蘇合香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

孫 健諸艷蓉胡 青毛秀紅季 申

（上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203）

蘇合香為金縷梅科植物蘇合香樹Liquidambar orientalisMill.樹干滲出的香樹脂經(jīng)加工精制而成，具開竅、辟穢、止痛之功效，用于治療中風(fēng)痰闕、猝然昏倒、胸痹心痛、胸腹冷痛、驚癇［1］，大多用于配伍開竅止痛之中成藥，如蘇合香丸、冠心蘇合丸、麝香保心丸等，該植物主要分布于小亞細(xì)亞南部，如土耳其、敘利亞北部等地區(qū)［2］。另外，《美國藥典》 將同屬植物北美楓香樹Liquidambar styacifluaL.也作為蘇合香的基原。

蘇合香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于2020 年版《中國藥典》 一部和進(jìn)口藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要包括性狀、化學(xué)鑒別、薄層鑒別、酸值檢查、皂化值檢查、肉桂酸含量測定，但其專屬性不強(qiáng)，含量限度過低，無法對偽品進(jìn)行有效區(qū)分。因此，本實(shí)驗(yàn)對蘇合香物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，從薄層鑒別、酸值皂化值檢查、特征圖譜、特征成分含量測定等方面全面系統(tǒng)地研究，以期為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 5975B 型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 6890 型氣相色譜儀（美國Agilent 公司）；XSE205DU 型電子分析天平（十萬分之一，美國Mettler?Toledo公司）；CP224S型電子分析天平（萬分之一，德國Sartorius 公司）。

1.2 試劑與藥物 蘇合香對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號120931?201804）。肉桂酸肉桂酯對照品（北京百靈威科技有限公司，批號LF60Q43）；肉桂酸?3?苯丙酯對照品（天津阿爾塔科技有限公司，批號ALT077011?4，純度97.2%）。無水乙醇、石油醚、正己烷、甲酸乙酯、甲酸均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。蘇合香18批，均由國內(nèi)企業(yè)提供，具體信息見表1；偽品4批，均購自藥材市場。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 物質(zhì)基礎(chǔ)研究

2.1.1 分析條件 HP?5MS 毛細(xì)管柱（柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.25 μm）；載氣氮?dú)?，體積流量0.7 mL／min；程序升溫，初始60 ℃保持5 min，4 ℃／min 升至280 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量1 μL；EI 離子源（70 eV）；接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；掃描范圍m／z35～500。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品0.5 g，置于具塞離心管中，精密加入10 mL 無水乙醇，振搖10 min溶解，即得。

2.1.3 結(jié)果分析 通過檢索NIST 數(shù)據(jù)庫，對GC／MS 總離子流色譜圖（圖1）中的特征峰進(jìn)行化合物鑒定，再以對照品進(jìn)行比對，結(jié)果見表2。由此可知，2 個(gè)產(chǎn)地藥材成分組成基本一致，均有18個(gè)化合物，其中12 個(gè)與對照品比對，發(fā)現(xiàn)含量最高者為肉桂酸肉桂酯、肉桂酸?3?苯丙酯，與文獻(xiàn)［3?15］ 報(bào)道一致。

圖1 蘇合香GC／MS 總離子流色譜圖Fig.1 GC／MS total ion current chromatogram of Styrax

表2 蘇合香成分鑒定結(jié)果Tab.2 Results of component identification of Styrax

2.2 TLC 定性鑒別 取本品約0.1 g，精密稱定，置于具塞離心管中，精密加入10 mL 無水乙醇，振搖10 min 溶解，作為供試品溶液；取對照藥材約0.1 g，同法制成對照藥材溶液；取肉桂酸肉桂酯對照品，加無水乙醇制成每1 mL 含3 mg 該成分的對照品溶液。按照2020 年版《中國藥典》 四部通則0502，吸取上述3 種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）?正己烷?甲酸乙酯?甲酸（10 ∶30 ∶15 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，并在365 nm 紫外光燈下檢視，結(jié)果見圖2。由此可知，供試品色譜中在對照藥材、對照品色譜相應(yīng)位置上呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖2 蘇合香TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of Styrax

2.3 酸值、皂化值 按照2020 年版《中國藥典》四部通則0713 脂肪和脂肪油測定法項(xiàng)下的酸值測定法和皂化值測定法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 各樣品酸值、皂化值測定結(jié)果Tab.3 Results of acid value and saponification value determination of various samples

2.4 特征圖譜建立

2.4.1 分析條件 HP?5 毛細(xì)管柱（柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.25 μm）；程序升溫，初始70 ℃，5 ℃／min 升至125 ℃，保持10 min，10 ℃／min升至270 ℃，20 ℃／min 升至320 ℃，保持3 min；進(jìn)樣口溫度300 ℃；檢測器溫度350 ℃；分流進(jìn)樣，分流比10 ∶1；進(jìn)樣量1 μL。

2.4.2 參照物溶液制備 取對照藥材約0.1 g，精密稱定，置于具塞離心管中，精密加入10 mL 無水乙醇，振搖10 min 溶解，作為對照藥材參照物溶液。精密稱取肉桂酸肉桂酯、肉桂酸?3?苯丙酯對照品適量，無水乙醇制成每1 mL 分別含兩者3、1.5 mg 的溶液，作為對照品參照物溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 取本品約0.1 g，精密稱定，置于具塞離心管中，精密加入10 mL 無水乙醇，振搖10 min 溶解，即得。

2.4.4 耐用性試驗(yàn) 考察3 種5%苯基甲基聚硅氧烷氣相色譜柱（柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.25 μm），即Agilent HP?5MS、Agilent DB?5MS、Thermo TG?5MS。結(jié)果，供試品色譜均可獲得理想的分離度和峰形，表明該方法耐用性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號IMF?010166）6 份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，供試品特征圖譜中有8 個(gè)特征峰，均與對照藥材參照物色譜峰中的相對應(yīng)，其中峰7、8 均與后者保留時(shí)間一致，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，于0、8、22、30 h 在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，供試品特征圖譜中有8 個(gè)特征峰，均與對照藥材參照物色譜峰中的相對應(yīng)，其中峰7、8 均與后者保留時(shí)間相一致，表明溶液在30 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。另外，肉桂酸肉桂酯的降解產(chǎn)物肉桂酸不影響石竹烯判定。

2.4.7 測定結(jié)果 選取對照藥材參照物色譜圖（圖3）中8 個(gè)峰面積相對較大的色譜峰作為特征峰，發(fā)現(xiàn)供試品特征圖譜（圖4）中有相應(yīng)的8 個(gè)特征峰，其中峰7、8 與其保留時(shí)間一致。

圖4 18 批樣品特征圖譜Fig.4 Specific chromatograms of eighteen batches of samples

圖3 對照品參照圖譜Fig.3 Specific chromatogram of reference substances

2.5 肉桂酸?3?苯丙酯含量測定

2.5.1 分析條件 同“2.4.1”項(xiàng)，色譜圖與圖4一致。

2.5.2 對照品溶液制備 精密稱取肉桂酸?3?苯丙酯對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL 含1.5 mg該成分的溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密稱取肉桂酸?3?苯丙酯對照品適量，加無水乙醇分別制成每1 mL 含0.4、0.8、2、4、10 mg 該成分的溶液，各精密吸取1 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以肉桂酸?3?苯丙酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝739.375 82X－17.431 80（r＝0.999 95），在0.4～10 mg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液（1.5 mg／mL）1 μL，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得肉桂酸?3?苯丙酯峰面積RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號IMF?010166），于0、8、22、30 h 在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得肉桂酸?3?苯丙酯峰面積RSD 為1.3%，表明溶液在30 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號IMF?010166），按“2.5.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得肉桂酸?3?苯丙酯含量RSD 為0.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取肉桂酸?3?苯丙酯含量已知的樣品（批號IMF?010166，為簡便計(jì)算，使用未折算對照品純度的18.2%）約0.05 g，共9份，精密稱定，置于具塞離心管中，每3 份為1組，分別按80%、100%、120%水平精密加入對照品，再精密加入10 mL 無水乙醇，振搖10 min 溶解，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4 肉桂酸?3?苯丙酯加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.4 Results of recovery tests for 3?phenylpropyl cinnamate（n＝9）

2.5.9 樣品含量測定 取 18 批樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表5。

表5 肉桂酸?3?苯丙酯、總?cè)夤鹚岷繙y定結(jié)果Tab.5 Results of content determination of 3?phenylpropyl cinnamate and total cinnamic acid

2.6 總?cè)夤鹚岷繙y定 按2020 年版《中國藥典》 一部蘇合香含量測定項(xiàng)下方法，對18 批樣品堿水解后的肉桂酸總量進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 物質(zhì)基礎(chǔ)研究 蘇合香原植物產(chǎn)于國外，基原鑒定困難較大，本實(shí)驗(yàn)收集到2 個(gè)產(chǎn)地藥材，并與對照藥材進(jìn)行成分比較，發(fā)現(xiàn)兩者基本一致，表明它們?yōu)檎?。另外? 個(gè)產(chǎn)地蘇合香成分組成基本一致，僅含量較低的桂皮醛、苯乙烯、蒎烯等有所不同，其中產(chǎn)地為洪都拉斯者可能是北美楓香樹所產(chǎn)。

再對偽品的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)可分為4類，包括（1）主要含苯甲酸芐酯、肉桂酸芐酯；（2）主要含苯甲酸、桂皮醛、肉桂酸；（3）主要含肉桂酸甲酯、肉桂酸?3?苯丙酯、肉桂酸肉桂酯，但含量較低；（4）主要含十八烯酸乙酯等脂肪酸酯。但按現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，上述成分均符合規(guī)定，即無法有效區(qū)分蘇合香真?zhèn)巍?/p>

3.2 TLC 定性鑒別 以蘇合香特征成分為指標(biāo)考察TLC 定性鑒別方法，發(fā)現(xiàn)肉桂酸?3?苯丙酯無明顯斑點(diǎn)，故選擇對照藥材、肉桂酸肉桂酯進(jìn)行分析。按“2.2”項(xiàng)下方法檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)“3.1”項(xiàng)下4類偽品均不符合規(guī)定，表明該方法可有效區(qū)分蘇合香真?zhèn)巍?/p>

3.3 酸值檢查 18 批樣品酸值在52～55 范圍內(nèi)，而現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為52～76，即它們均接近于低限。因此，建議參照《美國藥典》 標(biāo)準(zhǔn)，適當(dāng)放寬蘇合香酸值限度為50～76。

3.4 特征圖譜建立 選擇蘇合香中峰面積較大的共有成分作為特征圖譜檢測指標(biāo)，最終確定為苯乙烯、4?乙基酚、苯丙醇、肉桂醇、石竹烯、肉桂酸芐酯、肉桂酸?3?苯丙酯、肉桂酸肉桂酯，按面積歸一化法計(jì)算，其總占比達(dá)80%以上，其中2 種主要成分占70% 左右，能代表本品大多數(shù)化合物。結(jié)果，4 種偽品均不符合規(guī)定，表明該方法可有效區(qū)分蘇合香真?zhèn)巍?/p>

3.5 含量測定 本實(shí)驗(yàn)對蘇合香含量最高、次高的成分肉桂酸肉桂酯、肉桂酸?3?苯丙酯定量測定方法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)前者在乙醇、乙醚、乙酸乙酯等溶劑中極不穩(wěn)定，而以環(huán)己烷為溶劑時(shí)提取效率較差，故采用GC 法測定后者含量，規(guī)定按含量平均值的80%擬定限度時(shí)，本品中該成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于13.5%。結(jié)果，18 批樣品均符合上述限度，而4 批偽品均遠(yuǎn)低于限度。雖然蘇合香現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的總?cè)夤鹚岷繙y定方法可代表肉桂酸酯類成分總量，但建議大幅提高其含量限度為不得低于23.0%。

4 結(jié)論

蘇合香主要化學(xué)成分為以肉桂酸肉桂酯、肉桂酸?3?苯丙酯為代表的肉桂酸酯類，本實(shí)驗(yàn)針對性地對該藥材TLC 定性鑒別、酸值皂化值檢查、特征圖譜、含量測定方法進(jìn)行研究，建立了全面、專屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法，可有效區(qū)分其真?zhèn)巍?/p>