超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶處理對雞胸肉嫩度的影響

潘治利，李航天，雷萌萌，艾志錄，吳陽陽，黃忠民,

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.農(nóng)業(yè)部大宗糧食加工重點實驗室，河南鄭州 450002；3.河南省冷鏈?zhǔn)称饭こ碳夹g(shù)研究中心，河南鄭州 450002）

我國的雞肉消費及生產(chǎn)居世界前列，每年都有2億多只蛋雞被淘汰作為食用[1]。淘汰蛋雞肉具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇等特點，并且雞肉中蛋白質(zhì)的含量比例較高、氨基酸種類多、消化率高，很容易被人體吸收利用，有增強體力、強身健體的作用[2]。但是，淘汰蛋雞的雞胸相較雞腿等部位，由于其纖維密度較大，從而導(dǎo)致其肉質(zhì)老、嫩度差，在很大程度上限制了雞肉的銷量，制約了了雞肉產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。因此，如何提高雞胸肉的加工品質(zhì)特性，改善其食用特性一直是禽類產(chǎn)業(yè)關(guān)注的問題。

嫩度是評價肉的品質(zhì)中最重要的指標(biāo)之一，它在很大程度上影響了消費者對其的接受程度和購買度。肉品的嫩度受很多方面的因素影響，其中肉品中結(jié)締組織的分布及性質(zhì)與肌肉蛋白質(zhì)分子之間的相互作用力、肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)是影響肌肉嫩度的主要因素[3]。目前國內(nèi)外運用于肉制品嫩化的方式主要分為三類：運用電刺激、超高壓[4]、滾揉、超聲波[5]等方法引起肉制品產(chǎn)生一些物理效應(yīng)而達(dá)到嫩化效果的物理嫩化法；通過添加鈉鹽、磷酸鹽、鈣鹽等改變?nèi)庵破穬?nèi)部鹽離子的濃度及分布達(dá)到嫩化效果的化學(xué)嫩化法；以及通過添加木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、豬胰酶等的外源酶及蛋白酶激活劑從而達(dá)到嫩化效果的生物嫩化法。

外源酶作為一種方法簡單高效[6]且無毒無害的嫩化方法，被廣泛的應(yīng)用于肉制品加工之中。其中從木瓜乳膠中提取出來的木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶，具有較高的穩(wěn)定性，對動植物中的蛋白質(zhì)、多肽類、酯類、酰胺類物質(zhì)等都有著較好的水解能力[7?8]，且能有效的破壞肉的肌纖維蛋白和結(jié)締組織[9]，是最常用的植物蛋白酶之一。李培紅等[10]通過正交實驗研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶對豬脯肉的嫩化效果要優(yōu)于復(fù)合磷酸鹽的嫩化效果。周珠法[11]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了木瓜蛋白酶嫩化牛肉的工藝，確定最佳牛肉嫩化條件為：酶濃度0.07%，pH6.9，處理溫度60 ℃,處理時間1.8 h。趙立等[12]以剪切力為評價指標(biāo)，采用單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化實驗對木瓜蛋白酶嫩化鴨肉的工藝進(jìn)行了優(yōu)化得出了鴨肉在使用木瓜蛋白酶嫩化時的最佳嫩化工藝條件。陶瑞[13]等發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶使用量過大會導(dǎo)致肉的外觀和組織嚴(yán)重破壞，失水過多，肉塊變硬，風(fēng)味異常。

超聲波是一種頻率高于20 kHz的機械波[14]，有著穿透力強、實用性好的優(yōu)點，在鮮肉及鮮肉制品加工中受到了極大的關(guān)注。超聲波所產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”可以在不破壞肉制品的質(zhì)量的情況下，通過肌肉組織內(nèi)部的強烈反應(yīng)改變?nèi)庵破返睦砘再|(zhì)和加工性能[15]，從而可以達(dá)到一定的嫩化效果。Dickens等[16]，通過使用頻率為40 kHz，功率為2400 W的超聲波對雞胸肉進(jìn)行了15 min處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲波處理后的雞胸肉的剪切力顯著降低（P<0.05)。Xiong等[17]研究了發(fā)現(xiàn)超聲波聯(lián)合碳酸氫鈉輔助腌制和碳酸氫鈉輔助腌制處理對肉質(zhì)嫩度、持水性和腌制效率的改善作用均大于傳統(tǒng)濕式腌制，且超聲波聯(lián)合碳酸氫鈉輔助腌制效果最佳。而在牦牛肉[18]、鴨肉[19]、羊肉[20]、牛肉[21]等肉制品中，都存在超聲波輔助嫩化的研究。

目前，采用單一方法處理來提高肉類嫩度的研究比較多，且都產(chǎn)生了較好的效果，但是針對雞胸肉采用多方法復(fù)合處理對嫩度影響的研究較少。本文以雞胸肉為原料，通過超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶處理雞胸肉，采用響應(yīng)面的方法進(jìn)行分析，以剪切力為響應(yīng)值，研究超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶處理對雞胸肉剪切力的影響，優(yōu)化其工藝參數(shù)，為超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶處理嫩化雞胸肉技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

去皮淘汰蛋雞雞胸肉 購于鄭州雙匯食品有限公司；木瓜蛋白酶（100000 U/g） 南寧龐博生物工程有限公司。

TA-XT2i物性分析儀 英國SMS公司；J3000型電子天平 常州市雙杰測試儀器廠；HVC-410F/2A-G型單室真空包裝機 浙江華聯(lián)機械集團有限公司；SCIENTZ-IIDM型微波光波超聲波萃取儀寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料與處理 將雞胸肉從?40 ℃冰箱里取出至4 ℃冰箱解凍24 h后，剔除可見脂肪和結(jié)締組織后洗去血污，然后將清洗干凈的雞胸肉切成5 cm×3 cm×3 cm大小、形狀均勻的肉塊（50±3） g。

配制pH7.0的磷酸鹽緩沖液，將木瓜蛋白酶分別稀釋成不同的濃度，放于4 ℃冰箱中冷藏備用。酶的活力采用酪蛋白為底物的紫外分光光度法進(jìn)行測定[22]。

1.2.2 嫩化處理 將切好的均勻肉塊中分別用注射器在不同位置均勻注射不同濃度的木瓜蛋白酶溶液，使蛋白酶溶液均勻分布于肉塊之中，然后將含有相同濃度木瓜蛋白酶的肉塊放在一起進(jìn)行真空封口，分別置于超聲儀器中進(jìn)行后續(xù)嫩化處理。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同功率超聲波處理雞胸肉 固定木瓜蛋白酶濃度為200 U/g，超聲波時間為30 min，（工作3 s，間歇3 s），超聲頻率為20 kHz，超聲溫度為30 ℃，分別采用功率為0、200、400、600、800、1000 W的超聲波對雞胸肉進(jìn)行嫩化處理。

1.2.3.2 不同濃度木瓜蛋白酶處理雞胸肉 固定超聲功率為400 W，超聲頻率為20 kHz，超聲時間為30 min（工作3 s，間歇3 s），超聲溫度為30 ℃，分別采用濃度為0 U/g（等量蒸餾水注射），100、150、200、250和300 U/g的木瓜蛋白酶溶液對雞胸肉進(jìn)行嫩化處理。

1.2.3.3 不同超聲時間處理雞胸肉 固定木瓜蛋白酶濃度為200 U/g，超聲波功率為400 W，超聲頻率為20 kHz，超聲溫度為30 ℃，分別對雞胸肉進(jìn)行時間為0 min（只使用200 U/g的木瓜蛋白酶處理），10、20、30、40和50 min的超聲波嫩化處理。

1.2.3.4 不同超聲溫度處理雞胸肉 固定木瓜蛋白酶濃度為200 U/g，超聲波功率為400 W，超聲時間為30 min，超聲頻率為20 kHz，分別采用溫度為20、30、40、50、60 ℃的超聲波對雞胸肉進(jìn)行嫩化處理。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 運用 Box-Behnken中心試驗設(shè)計原理，篩選木瓜蛋白酶用量、超聲波功率和超聲時間三個變量作為主要因素，以剪切力作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計試驗，響應(yīng)面因素設(shè)計如表1。

1.2.5 剪切力測定 將嫩化后的肉樣置于80 ℃水浴鍋中水浴加熱，待肉的中心溫度達(dá)到75 ℃時繼續(xù)水浴30 min后，取出肉樣待冷卻至25 ℃后，用濾紙擦干肉樣表面水分，將樣品沿肌纖維方向切割成長×寬×高=2 cm×1 cm×1 cm的長方體小塊，取樣后立即置于TA-XT2i物性分析儀上進(jìn)行測定。測定條件：探頭型號為 WBS 探頭，測試前速度為2 mm/s，測試中速度為1 mm/s，測試后速度為2 mm/s，測試距離為 30 cm，初始激發(fā)力為10 g。平行測定6次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel、Word 和SPSS 24對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后采用Duncan檢驗進(jìn)行多重比較分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。利用Design-Expert 10.0.4軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計及數(shù)據(jù)分析。采用Origin 9.1進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 超聲波功率對雞胸肉嫩化效果的影響 如圖1所示，隨著超聲波功率的增加，雞胸肉的剪切力在400 W之前明顯降低，在400 W時剪切力為1551.42 g，與未經(jīng)超聲處理及經(jīng)過200 W超聲處理的雞胸肉的剪切力之間存在顯著性差異（P<0.05），同時，超聲波功率大于400 W之后剪切力略微升高，但與400 W處理效果差異不顯著（P>0.05），超聲功率1000 W時剪切力為1669.74 g，與未超聲處理之間差異顯著。這可能是因為超聲波處理效果存在一定的閾值，當(dāng)超聲功率大于閾值時，其產(chǎn)生的物理效應(yīng)所達(dá)到的效果也隨之減弱，此研究結(jié)果與付蕭逸等[23]研究結(jié)果一致。黃六容等[24]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶經(jīng)過一定功率的超聲處理一定時間后，其催化的反應(yīng)更容易進(jìn)行，但是當(dāng)超聲功率過高時，會導(dǎo)致木瓜蛋白酶活性降低甚至失活。因此，選擇超聲功率為400 W進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 超聲波功率對雞胸肉剪切力的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on the shear force of chicken breast

2.1.2 木瓜蛋白酶濃度對雞胸肉嫩化效果的影響如圖2所示，隨著木瓜蛋白酶濃度的升高，雞胸肉的剪切力隨之降低，在木瓜蛋白酶濃度為200 U/g時剪切力最低為1522.44 g，且與對照組用蒸餾水處理之間存在顯著差異。這是因為木瓜蛋白酶在超聲波的作用下能在雞胸肉內(nèi)部快速擴散，水解肌原纖維蛋白，肌肉結(jié)構(gòu)變得松散，致使雞胸肉剪切力顯著下降。周丹[25]等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理對肌纖維蛋白產(chǎn)生機械物理破壞作用，同時其空化作用使線粒體、肌質(zhì)網(wǎng)和溶酶體膜破壞，加快木瓜蛋白酶溶液的擴散和滲透,提高嫩化效果。同時本實驗在使用木瓜蛋白酶濃度大于200 U/g后隨著木瓜蛋白酶濃度的增加雞肉的剪切力略微上升，并且在使用木瓜蛋白酶的濃度大于250 U/g后雞肉出現(xiàn)過度嫩化的現(xiàn)象，肉色發(fā)黃，在一定程度上破壞了雞胸肉的感官品質(zhì)，因此選擇木瓜蛋白酶濃度為200 U/g進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 木瓜蛋白酶濃度對雞胸肉剪切力的影響Fig.2 Effects of papain concentration on the shear force of chicken breast

2.1.3 超聲時間對雞胸肉嫩化效果的影響 如圖3所示，在其他條件不變的前提下，隨著超聲時間的增加雞胸肉的剪切力隨之逐漸減少，且在經(jīng)超聲處理30 min與只使用木瓜蛋白酶處理相比剪切力變化顯著，說明在一定處理時間內(nèi)，超聲波處理能夠有效的改善雞胸肉的剪切力，而在經(jīng)過超聲處理30 min之后剪切力隨時間減少趨勢的降低，且差異不顯著，并且隨著在30 min之后隨著超聲波處理的時間增加，整個反應(yīng)體系的溫度會稍微上升。因此在超聲處理50 min時剪切力雖然達(dá)到最小值1543.26 g，但是與超聲處理30 min時剪切力1522.44 g之間差異不顯著（P>0.05）。而在日常生產(chǎn)中要盡量減少產(chǎn)品損耗及提高效率，因此選擇超聲處理30 min來進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 超聲處理時間對雞胸肉剪切力的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on the shear force of chicken breast

2.1.4 超聲溫度對雞胸肉嫩化效果的影響 如圖4所示，隨著超聲處理溫度的升高，剪切力逐漸降低，在50 ℃時剪切力最低1600.38 g，但是由于超聲波所產(chǎn)生的機械波在震蕩過程中會產(chǎn)生一些能量，由超聲波產(chǎn)生的熱能會使得整個反應(yīng)體系的溫度升高，從而使得真正的反應(yīng)溫度并不是儀器所設(shè)定的溫度，且30～50 ℃雞胸肉剪切力值之間差異并不顯著（P>0.05)。白鴿[26]等通過實驗發(fā)現(xiàn)隨著超聲溫度的增大，木瓜蛋白酶的相對酶活呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,并在40 ℃處達(dá)到最大值,相對酶活為166.56%。并且溫度過高的話可能會導(dǎo)致酶的活性降低甚至失活，因此選用溫度更容易控制的40 ℃進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 超聲處理溫度對雞胸肉剪切力的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment temperature on the shear force of chicken breast

通過上述實驗結(jié)果可以看出，超聲波產(chǎn)生的機械波所引發(fā)的空化效應(yīng)能夠改變雞胸肉的一些理化性質(zhì)，在一定程度上改善酶的活性，從而使肉樣嫩化。這與Barekat等[27]采用高強度超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶對牛肉進(jìn)行嫩化，研究結(jié)果一致。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶能很好的降低雞胸肉的剪切力，從而達(dá)到一定的嫩化效果。但是由于超聲處理溫度不宜過高，通過單因素實驗確定超聲處理的溫度為40 ℃。進(jìn)而采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計試驗，以雞胸肉的剪切力響應(yīng)值，考察木瓜蛋白酶濃度（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）對雞胸肉嫩度的影響，優(yōu)化試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Level design and test results of response surface test factors

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 采用Desgin-Expert 10.0.4程序?qū)嶒灁?shù)據(jù)采用最小二乘法進(jìn)行二次多項式回歸擬合，得到在超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶處理嫩化雞胸肉工藝中剪切力（Y）與木瓜蛋白酶濃度（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）三個因素之間的二元回歸方程為：剪切力（Y）=1465.13?62.73A+15.30B?46.66C?40.80AB+46.41AC+33.66BC+121.18A2+61.00B2+154.33C2。由表3可以看出，回歸模型的P<0.0001，說明該預(yù)測模型極顯著。失擬項的P>0.05差異不顯著，說明實驗誤差較小。該模型的擬合系數(shù)R2=0.9880，矯正擬合系數(shù)R2Adj=0.9725，說明在實驗設(shè)計的范圍內(nèi)，該模型能較好地表達(dá)雞胸肉剪切力值與木瓜蛋白酶濃度（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）三個因素之間的關(guān)系。對于各個因素對剪切力的影響中，木瓜蛋白酶濃度（A）和超聲波功率（C）對模型的影響極顯著（P<0.01），超聲波時間（B）對模型的影響不顯著（P>0.05），且由F值可以看出各因素的影響大小為：木瓜蛋白酶濃度（A）>超聲功率（C）> 超聲時間（B）。交互項中AB（木瓜蛋白酶濃度和超聲時間）項、AC（木瓜蛋白酶濃度和超聲波功率）項影響極顯著（P<0.01），BC（超聲波時間和超聲功率）項影響顯著（P<0.05），平方項A2、B2、C2影響極顯著（P<0.01）。各交互項之間的影響大小為：AC>AB>BC，二次項影響大小為C2>A2>B2。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance

2.2.3 響應(yīng)面中各因素間交互作用分析 超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶處理嫩化雞胸肉各因素之間的交互作用的響應(yīng)面曲線如圖5～圖7所示，可以看出AB，AC，BC兩因素交互作用的響應(yīng)曲面均呈明顯的凹陷狀態(tài)。并且可以看出當(dāng)兩個因素不變時，另外一個因素可以明顯的使剪切力值先降低后上升，說明三個因素對雞胸肉剪切力的影響顯著；從凹陷程度可以看出AC交互項的凹陷程度大于AB交互項的凹陷程度大于BC交互項的凹陷程度，即交互作用AC>AB>BC，此結(jié)果與從表3得出的結(jié)果一致。

圖5 木瓜蛋白酶濃度和超聲時間對雞胸肉剪切力影響的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface of papain concentration and ultrasonic time on the shear force of chicken breast

圖6 木瓜蛋白酶濃度和超聲功率對雞胸肉剪切力影響的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface of papain concentration and ultrasonic power on chicken breast shear

圖7 超聲時間和超聲功率對雞胸肉剪切力影響的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface of ultrasonic time and ultrasonic power on the shear force of chicken breast

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定及驗證 通過Desgin-Expert 10.0.4軟件分析，可得到最優(yōu)的工藝參數(shù)為：木瓜蛋白酶濃度211 U/g，超聲時間29 min，超聲功率425 W此時剪切力的預(yù)測值為1454.52 g。為了操作方便可行，將工藝條件優(yōu)化為：木瓜蛋白酶濃度200 U/g，超聲時間30 min，超聲功率425 W，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗證實驗剪切力為1537.14 g。與預(yù)測值相接近，且與未經(jīng)過嫩化的雞胸肉（剪切力為2625.48 g）相比剪切力降低了41.45%，與僅用木瓜蛋白酶嫩化的雞胸肉（剪切力為1982.88 g）相比剪切力降低了22.48%，與僅用超聲波處理嫩化的雞胸肉（剪切力為1898.22 g）相比剪切力降低了19.02%，證明該優(yōu)化結(jié)果有效可用。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗和響應(yīng)面法對超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶嫩化雞胸肉的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶嫩化雞胸肉工藝的最佳工藝參數(shù)為：木瓜蛋白酶濃度200 U/g，超聲時間30 min，超聲功率425 W，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行驗證實驗剪切力為1537.14 g，與模型所預(yù)測值相近。優(yōu)化結(jié)果與未經(jīng)處理的雞胸肉剪切力相比降低了41.45%，與單獨使用木瓜蛋白酶和超聲波處理的雞胸肉剪切力分別降低了22.48%和19.02%，說明該優(yōu)化結(jié)果有效。超聲波聯(lián)合木瓜蛋白酶可以高效安全的成為嫩化雞胸肉的一種方法。