氟西汀對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用

曹琪璐，劉 菁，趙 彤，陳克明，馬慧萍，賈正平

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

氟西汀是目前臨床常用的抗抑郁藥，其作用機(jī)制是作為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑來抑制神經(jīng)元對(duì)5-羥色胺的再攝取。最近有學(xué)者報(bào)道，氟西汀還具有神經(jīng)保護(hù)作用，Zhao等[1]發(fā)現(xiàn)氟西汀處理的抑郁癥大鼠神經(jīng)元凋亡減少，凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3水平下調(diào)；Zeng等[2]報(bào)道氟西汀通過PI3K/Akt/Fox03a和PKA/CREB信號(hào)通路對(duì)抗皮質(zhì)酮所致的PC12細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用；Hu等[3]發(fā)現(xiàn)氟西汀可改善腦缺血小鼠的記憶障礙，其可能機(jī)制是氟西汀可以促進(jìn)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中海馬神經(jīng)干細(xì)胞的存活，增加海馬回和齒狀回區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

課題組在前期抗高原缺氧損傷研究中發(fā)現(xiàn)，由模擬高原環(huán)境引起的大鼠高原腦水腫模型中腦組織5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(serotonin transporter, SERT)蛋白和基因表達(dá)量均顯著上升，預(yù)先服用抗高原缺氧損傷藥物后，不但高原腦水腫發(fā)病情況明顯減輕，而且SERT的表達(dá)量也顯著下降。用體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞可以模擬這一過程。我們?yōu)榇颂岢黾僬f：SERT高表達(dá)也許是缺氧環(huán)境引起高原腦水腫的重要原因，抑制其高表達(dá)可能預(yù)防高原腦水腫。由于氟西汀是SERT抑制劑，故我們推測應(yīng)用氟西汀有可能獲得抗缺氧損傷效果。本實(shí)驗(yàn)首先考察了氟西汀對(duì)PC12細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用，得到了理想的結(jié)果，初步證明本假說的科學(xué)性， 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)；缺氧處理小室(STEMCELL，加拿大)；氧濃度檢測儀(EST-10，CSE，美國)；熒光倒置相差顯微鏡(IX3-SVR，Olympus，日本)；免疫印跡分析儀(1703930，Bio-Rad，美國)；高分辨活細(xì)胞成像系統(tǒng)(Delta Vision Ultra，Cytiva，美國)。

1.1.2細(xì)胞株 PC12細(xì)胞(ATCC CRL-1721.1TM)，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC)。

1.1.3藥物與試劑 鹽酸氟西汀(Y110140，MCE，美國)；F-12K培養(yǎng)基 (21127022，Gibco，美國)；馬血清(04-004-1，ABI，以色列)；胎牛血清(10099-141，Gibco，美國)；CCK-8(BA00208，博奧森生物，中國)；乳酸脫氫酶(A020-2-2，LDH)、丙二醛(A003-4-1，MDA)、超氧化物歧化酶(A001-3-2，SOD)和過氧化氫酶(A007-1-1，CAT)試劑盒購于南京建成生物；MAP2 (ab32454)、Bax (ab170114)、Bcl-2 (ab196495) 和caspase-3(ab13847)抗體購自英國Abcam公司；RIPA 裂解液(R0020)、4×緩沖液(P1015)、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(P1200)、ECL等購于北京索萊寶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，0.25%的胰酶消化，用含15%馬血清、2.5%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2-3 d更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2免疫熒光染色 將細(xì)胞傳代接種于鋪有細(xì)胞爬片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁并長滿80%皿底后進(jìn)行缺氧及加藥處理，之后棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗片，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10 min，洗片，加入0.1% Triton X-100透膜10 min，洗片，加入免疫熒光封閉液封閉1 h，棄封閉液，不洗，直接加入MAP2一抗，4 ℃冰箱過夜，次日洗片后，加入二抗，4 ℃冰箱避光孵育過夜，d3早晨從冰箱取出，洗掉二抗后，DAPI 孵育15 min，避光封片，放置陰暗環(huán)境下晾干，用活細(xì)胞工作站觀察染色情況。

1.2.3缺氧損傷模型的建立 待培養(yǎng)于中皿的PC12細(xì)胞長至接近融合后，將其轉(zhuǎn)入缺氧盒中，通入94% N2、1% O2和5% CO2的混合氣，氧濃度降至1%后開始計(jì)時(shí)，18 h后觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

1.2.4藥物處理 準(zhǔn)確稱取鹽酸氟西汀3.457 9 mg，融入100 μL DMSO后得到濃度為0.1 mol· L-1的鹽酸氟西汀母液，逐級(jí)稀釋，吸10 μL上級(jí)濃度，加入到90 μL的DMSO中，得到濃度分別為10-2、10-3、10-4和10-5mol·L-1溶液，放入-20 ℃保存待用。用培養(yǎng)基稀釋時(shí)，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.5細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8試劑盒。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞濃度為每孔1×104個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，加入鹽酸氟西汀，使其終濃度為10、1、0.1和0.01 μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將缺氧對(duì)照組和加藥組放入缺氧盒中缺氧處理18 h后，加入CCK-8，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在450 nm波長下測定吸光度(A)。根據(jù)A值高低篩選出鹽酸氟西汀作用的最佳藥物濃度。

1.2.6氧化產(chǎn)物含量和抗氧化酶活性檢測 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，收集培養(yǎng)液用于檢測LDH活性。培養(yǎng)皿棄掉剩余培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞3次，大皿細(xì)胞加800 μL裂解液，中皿加300 μL裂解液，冰上裂解20 min，吸上清至1.5 mL的離心管中，4 ℃低溫離心機(jī)中，12 000 r·min-1離心15 min，取上清，分別檢測MDA含量和SOD、CAT酶活性，蛋白濃度采用BCA 法檢測。

1.2.7Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞操作同上。在細(xì)胞裂解液中加入4×緩沖液，100 ℃沸水煮15 min，制備好的蛋白樣品-80 ℃?zhèn)溆?。按每?0 μg上樣，以5%濃縮膠、12%分離膠的SDS-PAGE分離蛋白，濕法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上后，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、caspase-3(1 ∶2 000)、β-actin (1 ∶4 000)，在常溫下?lián)u床孵育1 h后放入4 ℃冰箱過夜，洗膜，加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色，灰度值用 ImageJ 6.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞的鑒定MAP2是神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物，可作為神經(jīng)元的標(biāo)志性蛋白。本實(shí)驗(yàn)使用綠色熒光標(biāo)記的anti-MAP2抗體檢測PC12細(xì)胞的MAP2表達(dá)情況。結(jié)果PC12細(xì)胞染色呈陽性(Fig 1)，表明該P(yáng)C12細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞。

Fig 1 MAP2 protein expression in PC12 cells in vitro(×60)

2.2 鹽酸氟西汀對(duì)缺氧細(xì)胞存活率的影響與常氧對(duì)照 (Normoxia，Nor) 組相比(設(shè)定細(xì)胞存活率為100%)，缺氧模型 (Hypoxia，Hy) 組的細(xì)胞存活率活力僅為60%，低于Nor組(P<0.01)，表明細(xì)胞缺氧模型建立成功。鹽酸氟西汀 (Fluoxertine hydrochloride，F(xiàn)H) 各組均高于模型組(P<0.01)，以10-6mol·L-1最高，之后逐漸下降，說明在該濃度下細(xì)胞存活率最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在該濃度下進(jìn)行，見Fig 2。

Fig 2 Effect of fluoxetine on cell viability of PC12 cells

2.3 鹽酸氟西汀對(duì)乳酸脫酸酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的影響LDH是公認(rèn)的細(xì)胞損傷標(biāo)志物。與Nor組相比，Hy組培養(yǎng)基中LDH含量明顯升高(P<0.01)，表明缺氧導(dǎo)致PC12細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞內(nèi)的LDH外泄到細(xì)胞培養(yǎng)液中。而與Hy組比，經(jīng)鹽酸氟西汀處理后，LDH水平降低(P<0.01)，說明鹽酸氟西汀能夠維持細(xì)胞膜的完整性，減輕缺氧對(duì)PC12細(xì)胞的損傷，見Fig 3。

Fig 3 Effect of fluoxetine hydrochloride on hypoxia-induced LDH leakage in PC12

2.4 鹽酸氟西汀對(duì)氧化產(chǎn)物含量的影響活性氧(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是最主要的氧化損傷指標(biāo)。如Fig 4A所示，ROS染色后發(fā)綠色熒光，與Nor組相比，Hy組胞內(nèi)ROS含量明顯增高，而FH組的ROS表達(dá)量沒有明顯增加，低于Hy,而與Nor組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDA含量的變化與ROS相同,如圖Fig 4B。以上結(jié)果說明氟西汀可以有效緩解缺氧導(dǎo)致的胞內(nèi)氧化損傷。

Fig 4 Effect of fluoxetine hydrochloride on ROS and MDA content level in PC12 cells under

2.5 鹽酸氟西汀對(duì)抗氧化酶活性的影響與Nor組相比，Hy組的CAT活性顯著降低(P<0.01)，但FH組并沒降低，且顯著高于Hy組(P<0.01)，而與Nor組處于同一水平(Fig 5A)。SOD活性的變化與CAT相似(Fig 5B)，表明鹽酸氟西汀能夠抵御缺氧造成的氧化損傷，顯著提高抗氧化酶活性。

Fig 5 Effect of fluoxetine hydrochloride on CAT content and SOD level in PC12 cells under

2.6 鹽酸氟西汀對(duì)細(xì)胞凋亡的影響與Nor組比較，Hy組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量增加(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2和caspase-3下降。FH組與Hy組相比，促凋亡蛋白表達(dá)量下降而抗凋亡蛋白表達(dá)量上升(P<0.01),表明鹽酸氟西汀抑制缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡(Fig 6)。

Fig 6 Effect of fluoxetine on expression of apoptosis-related protein hypoxia condition

3 討論

我國雖然擁有960萬平方米的陸地面積，但高原地區(qū)面積占國土面積的26.04%。高原地區(qū)氧含量稀薄，人在急進(jìn)高原時(shí)，大腦不能適應(yīng)高原地區(qū)氧含量的急劇變化，會(huì)由于供氧不足而出現(xiàn)視覺、記憶力、思維和注意力不同程度下降的癥狀，即發(fā)生所謂高原反應(yīng)[4]。研究預(yù)防和治療高原反應(yīng)對(duì)于在高原地區(qū)開展國防和經(jīng)濟(jì)建設(shè)具有重大意義。目前市場上可供選擇的的抗高原缺氧藥物非常匱乏，美國FDA唯一批準(zhǔn)的乙酰唑胺副作用較多，而中藥紅景天資源有限。因此，尋找新的療效好、副作用少的抗高原缺氧藥物是當(dāng)務(wù)之急。

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞，與神經(jīng)元細(xì)胞具有相近的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能[5-6]，是體外實(shí)驗(yàn)中模擬神經(jīng)元功能的重要細(xì)胞株，我們利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立成熟穩(wěn)定的PC12缺氧損傷模型[7-8]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧時(shí)PC12細(xì)胞內(nèi)的LDH、ROS和MDA含量都相對(duì)增加，其中LDH的增加表明細(xì)胞在缺氧環(huán)境中受到損傷，ROS和MDA的增加表明缺氧后胞內(nèi)發(fā)生氧化性損傷，抗氧化酶SOD和CAT活性的降低表明細(xì)胞抵抗氧化損傷的能力下降。氟西汀能夠抑制LDH、ROS和MDA的增加，提高SOD和CAT活性，表明其緩解了缺氧對(duì)PC12細(xì)胞造成的氧化性損傷。低氧導(dǎo)致PC12細(xì)胞中cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)升高，Bcl-2的表達(dá)降低。氟西汀治療可抑制這種變化趨勢，減少細(xì)胞凋亡，改善PC12細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的生存狀態(tài)。

雖然氟西汀是臨床常用的抗抑郁藥，但近年來的許多實(shí)驗(yàn)研究證明，其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。氟西汀對(duì)于皮質(zhì)酮造成的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能是通過提高FoxO3a、Akt和CREB表達(dá)及其磷酸化水平[9]。氟西汀對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制是上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞活化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)受損神經(jīng)元組織的修復(fù)[10]。氟西汀具有抗炎作用，其作用機(jī)制可能是激活迷走神經(jīng)抗炎途徑，從而減輕周圍神經(jīng)組織和大腦中的炎癥反應(yīng)。氟西汀和西酞普蘭的抗炎作用歸因于5-羥色胺依賴性和5-羥色胺非依懶性。本課題組在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧損傷后細(xì)胞內(nèi)的5-羥色胺含量較常氧對(duì)照組升高，而給予鹽酸氟西汀后，5-羥色胺含量下降。說明氟西汀極有可能通過影響胞內(nèi)5-羥色胺的含量來發(fā)揮其抗缺氧損傷活性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)氟西汀對(duì)體外培養(yǎng)缺氧細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與氟西汀對(duì)胞內(nèi)5-羥色胺含量的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示氟西汀除作為抗抑郁藥外，還具有開發(fā)為抗缺氧損傷新藥的潛力，這也為抗高原缺氧藥物的研發(fā)提供了一條新思路。