緩解“太空病”，且已被運(yùn)用于航天過程。但是現(xiàn)有太空養(yǎng)心丸的藥理藥效研究中，研究者采用后肢去負(fù)荷法、頭低位法等建立動(dòng)物模型模擬失重效應(yīng)。后肢去負(fù)荷法能夠模擬航天員在太空時(shí)機(jī)體發(fā)生的改變，比如對(duì)心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肌肉骨骼等的影響［1］，且存在可實(shí)現(xiàn)以較小的代價(jià)及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)、可在實(shí)驗(yàn)過程中隨時(shí)麻醉取材等優(yōu)勢(shì)［2］，但單純的后肢去負(fù)荷法只模擬了失重狀態(tài)，卻忽略了空間環(huán)境的壓強(qiáng)、噪音、溫濕度等影響因素，從而導(dǎo)致了模型研究的限制性。針對(duì)此問題，本研究在地面模擬太空艙環(huán)境內(nèi)采用尾吊法建立大鼠模擬失重模型，即在傳統(tǒng)的單純模擬失重基礎(chǔ)上增加空間環(huán)境模擬，使模型更接近真實(shí)的航天環(huán)境。借助該模型研究太空養(yǎng)心丸對(duì)模型大鼠心血管系統(tǒng)功能的影響，可更真實(shí)、合理地評(píng)價(jià)該方藥效。

1 材料

1.1 動(dòng)物 60 只健康雄性成年SD 大鼠，8～10 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，SPF 級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)11400700313178。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國航天員中心倫理委員會(huì)審定（倫理號(hào)ACC?IACUC?2018?005）。

1.2 藥物 太空養(yǎng)心丸由中國航天員科研訓(xùn)練中心研制，由北京勃然制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)170603，規(guī)格6 g／袋。

1.3 試劑 羧甲基纖維素鈉（CMC?Na，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)521K022）；生理鹽水（0.9% NaCl，石家莊四藥有限公司，批號(hào)1805101907）；大鼠心鈉肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）ELISA 試劑盒（批號(hào)20180620）、大鼠腦鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）ELISA 試劑盒（批號(hào)20180620）、大鼠內(nèi)皮素?1（Endothelin?1，ET?1）ELISA 試劑盒（批號(hào)20180620）、大鼠去甲腎上腺素（Nor?epinephrine，NE）ELISA 試劑盒（批號(hào)20180620）、大鼠超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)20180612）、大鼠總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T?AOC）試劑盒（批號(hào)20180612）均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器 模擬太空艙（中國航天員科研訓(xùn)練中心提供并維護(hù)運(yùn)行）；大鼠吊尾飼養(yǎng)籠（中國航天員科研訓(xùn)練中心提供）；MIKRO 22R 高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich 公司）；arium? pro 超純水系統(tǒng)（德國賽多利斯公司）；2 000 g／0.01 g 電子天平（杭州萬特衡器公司）；LC?MSH?Pro 磁力攪拌器（上海力辰科技公司）；XP205 十萬分之一分析天平（瑞士Mettler?Toledo 公司）；ELx800 吸收光酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；IX71 倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Vero? 2100 小動(dòng)物超聲成像平臺(tái)（中國維勝有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立、分組及給藥 大鼠適應(yīng)性培養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為艙外對(duì)照組（艙外正常飼養(yǎng)）、艙內(nèi)對(duì)照組（艙內(nèi)正常飼養(yǎng)）、模型組（艙內(nèi)飼養(yǎng)＋失重模型）、低劑量給藥組（艙內(nèi)飼養(yǎng)＋失重模型＋太空養(yǎng)心丸低劑量給藥）、高劑量給藥組（艙內(nèi)飼養(yǎng)＋失重模型＋太空養(yǎng)心丸高劑量給藥），每組12 只，造模的同時(shí)給予太空養(yǎng)心丸給藥28 d。模型組與給藥組的模擬失重大鼠模型采用尾吊法建立［3］，將大鼠尾部吊到橫梁上（用膠布纏繞尾部并固定于吊環(huán)上，調(diào)節(jié)高度使大鼠身體傾斜30°左右），后肢不可著地，前肢可360°范圍自由活動(dòng)。太空養(yǎng)心丸研磨成粉，用0.5% CMC?Na 溶液混懸，每日灌胃給藥1 次，低劑量（1.5 g／kg）給藥量相當(dāng)于人臨床用量，高劑量（3.0 g／kg）給藥量相當(dāng)于2 倍人臨床用量；模型組和對(duì)照組每天按體質(zhì)量灌胃給等體積的0.5% CMC?Na 溶液。

2.2 一般狀態(tài)觀察 每周觀察大鼠的一般狀態(tài)、自主活動(dòng)，測定體質(zhì)量、飲食量變化。

2.3 血清樣本收集及指標(biāo)檢測 給藥28 d 后收集大鼠血清，測定指標(biāo)。生化指標(biāo)委托清華大學(xué)校醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測，其中包括反應(yīng)腎功能的重要指標(biāo)：尿素（UREA）、肌酐（CREA）；急性肝細(xì)胞損傷的敏感標(biāo)志：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Ala?nine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate amin?otransferase，AST）；心肌疾病相關(guān)指標(biāo)：乳酸脫氫酶（Lac?tate dehydrogenase，LDH）、肌酸激 酶（Creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzymes，CK?MB）和C?反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）。心血管系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)ANP、BNP、ET?1 和NE 使用酶聯(lián)免疫法按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測；SOD 使用羥胺法按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測；T?AOC 使用ABTS 法按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.4 心臟超聲檢測 給藥28 d 后對(duì)大鼠（每組各6 只）進(jìn)行心臟超聲檢測，根據(jù)LVM 型圖像依此測量：左心室舒張末期內(nèi)徑（Left ventricular end?diastolic dimension，LVEDD）、左心室舒張末期后壁厚度（Left ventricular end?diastolic posterior wall thickness，LVEDPWT）、左心室收縮末期內(nèi)徑（Left ventricular end?systolic dimension，LVESD）、左心室收縮末期后壁厚度（Left ventricular end?systolic posterior wall thickness，LVESPWT）、左心室舒張末期前壁厚度（Left ventricular end?diastolic anterior wall thickness，LVEDAWT）、左心室收縮末期前壁厚度（Left ventricular end?systolic anterior wall thickness，LVESAWT）。所有測量數(shù)值均為連續(xù)3 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。由Visual Sonics 系統(tǒng)計(jì)算以下指標(biāo)：左心室舒張末期容積（Left ventricular end?diastolic vol?ume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（Left ventricular end?systolic volume，LVESV）、左心室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室 短軸縮短率（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。由Aortic Valve 模式依次測量每搏輸出量（Stroke volume，SV）、心輸出量（Cardiac output，CO）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 21 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Dunntt’s T3，方差齊時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)觀察結(jié)果

3.1.1 大鼠前自主活動(dòng)與精神狀態(tài) 艙內(nèi)、艙外對(duì)照組大鼠狀態(tài)基本一致，飲食、排泄正常，體質(zhì)量增長較快，情緒穩(wěn)定，毛發(fā)有光澤；模型組大鼠尾部充血腫脹，少部分存在腐爛情況，消瘦，毛色泛黃且掉毛，情緒焦躁；低劑量給藥組大鼠尾部充血腫脹，消瘦，情緒溫和，活動(dòng)力強(qiáng)；高劑量給藥組大鼠尾部充血腫脹，消瘦，精神較萎靡。由此可見，模擬太空艙環(huán)境對(duì)大鼠表觀狀態(tài)并無顯著影響，而尾吊模型則對(duì)大鼠狀態(tài)影響較大，除了尾吊時(shí)間過長導(dǎo)致的尾部充血、潰爛現(xiàn)象［2］，還會(huì)由于造模后的去負(fù)荷狀態(tài)導(dǎo)致其產(chǎn)生情緒焦躁、毛發(fā)光澤度降低且掉毛、消瘦等明顯變化。太空養(yǎng)心丸低劑量給藥后能夠有效增強(qiáng)大鼠活動(dòng)力，緩解其情緒，但繼續(xù)增高給藥劑量并沒有明顯的改善。

3.1.2 飲食量及體質(zhì)量變化 每周測得的各組大鼠飲食量、體質(zhì)量增長值變化無組內(nèi)差異，因此計(jì)算4 次所測各組數(shù)據(jù)的平均值，見表1。相較于艙外對(duì)照組，艙內(nèi)對(duì)照組大鼠平均飲食量雖然增加（P＜0.05），但其體質(zhì)量變化并不明顯（P＞0.05）；模型組大鼠飲食量減少，體質(zhì)量增加速度減緩（P＜0.01）；給藥組大鼠飲食量進(jìn)一步減少（P＜0.05），體質(zhì)量增加更為緩慢（P＜0.01），其中高劑量給藥組大鼠飲食量（P＜0.05）、體質(zhì)量增長值（P＜0.01）較之低劑量組更小。結(jié)果顯示，模擬太空艙內(nèi)微重力環(huán)境可能增加大鼠能量消耗，致其飲食量增加；失重模型下的大鼠由于體位的變化，在一定程度上阻礙了進(jìn)食；在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行太空養(yǎng)心丸給藥，尤其是高劑量給藥組，藥液的濃度與口感等都會(huì)影響大鼠的食欲，進(jìn)而抑制體質(zhì)量增長，致其消瘦。

表1 各組大鼠平均飲食量及體質(zhì)量增長值（， n＝12）

表1 各組大鼠平均飲食量及體質(zhì)量增長值（， n＝12）

注：與艙外對(duì)照組比較，＃P ＜0.05；與艙內(nèi)對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

3.2 大鼠血清指標(biāo)測定結(jié)果

3.2.1 生化指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)28 d 后，大鼠生化指標(biāo)如圖1 所示。模擬太空艙內(nèi)大鼠的ALT、LDH 這2 個(gè)指標(biāo)的水平上調(diào)（P＜0.05），即模擬太空艙環(huán)境對(duì)大鼠的肝功能、心臟功能存在一定影響；模型組UREA、LDH 水平上調(diào)（P＜0.05），提示尾吊模型對(duì)大鼠腎功能、心臟功能有明顯的損傷；太空養(yǎng)心丸給藥后下調(diào)了UREA、CREA、CK、CK?MB 這4 個(gè)指標(biāo)的水平（P＜0.05），其中CK、CK?MB 的顯著變化已被證明是心肌缺血的敏感標(biāo)志，對(duì)急性心肌梗死有診斷價(jià)值，說明太空養(yǎng)心丸給藥可改善模型大鼠對(duì)心臟功能的影響，同時(shí)還可改善腎功能。

圖1 各組大鼠生化指標(biāo)測定結(jié)果（n＝6）

3.2.2 心血管系統(tǒng)指標(biāo)的變化情況 如圖2 所示，模擬太空艙環(huán)境中正常大鼠心血管系統(tǒng)指標(biāo)ANP、NE 的水平雖有一定上調(diào)，但變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠SOD 水平上調(diào)（P＜0.01），BNP 水平下調(diào)（P＜0.05）；太空養(yǎng)心丸給藥后下調(diào)了SOD、T?AOC 水平（P＜0.01），上調(diào)了BNP 水平（P＜0.01），同時(shí)調(diào)節(jié)ANP 等指標(biāo)的水平至正常狀態(tài)。結(jié)果顯示，太空養(yǎng)心丸給藥能夠有效改善模擬失重大鼠心血管功能異常，并緩解模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

圖2 各組大鼠心血管系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果（n＝12）

3.3 太空養(yǎng)心丸對(duì)模擬失重大鼠心臟功能的調(diào)節(jié)作用LVEDV 水平反應(yīng)心臟前負(fù)荷，在一定范圍內(nèi)前負(fù)荷增加則代表心肌收縮力加強(qiáng)；LVEF 表示左心室收縮時(shí)的射血功能，是SV 與LVEDV 的百分比，心臟在正常工作范圍內(nèi)活動(dòng)時(shí)，SV 始終與LVEDV 相適應(yīng)；LVFS 表示心肌的收縮功能，在無其余病理現(xiàn)象存在的前提下，其指標(biāo)變化基本與LVEF 一致；CO、SV 是衡量心臟射血功能的強(qiáng)弱與是否正常的指標(biāo)。從圖3 來看，模擬太空艙內(nèi)的環(huán)境并不會(huì)抑制大鼠心肌收縮力、心臟射血功能；尾吊模型下大鼠的心肌收縮力與心臟射血功能則受到了抑制（P＜0.05，P＜0.01），同時(shí)LVEF、LVFS 數(shù)值出現(xiàn)應(yīng)激性上調(diào)，顯示微重力對(duì)心臟功能的影響更為直觀，是危害健康的重要因素之一。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行太空養(yǎng)心丸給藥，低劑量組對(duì)模型組大鼠心臟功能有明顯的改善作用，尤其是LVEDV 和LVESV 水平在低劑量給藥組與對(duì)照組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠心功能超聲結(jié)果（n＝6）

4 討論

心血管系統(tǒng)作為失重效應(yīng)下重要的靶器官之一，其功能紊亂對(duì)航天工作中的宇航員影響極大［4?5］。為了有效緩解微重力導(dǎo)致的心血管功能紊亂，除了必要的體育鍛煉措施［6］、物理防護(hù)外［7］，藥物干預(yù)也必不可少［8?9］。

中藥復(fù)方太空養(yǎng)心丸是一種專門針對(duì)宇航員的中藥復(fù)方，在益氣養(yǎng)心、補(bǔ)腎活血的基礎(chǔ)上進(jìn)行組方遣藥，主要成分包括人參、陳皮、山楂、五加皮以及動(dòng)物的骨頭粉等。在以往研究中研究者已分別借助大鼠尾吊模型、人體頭低位模型驗(yàn)證了該方對(duì)失重模型心血管系統(tǒng)及心肺功能的調(diào)節(jié)、改善作用［3，10］，但是皆未考慮到太空環(huán)境存在的特殊影響。

本次研究結(jié)合模擬太空艙與尾吊模型對(duì)太空微重力環(huán)境進(jìn)行模擬，在模擬太空艙環(huán)境內(nèi)建立了大鼠失重模型，更真實(shí)地模擬航天工作環(huán)境，考察此環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠心血管系統(tǒng)的異常變化，并借此評(píng)價(jià)太空養(yǎng)心丸藥效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模擬太空艙環(huán)境內(nèi)對(duì)照組大鼠飲食量顯著增加，而分別作為急性肝細(xì)胞損傷、心梗敏感標(biāo)志物的ALT、LDH 水平上調(diào)，說明在模擬太空艙環(huán)境下大鼠體能可能消耗較大，且肝臟、心臟功能會(huì)受到較明顯的影響。模型組大鼠飲食量、體質(zhì)量增長率下調(diào)，UREA、LDH 水平上調(diào)，同時(shí)超聲指標(biāo)LVEDV、LVESV、SV、CO 的水平下調(diào)，提示造模可能會(huì)對(duì)心臟收縮、供血等功能產(chǎn)生較嚴(yán)重的損傷。以上結(jié)果與已有研究結(jié)果一致，比如目前航天過程中氧化應(yīng)激水平的紊亂現(xiàn)象較為普遍，研究發(fā)現(xiàn)這可能與腎功能減弱存在一定聯(lián)系［11］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測到尾吊模型大鼠血清LDH 水平升高，證實(shí)模擬微重力會(huì)增加心肌對(duì)缺血?再灌注損傷的易感性［12］；更有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)失重后心臟超聲各指標(biāo)出現(xiàn)明顯變化，即模擬失重會(huì)在一定程度上引起大鼠心功能下降［3，13］。但是本次研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠BNP 水平下調(diào)，這與此前同樣以尾吊模型評(píng)價(jià)所得結(jié)果存在差異［14］；同時(shí)模型組大鼠的SOD 水平卻有上調(diào)，而在普遍的研究中，心臟受損時(shí)通常伴隨著氧自由基大量產(chǎn)生，SOD 活性下降［15］，據(jù)此提示太空艙環(huán)境、失重時(shí)間等因素的疊加可能對(duì)此二指標(biāo)有特殊影響，具體情況還有待結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)進(jìn)一步研究。對(duì)模擬失重大鼠進(jìn)行太空養(yǎng)心丸給藥，下調(diào)了UREA、CREA、CK、CK?MB、SOD、T?AOC 的水平，提示在一定程度上給藥可以緩解大鼠的應(yīng)激狀態(tài)，改善心血管系統(tǒng)功能紊亂狀態(tài)，同時(shí)增強(qiáng)心臟功能。同時(shí)，相較高劑量而言，低劑量給藥對(duì)各指標(biāo)的調(diào)節(jié)更接近正常水平，再結(jié)合大鼠精神狀態(tài)、自主活動(dòng)等，可證實(shí)低劑量（即臨床劑量）給藥更為合理，為臨床劑量有效性提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，本研究通過觀察各組大鼠自主活動(dòng)與精神狀態(tài)、檢測血清指標(biāo)、心臟超聲的方法對(duì)太空養(yǎng)心丸藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，初步探索了太空養(yǎng)心丸給藥對(duì)模擬失重大鼠心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。后期可進(jìn)一步從基因、蛋白質(zhì)、代謝物水平探索太空艙內(nèi)模擬失重模型對(duì)大鼠心血管系統(tǒng)的影響及太空養(yǎng)心丸給藥的具體作用機(jī)制。