火絨草對(duì)系膜增生性腎小球腎炎炎癥反應(yīng)的影響

趙 玥王光函張 穎姜 鴻齊 越

（遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽110034）

火絨草Leontopodium leontopodioides（Willd.）Beauv.為菊科火絨草屬植物火絨草，具有清熱涼血、益腎利水的功效［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，火絨草具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性［2?3］，民間主要用于治療流行性感冒、急（慢）性腎炎、蛋白尿血尿等疾?。?］。系膜增生性腎小球腎炎（Mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）為慢性腎小球腎炎，以蛋白尿、血尿、水腫等為主要臨床表現(xiàn)［5］。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等多種因素相互作用都可影響MsPGN 疾病的發(fā)生和發(fā)展［6］。曾有報(bào)道研究火絨草對(duì)系膜增生性腎小球腎炎的治療作用［7］，但基礎(chǔ)研究較少，相關(guān)的作用機(jī)制及調(diào)控的靶點(diǎn)也未明確，因此考察火絨草治療腎炎的作用機(jī)制具有重要意義。根據(jù)中藥多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，本研究通過對(duì)MsPGN 大鼠模型血清炎癥因子的測(cè)定以及腎臟組織中蛋白表達(dá)的檢測(cè)，探索火絨草對(duì)MsPGN 疾病的治療作用及調(diào)控機(jī)制，為火絨草的臨床應(yīng)用及抗炎制劑的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康SD 雄性大鼠75 只，體質(zhì)量180～220 g（遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2015?0001。

1.2 試劑 牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（德國Sigma 公司，批號(hào)WX?BC7359V、SLBV6895、SLBT5128）；白介素6（interleukin 6，IL?6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF?α）大鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)m1064292、m1002859）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺上樣緩沖液（SDS?PAGE loading Buffer）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)01411／40342）；二喹啉甲酸（bicin?choninic acid，BCA）；蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0012）；核因子?κB p65（nuclear factor kappa?B p65，NF?κB）、磷酸化蛋白激酶B（p?protein kinase B，P?AKT）（美國Cell Signaling Technology 公司，批號(hào)82427T、4060T）；蛋白激酶B 1／2／3（protein kinase B 1／2／3，AKT1／2／3）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）（英國Abcam 公司，批號(hào)GR242901?30、GR3245955?1），上述抗體稀釋1 000 倍使用；磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p?phosphatidylinositol 3 kinase，P?PI3K）、肌動(dòng)蛋白（β?Actin）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AH08106421、AH01032107），稀釋400 倍使用。

1.3 藥物 火絨草藥材（野生，采于遼寧沈陽祝家鎮(zhèn)，160601，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為正品）。雷公藤多苷片（上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)171201）；鹽酸貝那普利片（北京諾華制藥有限公司，批號(hào)X2657）。

1.4 儀器 恒溫培養(yǎng)箱（廈門醫(yī)療電子儀器廠）；離心機(jī)（美國Thmorgan 公司）；組織研磨機(jī)（CK1000D，上海力申科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（Neofuge 13R，美國伯騰儀器公司）；Elx800 酸度計(jì)（PHS?25C，上?？祪x儀器有限公司）；垂直電泳槽濕轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio?Rad 公司）。

2 方法

2.1 火絨草提取物的制備 取火絨草藥材150 g，加入10倍量水，回流提取2 h，濾過，殘余藥渣加入8 倍量水，提取1 h，濾過，合并2 次濾液，備用。

2.2 MsPGN 模型的建立［7］所有SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機(jī)選取10 只作為空白組，其余65 只用于建立MsPGN 模型。取各組大鼠稱定質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔注射（300 mg／kg）麻醉，進(jìn)行左側(cè)腎臟切除手術(shù)。將麻醉后大鼠放置于無菌操作臺(tái)上，固定、備皮，手術(shù)部位涂抹碘伏、75%乙醇進(jìn)行消毒，沿左肋脊角入口剪開，暴露腎臟，用手術(shù)線快速結(jié)扎左側(cè)腎臟動(dòng)、靜脈和輸尿管，剪下左側(cè)腎臟，用青霉素鈉處理結(jié)扎處，縫合傷口并消毒，涂抹火棉膠。手術(shù)一周后，除空白組外，其余大鼠均皮下注射0.1 mL A 液（弗氏完全佐劑＋3.0 mg BSA），于第1 周末、第2 周末大鼠皮下注射0.1 mL B 液（弗氏不完全佐劑＋3.0 mg BSA）；于第3 周末，大鼠腹腔注射BSA，連續(xù)4 次，間隔1 h，劑量分別為每只0.5、1.0、1.5、3.0 mg。次日大鼠腹腔注射2.0 mg BSA。于第4 周起大鼠每日腹腔注射BSA，開始劑量為0.5 mg，每日增加0.5 mg，直至5.0 mg，繼續(xù)每周加量1 mg 至10 mg 為止。于第5 周末大鼠尾靜脈注射脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）100 μg?？瞻捉M大鼠麻醉后手術(shù)暴露左側(cè)腎臟，但不做切除，其余步驟同造模組，皮下、腹腔均注射生理鹽水，稱為假手術(shù)組。除麻醉意外死亡2 只，剩余大鼠造模結(jié)束后收集大鼠24 h 尿液做尿常規(guī)檢查，將尿蛋白檢測(cè)為陰性的3 只大鼠剔除，剩余大鼠分為模型組，中藥陽性藥組（雷公藤多苷片20 mg／kg），西藥陽性藥組（鹽酸貝那普利片40 mg／kg），火絨草高、中、低劑量組（2.70、1.35、0.68 g／kg），每組10 只。各組模型大鼠在次日開始連續(xù)灌胃給藥15 mL／kg，每日給藥1 次，給藥時(shí)間為5 周，假手術(shù)組與模型組均給相同容量的水。

2.3 血清肌酐、血清尿素氮生化指標(biāo)的測(cè)定 給藥結(jié)束后，所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg／kg）麻醉，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，3 000 r／min 離心10 min，取上清，－80 ℃凍存，按照試劑盒說明書進(jìn)行血清肌酐、血清尿素氮的測(cè)定。

2.4 炎癥指標(biāo)的測(cè)定 取大鼠血清，按照試劑盒說明書進(jìn)行IL?6、TNF?α 的測(cè)定。

2.5 腎臟組織病理學(xué)形態(tài)觀察 大鼠腹主動(dòng)脈取血后立刻解剖摘取右側(cè)腎組織，迅速沿冠狀面將腎臟切為大致相等的兩半，其中一半投入10%中性福爾馬林溶液中固定以備HE 染色觀察，另一半置于液氮瓶中保存。

2.6 相關(guān)蛋白的檢測(cè) 取液氮保存的腎臟組織，采用Western blot 法檢測(cè)腎臟組織中核因子?κB（NF?κB）、阻遏蛋白（IκB）、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）蛋白表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用（）表示。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊則采用最小顯著差法進(jìn)行兩兩比較，方差不齊則采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 火絨草提取物對(duì)血清肌酐及血清尿素氮的影響 由表1 可見，與假手術(shù)組相比，模型組中血清肌酐及血清尿素氮水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，火絨草提取物高劑量組可降低大鼠血清肌酐水平（P＜0.05），高、中、低劑量組可降低大鼠血清內(nèi)尿素氮水平（P＜0.05，P＜0.01）。雷公藤多苷組可降低血清肌酐及血清尿素氮水平（P＜0.05，P＜0.01），鹽酸貝那普利片組可降低血清尿素氮水平（P＜0.05）。見表1。

表1 火絨草提取物對(duì)血清中血清肌酐及血清尿素氮水平的影響（）

表1 火絨草提取物對(duì)血清中血清肌酐及血清尿素氮水平的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 火絨草提取物對(duì)TNF?α、IL?6 的影響 由表2 可見，與假手術(shù)組相比，模型組血清中TNF?α、IL?6 水平增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組相比，火絨草提取物高、中劑量組可降低血清中TNF?α 水平（P＜0.05，P＜0.01），火絨草提取物高劑量組可降低大鼠血清內(nèi)的IL?6 水平（P＜0.05）。雷公藤多苷組可降低TNF?α、IL?6 水平（P＜0.05）。見表2。

表2 火絨草提取物對(duì)血清中TNF?α、IL?6 水平的影響（）

表2 火絨草提取物對(duì)血清中TNF?α、IL?6 水平的影響（）

注：與假手術(shù)組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 火絨草對(duì)MsPGN 模型大鼠HE 染色形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 由圖1 可見，假手術(shù)組顯微鏡下可見該組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)無明顯變化，系膜細(xì)胞及胞外基質(zhì)無明顯增多，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見該組大鼠腎小球明顯肥大，腎小球偶見萎縮，系膜區(qū)細(xì)胞彌漫性增多、胞外基質(zhì)增生，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管壞死。火絨草提取物高劑量組可見該組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)輕度變化，系膜細(xì)胞、基質(zhì)輕度增生，系膜區(qū)無增寬，少有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。火絨草提取物中、低劑量組，可見該組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)改變，系膜細(xì)胞、基質(zhì)輕度增生，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。雷公藤多苷組可見該組大鼠腎小球肥大不明顯，系膜細(xì)胞、基質(zhì)輕度增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。鹽酸貝那普利片組可見該組大鼠腎小球及毛細(xì)血管壁無受損，系膜細(xì)胞輕度增生，胞外基質(zhì)基本正常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。見圖1。

圖1 腎臟組織HE 染色

3.4 火絨草提取物對(duì)腎臟組織中NF?κB、IκB、PI3K、AKT 蛋白表達(dá)的影響 由圖2～5 可見，與假手術(shù)組比較，模型組中NF?κB、p?PI3K、p?AKT 蛋白表 達(dá)升高（P＜0.05），IκB 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組比較，火絨草高、中劑量組中NF?κB、p?PI3K、p?AKT 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），高、中、低劑量組IκB 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

圖2 火絨草水提物對(duì)NF?κB 蛋白表達(dá)的影響（n＝5）

4 討論

腎臟疾病臨床檢測(cè)指標(biāo)主要為血清肌酐和尿素氮，此項(xiàng)指標(biāo)是了解腎功能的主要方法之一，血清肌酐和尿素氮升高意味著腎功能的損害。本實(shí)驗(yàn)中火絨草水提取物對(duì)大鼠MsPGN 模型中血清肌酐及尿素氮量的影響可初步評(píng)價(jià)火絨草對(duì)MsPGN 的治療作用。

圖3 火絨草水提物對(duì)IκB 蛋白表達(dá)的影響（n＝5）

系膜增生性腎小球腎炎發(fā)生時(shí)，沉積于腎小球系膜區(qū)的難溶性循環(huán)免疫復(fù)合物發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生TNF?α 和IL?6，它們與系膜細(xì)胞表面的受體結(jié)合，進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起腎小球損傷。因此抑制TNF?α 及IL?6 的釋放對(duì)系膜增生性腎小球腎炎疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要［8］。在本研究中，火絨草提取物可降低模型大鼠血清中TNF?α 和IL?6 水平，可推測(cè)火絨草通過抑制腎小球系膜區(qū)難溶性免疫復(fù)合物的沉積，減少了TNF?α 和IL?6 的釋放。

圖4 火絨草水提物對(duì)p?PI3K 蛋白表達(dá)的影響（n＝5）

圖5 火絨草水提物對(duì)p?Akt 蛋白表達(dá)的影響（n＝5）

NF?κB 可調(diào)控免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞的增殖和凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)，IL?6、TNF?a 等炎癥因子是NF?κB 的靶標(biāo)基因，因此活化的NF?κB 在炎癥反應(yīng)過程中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制系膜細(xì)胞內(nèi)的NF?κB 的活性，可改善MsPGN 中系膜細(xì)胞的功能異常［9］。PI3K 是信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑中重要的調(diào)控蛋白，AKT 是PI3K 下游的磷酸化激酶，在細(xì)胞的生存和凋亡機(jī)制中起到重要的作用［10］。PI3K／AKT 信號(hào)通路與NF?κB 信號(hào)通路相互作用，緊密相連?；罨蟮腁KT 可通過活化IκB 激酶（IKK）加速IκB 的降解及磷酸化p65 的Ser529 和Ser536 位點(diǎn)，增強(qiáng)已經(jīng)結(jié)合在核內(nèi)NF?κB 結(jié)合序列上的NF?κB 的轉(zhuǎn)錄活性，影響NF?κB 的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而影響系膜細(xì)胞的過度增殖。

本研究結(jié)果表明：模型組大鼠IκB 蛋白表達(dá)減少，NF?κB 的蛋白表達(dá)增加，PI3K／AKT 磷酸化水平增加，提示在MsPGN 模型大鼠腎臟中炎癥NF?κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K／AKT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。藥物干預(yù)5 周后，火絨草提取物可降低NF?κB 蛋白表達(dá)和PI3K／AKT 磷酸化表達(dá)，增加IκB 蛋白水平，提示火絨草提取物可能通過影響NF?κB 信號(hào)分子以及PI3K／AKT 信號(hào)分子的活化，進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放，從而緩解MsPGN 模型大鼠的腎臟病理損害，起到保護(hù)腎臟作用。