貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠腎臟URAT1、OAT1 及病理的影響

符靜泉郭 為韋曼莉趙凱麗蔣偉哲*付書婕*

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530021； 2.南寧市衛(wèi)生學(xué)校，廣西 南寧530007； 3.廣西醫(yī)科大學(xué)玉林校區(qū)，廣西 玉林537000）

隨著人們生活水平不斷提高，痛風(fēng)發(fā)生率逐漸上升，其臨床表現(xiàn)通常有急性期、間歇期、慢性期、腎臟病變期，其中痛風(fēng)性腎病的嚴(yán)重程度，防治不容小覷［1］。目前，治療痛風(fēng)的西藥不良反應(yīng)較多，故對(duì)中藥的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)［2?3］。

貓須草是一種藥食兩用的傳統(tǒng)中草藥，廣泛分布于中國(guó)、印度、馬來(lái)西亞、澳大利亞的熱帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)，其抗痛風(fēng)作用廣為人知，包括利尿、排尿酸、抗腎結(jié)石、抗炎、鎮(zhèn)痛［4］，也可用于肝硬化、草酸鈣結(jié)石、腎炎、糖尿病等疾病的治療［5?7］，但作用機(jī)制尚未明確。迄今為止，尚未見關(guān)于貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體及有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（organic anion transporter，OATs 家族）表達(dá)影響的報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)采用酵母粉＋腺嘌呤致痛風(fēng)性腎病大鼠模型，探討貓須草水提物對(duì)其腎組織尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體1（urate transporter，URAT1）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）蛋白表達(dá)及病理的影響，以期為該藥材臨床應(yīng)用及進(jìn)一步推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（桂）2014?0003。

1.2 藥材、試劑與藥物 貓須草購(gòu)自南寧市生源中藥飲片有限責(zé)任公司（產(chǎn)地廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣），經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為唇形科腎茶屬植物貓須草Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu ex H.W.Li 的地上部分（莖枝、葉、花序）。別嘌醇片（廣東彼得藥業(yè)有限公司，批號(hào)20130803）。腺嘌呤（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)XJ0606MA14）；酵母粉（廣西湘桂酵母科技有限公司，批號(hào)P20140912）；尿素氮檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150512）；rabbit anti?oat?1（貨號(hào)bs?0607r）、rabbit anti?urat?1（貨號(hào)bs?0603r）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；PBS 緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）。甲醇（上海鑫達(dá)精細(xì)化工有限公司）；dd H2O（廣西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心）；無(wú)水乙醇（成都市科龍化工試劑廠）。

1.3 儀器 Micro CL17R 型高速低溫離心機(jī)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；日立7100 全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；EL602 電子天平（百分之一）、EL204 電子天平（萬(wàn)分之一）［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；1334 無(wú)菌操作臺(tái)（長(zhǎng)沙米淇?jī)x器設(shè)備有限公司）；202?4電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；UPT?Ⅱ?20T 超純水器（成都超純科技有限公司）；1512石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leitz 公司）；2BE?70?35 實(shí)驗(yàn)室制冰機(jī)（德國(guó)Zigera 公司）；MDF?U4086S 超低溫冰箱（日本Sanyo 公司）；BX40 顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 貓須草水提物制備 將干燥藥材粉碎得粗粉，稱取250 g，加10 倍量蒸餾水，100 ℃水浴回流3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至膏狀，濃縮液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，置于80 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥，即得，質(zhì)量為14.533 g，得率為5.81%，再用蒸餾水將其制成灌胃給藥液。

2.2 造模 將促進(jìn)尿酸生成的尿酸前體物質(zhì)（黃嘌呤氧化酶）酵母粉和抑制尿酸排泄的腺嘌呤聯(lián)合應(yīng)用，以建立痛風(fēng)性腎病大鼠模型［8?9］。造模組大鼠每天上午灌胃給予腺嘌呤混懸液（100 mg／kg）1 次，同時(shí)給予混合酵母干粉的大鼠粗粉飼料（酵母干粉含量為10%），盡量控制酵母攝入劑量為10 g／kg，而空白組大鼠僅給予普通顆粒飼料，2 組均自由攝食飲水。

2.3 分組與給藥 采用區(qū)組隨機(jī)分組法，將60 只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，分別為空白組，模型組，貓須草水提物高、中、低劑量組，別嘌醇組，每組10 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。除空白組外，各組大鼠于每天上午固定時(shí)間給予酵母飼料，同時(shí)給予腺嘌呤混懸液造模，再于下午固定時(shí)間灌胃給藥，劑量分別為貓須草水提物高劑量組6 000 mg／kg、貓須草水提物中劑量組3 000 mg／kg、貓須草水提物低劑量組1 500 mg／kg、別嘌醇組5 mg／kg，連續(xù)30 d。

2.4 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察各組大鼠毛色、神態(tài)、攝食量、進(jìn)水量、尿量、行為活動(dòng)度等一般情況，并于0（給藥前）、5、10、15、20、25、25、30 d 觀察其體質(zhì)量變化情況。

2.5 大鼠血清尿酸（SUA）、血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平檢測(cè) 末次給藥3 h 后，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，室溫下自然凝血1 h，3 500×g離心10 min，分離血清，生化分析儀檢測(cè)SUA、SCr 水平，試劑盒檢測(cè)BUN 水平。

2.6 大鼠尿尿酸（UUA）、尿肌酐（UCr）水平及24 h 尿液排泄量、尿酸分級(jí)排泄率檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，各組大鼠上代謝籠收集24 h 尿液，測(cè)量24 h 尿液排泄量并觀察其顏色，生化分析儀檢測(cè)UUA、UCr 水平。尿酸分級(jí)排泄率＝ ［（UUA×SCr）／（SUA×UCr）］ ×100%。

2.7 大鼠腎組織病理學(xué)觀察 大鼠腹主動(dòng)脈采血后，置于冰臺(tái)上迅速取出右腎組織，10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片（厚度4～6 μm），65 ℃烤片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察其病理變化。

2.8 大鼠腎組織URAT1、OAT1 蛋白表達(dá)檢測(cè)采用鏈霉素抗生物素蛋白?過(guò)氧化酶法（SP 法）。大鼠腎組織取材、石蠟包埋、切片、脫水后，3%H2O2去離子水孵育10 min 以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓抗原修復(fù)后自然冷卻至室溫，10%山羊血清封閉，在濕盒中室溫孵育20 min，URAT1 抗體按1 ∶400 比例、OAT1 抗體按1 ∶800 比例配成工作液，滴加一抗工作液50 μL，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜，復(fù)溫后PBS 緩沖液沖洗2～3 次，滴加二抗50 μL，在濕盒中室溫孵育30 min，滴加SP 溶液50 μL，室溫孵育30 min，滴加新鮮配制的DAB 液顯色，在顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。采用Q550CW 計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，高倍視野（×200）拍照，再通過(guò)Image Pro Plus 軟件測(cè)量窗口區(qū)域內(nèi)的陽(yáng)性總面積和灰度值（IOD），取平均值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS16.0 軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以（）表示，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析（one?way ANOVA），2 組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，空白組大鼠精神和食欲良好，反應(yīng)靈敏，體毛光澤度理想，體質(zhì)量逐漸遞增，尿量、尿液顏色均正常；與空白組比較，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲不振、精神萎靡、少動(dòng)、畏寒拱背、皮毛干枯、體質(zhì)量逐漸下降等癥狀，在第22、26 天各有1 只死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)兩者均表現(xiàn)為腎臟明顯腫大，表面大片白斑，呈紅白相間狀態(tài)，推測(cè)可能為急性腎功能衰竭致死；貓須草水提物各劑量組、別嘌醇組均能不同程度地改善大鼠異常變化，減輕其腎臟病理性改變。

3.2 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠體質(zhì)量的影響 由表1 可知，模型組大鼠體質(zhì)量減輕，進(jìn)食量低于空白組，在10 d 后更明顯，導(dǎo)致其體質(zhì)量增量低于空白組（P＜0.01）；貓須草水提物各劑量組、別嘌醇組大鼠體質(zhì)量增量雖低于空白組，但均高于模型組（P＜0.01）。

表1 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠體質(zhì)量的影響（， n＝10）Tab.1 Effect of aqueous extract of O.stamineus on body weight of rats with gouty nephropathy（， n ＝10）

表1 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠體質(zhì)量的影響（， n＝10）Tab.1 Effect of aqueous extract of O.stamineus on body weight of rats with gouty nephropathy（， n ＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

3.3 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠SUA、SCr、BUN 水平的影響 由表2 可知，與空白組比較，模型組大鼠SUA、SCr、BUN水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，貓須草水提物高、中劑量組和別嘌醇組大鼠SUA 水平降低（P＜0.01），貓須草水提物各劑量組、別嘌醇組大鼠SCr 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；貓須草水提物高、中劑量組和別嘌醇組大鼠BUN 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠SUA、SCr、BUN 水平的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of aqueous extract of O.stamineus on SUA，SCr and BUN levels in rats with gouty nephropath（， n＝10）

表2 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠SUA、SCr、BUN 水平的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of aqueous extract of O.stamineus on SUA，SCr and BUN levels in rats with gouty nephropath（， n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.4 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠24 h UUA、24 h UCr 水平及24 h 尿液排泄量、尿酸分級(jí)排泄率的影響 由表3 可知，與空白組比較，模型組大鼠24 h UUA、24 h UCr 水平及尿酸分級(jí)排泄率降低（P＜0.01），24 h 尿液排泄量升高（P＜0.01）；與模型組比較，貓須草水提物高、中劑量組及別嘌醇組大鼠24 h UUA、24 h UCr 水平及尿酸分級(jí)排泄率升高（P＜0.05，P＜0.01），貓須草水提物各劑量組大鼠24 h 尿液排泄量高于模型組，而別嘌醇組大鼠更低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠24 h UUA、24 h UCr 水平及24 h 尿液排泄量、尿酸分級(jí)排泄率的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of aqueous extract of O.stamineus on 24 h UUA and 24 h UCr levels，24 h urine excretion and uric acid frac?tional excretion rate of rats with gouty nephropathy（， n＝10）

表3 貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠24 h UUA、24 h UCr 水平及24 h 尿液排泄量、尿酸分級(jí)排泄率的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of aqueous extract of O.stamineus on 24 h UUA and 24 h UCr levels，24 h urine excretion and uric acid frac?tional excretion rate of rats with gouty nephropathy（， n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.5 大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變 由圖1 可知，空白組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，未見尿酸鹽結(jié)晶，炎性細(xì)胞極少；模型組大鼠部分腎小球萎縮，腎小管擴(kuò)張，可見大量尿酸鹽結(jié)晶沉積，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別區(qū)域有局灶性纖維化；貓須草水提物各劑量組大鼠均無(wú)腎臟尿酸鹽結(jié)晶，腎組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，腎小管擴(kuò)張和間質(zhì)纖維化有所改善；別嘌醇組大鼠雖無(wú)腎臟尿酸鹽結(jié)晶，但腎組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)纖維等癥狀仍為嚴(yán)重，與模型組比較改善較小。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE，×200）Fig.1 Pathological morphology changes of renal tissues of rats in various groups（HE，×200）

3.6 大鼠腎組織URAT1、OAT1 蛋白表達(dá) 由圖2、表4 可知，URAT1 蛋白表達(dá)于腎臟組織近曲小管上皮細(xì)胞刷狀緣。其中，空白組大鼠可見淡棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)病理改變；模型組大鼠棕黃色陽(yáng)性表達(dá)面積增多，大部分區(qū)域甚至呈深棕色，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)烈；貓須草水提物高、中劑量組及別嘌醇組大鼠陽(yáng)性表達(dá)面積明顯減少，棕黃色變淺，病理改變得到改善。

圖2 各組大鼠腎組織URAT1 表達(dá)（×200）Fig.2 URAT1 expressions of renal tissues of rats in various groups（×200）

表4 各組大鼠腎組織URAT1 陽(yáng)性總面積、IOD 值比較（， n＝10）Tab.4 Comparision of URAT1 positive total areas and IOD values in renal tissues of rats among various groups（，n＝10）

表4 各組大鼠腎組織URAT1 陽(yáng)性總面積、IOD 值比較（， n＝10）Tab.4 Comparision of URAT1 positive total areas and IOD values in renal tissues of rats among various groups（，n＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

由圖3、表5 可知，OAT1 蛋白表達(dá)在腎近曲小管上皮細(xì)胞基底側(cè)膜。其中，空白組大鼠可見深棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，無(wú)病理改變；模型組大鼠黃色陽(yáng)性表達(dá)面積減少，棕黃色變淺；貓須草水提物高、中劑量組及別嘌醇組大鼠陽(yáng)性表達(dá)面積明顯增加，棕黃色變深，病理改變得到改善。

表5 各組大鼠腎組織OAT1 陽(yáng)性總面積、IOD 值比較（， n＝10）Tab.5 Comparision of OAT1 positive total areas and IOD values in renal tissues of rats among various groups（， n ＝10）

表5 各組大鼠腎組織OAT1 陽(yáng)性總面積、IOD 值比較（， n＝10）Tab.5 Comparision of OAT1 positive total areas and IOD values in renal tissues of rats among various groups（， n ＝10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

圖3 各組大鼠腎組織OAT1 表達(dá)（×200）Fig.3 OAT1 expressions of renal tissues of rats in various groups（×200）

4 討論

腺嘌呤是核酸的主要成分之一，可經(jīng)黃嘌呤氧化酶的作用轉(zhuǎn)變成尿酸，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x用腺嘌呤主要是通過(guò)增加腺嘌呤攝入使得體內(nèi)尿酸生成增加，短期內(nèi)生成尿酸結(jié)晶沉積于腎臟，從而引起痛風(fēng)性腎病。酵母是通過(guò)干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝，使黃嘌呤氧化酶活性增加進(jìn)而加速尿酸的生成［10?11］。單獨(dú)酵母法造模是接近原發(fā)性痛風(fēng)性腎病的造模，聯(lián)合腺嘌呤使用能引起腎功能損傷，更接近人類繼發(fā)性痛風(fēng)性腎病的發(fā)病機(jī)理。

肌酐（Cr）是一種小分子終末代謝物，不能與血漿蛋白結(jié)合，只有少量經(jīng)腎小管離子通道排泌，絕大部分肌酐并不被腎小管重吸收，而經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)進(jìn)入原尿。腎小球損傷時(shí)，肌酐水平會(huì)發(fā)生一定變化，故臨床上血肌酐常被用于腎功能的測(cè)定指標(biāo)。BUN 是體內(nèi)氨基酸分解代謝的終產(chǎn)物，可經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)。各種腎疾患所致的腎小球病變都可見于BUN 的升高，常與血肌酐綜合測(cè)定來(lái)判斷腎小球的濾過(guò)功能，是檢測(cè)腎功能的敏感指標(biāo)［12?13］。本實(shí)驗(yàn)的貓須草水提物高、中劑量組降低SUA、SCr 及BUN 水平，特別高劑量組效果優(yōu)于別嘌醇組。貓須草水提物高、中劑量組亦明顯提高痛風(fēng)性腎病大鼠的24 h UUA、24 h UCr 和FEUA，提示貓須草水提物的降尿酸能力可能與其促進(jìn)尿酸的排泄有關(guān)。

經(jīng)過(guò)腺嘌呤的灌胃，痛風(fēng)性腎病大鼠的腎臟腫大嚴(yán)重。光鏡的病理結(jié)果顯示，貓須草水提物高、中、低劑量組均可減少腎組織內(nèi)尿酸結(jié)晶沉積，且減輕腎臟組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及局部病灶纖維化程度，為貓須草水提物治療痛風(fēng)性腎病提供了病理形態(tài)學(xué)依據(jù)，特別高劑量組效果遠(yuǎn)優(yōu)于別嘌醇組，足以看出貓須草水提物高劑量組對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠的腎臟保護(hù)作用。

大約70% 尿酸經(jīng)腎臟排泄，故腎臟排泄成為研究促尿酸排泄藥的重要靶點(diǎn)，近年來(lái)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成為了這方面的研究焦點(diǎn)，如URAT1 和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。URAT1 由SLC22A1 基因編碼，在腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣表達(dá)，是腎臟尿酸重吸收的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體［14］。OATs 家族中OAT1 和OAT3 是調(diào)節(jié)尿酸排泄的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，而OAT10 負(fù)責(zé)尿酸的重吸收［15?16］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)貓須草水提物對(duì)痛風(fēng)性腎病大鼠的URAT1 及OAT1 的蛋白表達(dá)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：貓須草水提物高、中劑量組大鼠URAT1 蛋白表達(dá)降低而OAT1 蛋白表達(dá)升高。

綜上所述，貓須草水提物對(duì)腺嘌呤和酵母粉所致大鼠痛風(fēng)性腎病具有良好的治療作用，其機(jī)制可能與上調(diào)OAT1 蛋白表達(dá)促進(jìn)尿酸排泄和下調(diào)URAT1 蛋白表達(dá)抑制尿酸重吸收的雙重調(diào)節(jié)功能有關(guān)，具體機(jī)制本課題組將作進(jìn)一步研究。