基于譜效相關(guān)法探究酒炙丹參增強(qiáng)抗凝血活性的物質(zhì)基礎(chǔ)

周 巧張智慧張學(xué)蘭王 悅甄 臻奚亞亞

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250355； 2.山東省高校中藥質(zhì)量控制與全產(chǎn)業(yè)鏈建設(shè)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南250355）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效［1］，是臨床上治療心腦血管疾病的大宗常用中藥。丹參中的有效成分主要包括水溶性和脂溶性兩大類，前者主要有丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原兒茶醛、丹參素等，具有抑制血管細(xì)胞動(dòng)脈硬化、促血管生成、抑制血小板聚集等作用；后者主要有丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮I 等，具有抗凝血、抗血栓、抗氧化等作用［2?4］。2020 年版《中國藥典》 收載丹參和酒丹參2 種飲片規(guī)格。據(jù)古籍記載，金、明代以來酒炙成為丹參主要的炮制方法之一，且《景岳全書》 中提出“酒洗去土，晾干，切，破血生新”；《本草辨義》 中“酒炒用，畏咸水忌醋。漬酒服，能療足痹”說明古人已認(rèn)識到酒丹參較強(qiáng)的活血化瘀、止痛作用，現(xiàn)代認(rèn)為酒炙丹參可緩和其寒涼之性，增強(qiáng)活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛之功［5］。

中藥指紋圖譜具有整體、宏觀和模糊的特點(diǎn)，能最大程度地反映中藥中所含成分的種類和含量，但無法確定這些成分是否為發(fā)揮臨床作用的藥效物質(zhì)，將化學(xué)指紋圖譜與生物活性評價(jià)相結(jié)合，構(gòu)建譜效關(guān)系，可初步探索中藥的藥效物質(zhì)［6］。PLS?DA 是一種融合了多因變量對多自變量的回歸建模以及主成分分析在內(nèi)的多元數(shù)據(jù)分析方法，尤其適用于自變量間存在多重相關(guān)性以及樣本數(shù)量少于自變量數(shù)量的數(shù)據(jù)分析［7］。

研究表明，丹參酒炙后酚酸類和丹參酮類成分發(fā)生明顯的質(zhì)變和量變［8?10］。丹參生品具有抑制血小板聚集、抗凝血作用，且酒炙后藥效增強(qiáng)［11］。目前，關(guān)于丹參的指紋圖譜已用于丹參及相關(guān)制劑的品質(zhì)評價(jià)［12］。然而，丹參酒炙增效的物質(zhì)基礎(chǔ)及炮制機(jī)理尚未闡明，缺乏具有個(gè)性特點(diǎn)的丹參與酒丹參飲片質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用HPLC 法建立丹參生品與酒炙品指紋圖譜，結(jié)合體外抗凝血藥效指標(biāo)數(shù)據(jù)，采用PLS?DA 法，將指紋圖譜所代表的化學(xué)信息與藥效數(shù)據(jù)所代表的生物效應(yīng)信息相關(guān)聯(lián)，探討丹參酒炙增強(qiáng)抗凝血活性的主要貢獻(xiàn)成分。本研究旨在為揭示丹參炮制機(jī)理及建立丹參與酒丹參飲片質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

日立L?2000 Elite 高效液相色譜儀、L?2455 二極管陣列檢測器（日本日立公司）；FA1604N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；LDZ4?0.8 離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；KQ?250E 醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MK?30 炒藥機(jī)（江陰市祝塘明科機(jī)械廠）；XL1000E 全自動(dòng)凝血分析儀（北京眾馳偉業(yè)科技發(fā)展有限公司）。

丹參酮ⅡA、丹酚酸B、迷迭香酸草酸、丹參素鈉對照品（上海源葉生物科技有限公司）；隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、5?羥甲基糠醛對照品對照品（中國食品藥品檢定研究院），以上對照品純度均大于98.0%。纖維蛋白原（FIB）測試盒、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）測定試劑盒、凝血酶原時(shí)間（PT）測定試劑盒、凝血酶時(shí)間（TT）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

10 批生丹參飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia?miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖的切制品，產(chǎn)地分別為河北（S1）、山西（S2）、四川（S3）、河南（S4）、河北（S5）、陜西（S6）、安徽（S7）、山東1（S8）、湖北（S9）、山東2（S10）。

新西蘭白兔24 只，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20080002。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒丹參制備 取10 批生丹參飲片各100 g，加稀黃酒20 mL（黃酒∶水＝1 ∶1），拌勻，悶潤2 h，置炒藥機(jī)內(nèi)，30 r／min 炒制20 min，取出晾涼，篩去碎屑，混勻，塑料袋密封，即得，編號A1～A10。

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取對照品丹參酮ⅡA、丹酚酸B、隱丹參酮、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮Ⅰ、丹參素鈉適量，加甲醇制成每1 mL 含丹參酮ⅡA、丹酚酸B 各130 μg，隱丹參酮、迷迭香酸、紫草酸、丹參酮Ⅰ、丹參素鈉、5?羥甲基糠醛各30 μg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取生丹參、酒丹參粉末（過3 號篩）各0.5 g，置具塞錐形瓶中，加80% 甲 醇20 mL，密 塞，稱定質(zhì) 量，超 聲（250 W、40 Hz）處理40 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.05% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，90.0%～77.0% B；15～25 min，77.0%～75.0% B；25～42 min，75.0%～58.0% B；42～73 min，58.0%～27.0% B；73～82 min，27.0%～18.0% B；82～85 min，18.0%～15.0%B；85～90 min，15.0%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一批生丹參，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定并記錄主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批生丹參，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下自然放置24 h 后于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測定并記錄主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批生丹參6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，記錄主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，各色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 圖譜生成 精密吸取對照品、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，在“2.2.3”項(xiàng)條件下分析，指紋圖譜見圖1～2。

圖1 10 批生丹參HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of raw S.milti?orrhiza

結(jié)果表明，生丹參及酒丹參HPLC 指紋圖譜存在顯著差異。丹參酒炙后，色譜峰1（丹參素鈉）、3（原兒茶醛）、8、9、10、16 的峰面積顯著增加，而色譜峰4（咖啡酸）、7（丹酚酸B）、13、15、19、20（丹參酮ⅡA）明顯降低；色譜峰a、b（5?羥甲基糠醛）在生品中未檢出，可能為酒炙后的新增峰。

圖2 10 批酒丹參HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of wine?pro?cessed S.miltiorrhiza

2.2.8 相似度分析 將各批生丹參、酒丹參指紋圖譜峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012A 版”，計(jì)算各批樣品指紋圖譜的相似度。結(jié)果，10 批生丹參飲片與對照圖譜的似度度為0.991～0.999，10 批酒丹參飲片與對照圖譜的相似度為0.982～0.999。

2.3 體外抗凝血活性測定

2.3.1 供試品溶液制備 取生丹參、酒丹參粉末（過3 號篩），分別加12 倍量80%甲醇超聲提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至浸膏。取適量，加入1%二甲基亞砜超聲溶解，制成質(zhì)量濃度相當(dāng)于0.1 g／mL 生藥的溶液，即得。

2.3.2 APTT、PT、TT、FIB 測定

取健康新西蘭白兔，隨機(jī)分為空白對照組、生丹參組、酒丹參組，每組8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)前禁食8 h，耳緣靜脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉（血與抗凝劑體積比為9 ∶1）抗凝，收集于離心管中，3 000 r／min 離心15 min，吸取上清液，即得待測血漿。按各試劑盒的要求進(jìn)行凝血指標(biāo)（PT、APTT、TT、FIB）的測定，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示。結(jié)果見表1。

表1 生丹參、酒丹參對PT、APTT、TT、FIB 的影響（， n＝8）Tab.1 Effects of crude and wine?processed S.miltiorrhiza on PT，APTT，TT and FIB（， n＝8）

表1 生丹參、酒丹參對PT、APTT、TT、FIB 的影響（， n＝8）Tab.1 Effects of crude and wine?processed S.miltiorrhiza on PT，APTT，TT and FIB（， n＝8）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，** P＜0.01；與相應(yīng)的丹參生品組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

與空白對照組比較，生丹參和酒丹參均可延長PT、APTT、TT（P＜0.05 或P＜0.01），縮短FIB（P＜0.05 或P＜0.01），表明生丹參與酒丹參均有抗凝血活性；與生丹參比較，酒丹參能延長PT、APTT、TT（P＜0.05 或P＜0.01），縮短FIB（P＜0.05 或P＜0.01），表明丹參酒炙后抗凝血活性顯著增強(qiáng)。

2.4 相關(guān)性分析 利用SIMCA?P14.1 軟件中的偏最小二乘回歸分析（PLS?DA），比較生丹參及酒丹參在同一質(zhì)量濃度（0.1 mg／mL）下抗凝血活性與HPLC 色譜峰的相關(guān)性。以生丹參、酒丹參的共有峰面積為自變量，抗凝血指標(biāo)APTT、PT、TT、FIB 為因變量，進(jìn)行共有色譜峰與活性指標(biāo)之間的相關(guān)性分析。變量對抗凝血活性的影響可由VIP 值的大小來衡量，20 個(gè)共有峰分別與APTT、PT、TT、FIB 指標(biāo)相關(guān)的VIP 見圖3。

圖3 生丹參、酒丹參譜效相關(guān)PLS?DA 模型的VIP 圖Fig.3 VIP diagrams of spectrum?effect related PLS?DA models for crude and wine?processed S.miltiorrhiza

VIP 越大，即變量離X 軸越遠(yuǎn)，表明該色譜峰對于丹參與酒丹參的分類貢獻(xiàn)越大，即為最能導(dǎo)致生丹參、酒丹參藥效相區(qū)分的差異成分。由圖3 可知，峰7（丹酚酸B）、6（紫草酸）、5（迷迭香酸）、15 的VIP 值均大于1，表明上述色譜峰對生丹參、酒丹參抗凝血活性差異的貢獻(xiàn)較大，也是導(dǎo)致兩者作用不同的主要成分。

3 討論

凝血過程主要分為內(nèi)源性和外源性2 種凝血途徑，大致可分為凝血酶原激活物的形成、凝血酶的形成及纖維蛋白的形成3 個(gè)階段。APTT 是反應(yīng)內(nèi)源性凝血途徑的指標(biāo)；PT 可反映外源性凝血途徑的有關(guān)因子的水平；TT 主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的時(shí)間；FIB 即為凝血因子Ⅰ，通過對纖溶系統(tǒng)的影響反映凝血效果［13］。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法建立了生丹參及酒丹參指紋圖譜，選取APTT、PT、TT、FIB 4 個(gè)指標(biāo)測定了丹參及酒丹參的體外抗凝血活性，與生品比較，酒丹參的抗凝血作用顯著增強(qiáng)。用PLS?DA 法對丹參及酒丹參的共有峰與抗凝血藥效進(jìn)行譜效相關(guān)分析，建立丹參生品及酒制品的共有峰與抗凝血活性藥效的相關(guān)性模型，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致丹參及酒丹參在抗凝血活性方面差異的主要成分包括丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸及1 種未知成分，此未知成分的結(jié)構(gòu)及在活血化瘀方面的活性還需進(jìn)一步驗(yàn)證。該方法能夠較精準(zhǔn)的找到導(dǎo)致中藥炮制前后藥理活性發(fā)生變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為傳統(tǒng)醫(yī)藥理論提供佐證，為丹參及酒炙丹參的質(zhì)量控制與譜效關(guān)系研究提供思路。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參經(jīng)酒炙后丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸含量均降低，丹酚酸B 轉(zhuǎn)化為丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸C，迷迭香酸轉(zhuǎn)化為丹參素、咖啡酸、阿魏酸［14］。據(jù)報(bào)道，迷迭香酸在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為香豆酸、丹參素等成分；丹酚酸B 在體內(nèi)降解為丹參素、咖啡酸及紫草酸［15?16］，推測丹參酒炙過程中受溫度的影響促使丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸轉(zhuǎn)化為更易被人體吸收、活性更強(qiáng)的化合物，從而增強(qiáng)了其抗凝血藥效，有待深入研究。