SMARCAD1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

錢 歡，姚一舟，朱新國(guó)

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）

胃癌是一種全球性的重要疾病。據(jù)估計(jì)，胃癌每年新增病例超過100萬 例，是全球第五大被診斷為惡性腫瘤的疾病。由于胃癌的診斷往往處于晚期，其死亡率很高，成為癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。

由于胃癌早期很少引起癥狀，胃癌的早期診斷主要依靠?jī)?nèi)鏡及病理結(jié)果，缺乏無創(chuàng)又有效的早篩手段，大多數(shù)病例確診時(shí)已為進(jìn)展期或晚期，這些因素導(dǎo)致了胃癌的不良預(yù)后，主要治療手段仍然是以手術(shù)治療為主，大多數(shù)國(guó)家的5 年生存率在20%～40%[2-3]。胃癌依然是一個(gè)巨大的臨床挑戰(zhàn)。

近年來，遺傳生物標(biāo)記物開始在腫瘤的診斷與預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮越來越重要的作用。因此，有必要研究新的生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)胃癌的預(yù)后，以幫助改善胃癌的預(yù)后和治療。

人類DNA每天都會(huì)暴露在各種有害的、破壞性的事件中，這些都會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，可能會(huì)導(dǎo)致有害的遺傳事件。人類細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出一種稱為DNA損傷反應(yīng)的機(jī)制，它檢測(cè)、發(fā)出信號(hào)并修復(fù)雙鏈損傷引起的DNA損傷，以防止基因組損傷和隨之而來的疾病。受損的DNA在染色質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中通過幾種機(jī)制修復(fù)，如DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾和ATP依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物對(duì)核小體的重塑[4]。

所有染色質(zhì)重塑復(fù)合體都含有SWI2（Switch 2）/SNF2（Sucrose Non-Fermenting 2）超家族的ATP酶/解旋酶，它通過ATP的水解為染色質(zhì)重塑提供能量[5]。

SWI/SNF最先在酵母中被描述，因?yàn)樗赟WI和SNF中起關(guān)鍵作用。它是一個(gè)由超過15 個(gè)亞基組成的大型復(fù)合體，包括SMARCA2、SMARCA4、SMARCAB1、SMARCAD1等，它們是哺乳動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控所必需的。SWI/SNF亞基與人類疾病密切相關(guān)，特別是與癌癥。已發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮?0%的人類腫瘤中發(fā)生突變，其中，SWI/SNF復(fù)合體的兩個(gè)ATP酶SMARCA2和SMARCA4常與胰腺癌等惡性腫瘤相關(guān)。最近的研究表明，SMARCA2（BRM）在體內(nèi)外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但抑制其對(duì)化療的敏感性[6]。

SMARCAD1基因位于染色體4q22.3上，屬于染色質(zhì)重構(gòu)體INO80家族[7]。在惡性腫瘤中，SMARCAD1過表達(dá)與多種癌癥有關(guān)，包括皮膚癌、膀胱癌、乳腺癌和胰腺癌，而在胃癌中則缺少有研究。

在本研究中，我們通過分析GEO數(shù)據(jù)庫探討SMARCAD1表達(dá)與胃癌臨床病理特征和患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 在這個(gè)研究中，我們從基因表達(dá)總覽數(shù)據(jù)庫（GEO）收集了433 例胃癌的測(cè)序數(shù)據(jù)及臨床信息。臨床信息包括性別、年齡、T分期、N分期、生存狀態(tài)、生存時(shí)間（術(shù)后隨訪至2020年4月或死亡）。這些數(shù)據(jù)來自GSE84433和GSE84426數(shù)據(jù)集。獲取數(shù)據(jù)后我們?cè)偈褂肞erl軟件和R軟件中的impute和limma軟件包，分別進(jìn)行數(shù)據(jù)的注釋和矯正。

1.2 微陣列分析 使用Affymetrix Human Genome 133 plus 2.0獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)。微陣列實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)歸一化的所有設(shè)計(jì)和質(zhì)量控制均符合Affymetrix標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議。按照胃癌患者的SMARCAD1表達(dá)值的中位數(shù)將數(shù)據(jù)分為兩組，高于中位數(shù)的，均為SMARCAD1high組，其余均為SMARCAD1low組。差異倍數(shù)（foldchange，log2）＞0.5或＜－0.5用于確定差異表達(dá)基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用R軟件3.6.2及SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)SMARCAD1表達(dá)的中位數(shù)將樣本分為兩組（SMARCAD1high，n＝215，SMARCAD1low，n＝218）。用limma軟件包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。采用t檢驗(yàn)行兩組間比較。運(yùn)用卡方檢驗(yàn)分析臨床病理參數(shù)與目的基因表達(dá)量的關(guān)系。生存分析中采用Kaplan-Meier法評(píng)估。運(yùn)用比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估與預(yù)后相關(guān)的因素。均為雙側(cè)檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平P＜0.05。

1.4 富集分析 GO富集分析通過從生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能三個(gè)方面來研究SMARCAD1及其差異基因的生物學(xué)特性。采用KEGG富集分析方法對(duì)SMARCAD1和差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，尋找可能的生物學(xué)途徑。并分別繪制氣泡圖。上述富集分析在R語言軟件下完成，q值（q為校正P值）＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿中SMARCAD1表達(dá)與胃癌臨床因素的關(guān)系 共有433 例原發(fā)性胃癌患者的臨床病理特征納入了本次研究。我們將所有的患者分為高表達(dá)組（n＝215）和低表達(dá)組（n＝218）。如表1所示，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者SMARCAD1表達(dá)較高，淋巴結(jié)陽性的患者往往其SMARCAD1表達(dá)較低，提示SMARCAD1的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）。而SMARCAD1的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展也呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)展期（T3-4）患者較早期（T1-2）患者血漿中SMARCAD1的表達(dá)量低（P＜0.05）。而其他病理因素如年齡、性別與SMARCAD1的表達(dá)未見明顯相關(guān)。將SMARCAD1表達(dá)量與N分期、T分期進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖1A、B所示，隨著N、T分期的增加，SMARCAD1的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。

表1 SMARCAD1表達(dá)與433 例胃癌患者臨床特征的關(guān)系（例）

圖1 SMARCAD1在胃癌不同分期中的表達(dá)。X軸表示分期階段，Y軸表示SMARCAD1表達(dá)式值（Log2）。A：隨著N分期的增加，SMARCAD1的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，其中N0最為顯著。B：SMARCAD1的表達(dá)水平隨著T分期增加而下降，T1至T3期較為顯著。

2.2 胃癌患者血漿SMARCAD1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性分析 Kaplan-Meier分析結(jié)果表明SMARCAD1高表達(dá)的患者的總生存期比SMARCAD1低表達(dá)的患者更長(zhǎng)（P＜0.001）（圖2）。該結(jié)果提示其SMARCAD1有可能可以作為預(yù)測(cè)疾病生存的生物學(xué)指標(biāo)。單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)胃癌患者總生存的危險(xiǎn)因子包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期、N分期和年齡（圖3A）。多因素回歸分析結(jié)果提示血漿中存在SMARCAD1是胃癌總體生存的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)保護(hù)指標(biāo)（P＜0.001）（圖3B）。

圖2 根據(jù)SMARCAD1表達(dá)水平分組，Kaplan-Meier分析433 例胃癌患者的總生存期

圖3 單因素（A）和多因素（B）Cox回歸分析胃癌患者預(yù)后因素

2.3 胃癌患者的差異基因 根據(jù)SMARCAD1表達(dá)的中位數(shù)將樣本分為兩組，以|Foldchange|＞0.5且P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異基因，用R軟件繪制火山圖（圖4A）。通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)集（GSE84433）中差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有81 個(gè)差異基因，其中有22 個(gè)基因在胃癌患者血漿中存在高表達(dá)，而下調(diào)的基因有59 個(gè)。選取其中差異最顯著的40 個(gè)基因利用R軟件繪制熱圖（圖4B）。

圖4 差異表達(dá)基因（Deg）及GO富集和KEGG途徑分析結(jié)果。A：SMARCAD1high和SMARCAD1low之間DEGS表達(dá)的火山圖。Degs顯著性的截?cái)嘀禈?biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，log2倍數(shù)絕對(duì)值變化＞0.5。Y軸顯示每個(gè)基因的－log10P值，而X軸顯示該基因相對(duì)于FCER1G表達(dá)的log2倍變化。綠點(diǎn)代表81 個(gè)下調(diào)的基因，紅色圓圈代表22 個(gè)上調(diào)的基因，黑點(diǎn)代表不顯著的基因。B：熱圖顯示了20 個(gè)上調(diào)基因和20 個(gè)下調(diào)基因。紅色代表高表達(dá)，白色代表中間表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)。C、D：KEGG和GO結(jié)果顯示差異表達(dá)基因。X軸代表基因比率，Y軸代表不同的富集途徑。

2.4 富集分析 通過對(duì)SMARCAD1及其40 個(gè)差異基因進(jìn)行富集分析，在GO的生物學(xué)過程中，大部分差異基因富集于白細(xì)胞的趨化遷移、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞-底物黏附的正向調(diào)節(jié)（圖4D）。通過KEGG分析，黏著斑、PI3K-Akt信號(hào)通路和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用是最豐富的途徑（圖4C）。

3 討論

我們分析了SMARCAD1與胃癌臨床病理參數(shù)是否存在關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)患者的性別、年齡與SMARCAD1的表達(dá)無關(guān)。其異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分期有關(guān)。并根據(jù)臨床相關(guān)性分析我們發(fā)現(xiàn)，如患者存在SMARCAD1表達(dá)下調(diào)，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性可能性增大，并提示疾病已處于進(jìn)展期。這些結(jié)果提示其可能與胃癌演進(jìn)存在關(guān)系，隨著腫瘤進(jìn)展，其表達(dá)水平愈低。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，胃癌患者血漿中SMARCAD1低表達(dá)預(yù)示著總生存時(shí)間明顯縮短。Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)SMARCAD1可作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的臨床獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。通過GO及KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)SMARCAD1及其差異基因作用于細(xì)胞黏附作用、PI3K-Akt信號(hào)通路和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用。

黏著斑指的是細(xì)胞外基質(zhì)與一個(gè)細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的物理聯(lián)系，通過黏著斑激酶觸發(fā)活性進(jìn)而發(fā)揮作用，調(diào)控細(xì)胞黏附信號(hào)。黏著斑激酶是腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞信號(hào)的多功能調(diào)節(jié)因子。在各種腫瘤的發(fā)育過程中，黏著斑激酶通過激酶依賴和非激酶依賴的機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、存活和增殖[8]。實(shí)驗(yàn)表明黏著斑激酶mRNA水平在漿液性卵巢腫瘤和浸潤(rùn)性乳腺癌中升高，并且這些升高的mRNA水平與患者總體生存率較差有關(guān)，在胃癌中仍少有研究。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的信號(hào)通路之一，它調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞代謝和細(xì)胞骨架的重組。到目前為止，在人類癌癥中發(fā)現(xiàn)的兩種最廣泛的PI3K-Akt激活機(jī)制是由受體酪氨酸激酶（RTK）和信號(hào)通路特定元件的體細(xì)胞突變觸發(fā)的。該通路的異常刺激與腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和生存有關(guān)[9]。PI3K通路的修飾與大多數(shù)癌癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。因此，以這一途徑的效應(yīng)器為靶點(diǎn)是一種很有前途的治療方法。

細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用通路是基因豐富的信號(hào)通路中表達(dá)上調(diào)最多的通路。它們?cè)谀[瘤脫落、黏附、降解、運(yùn)動(dòng)和增殖過程中起重要作用[10]。細(xì)胞外基質(zhì)在其他癌癥中的作用已經(jīng)被證明。細(xì)胞外基質(zhì)在前列腺癌組織中上調(diào)，并參與胃癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程。大腸癌中的細(xì)胞外基質(zhì)可以促進(jìn)癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)展。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最致命的成人腦瘤。表現(xiàn)為異常新生血管和腫瘤細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)的病理特征。細(xì)胞外基質(zhì)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤微環(huán)境之間的相互作用在這一進(jìn)展中非常重要[11-12]。

本研究中仍存在一些不足：(1)納入樣本量相對(duì)較小，可能致使統(tǒng)計(jì)學(xué)效能較?。?2)本研究未對(duì)SMARCAD1在胃癌中具體機(jī)制進(jìn)行研究；(3)未能進(jìn)行系統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，在胃癌中，SMARCAD1表達(dá)量的降低可能暗示著疾病的進(jìn)展及不良預(yù)后，并主要在細(xì)胞黏附、PI3K-Akt信號(hào)通路和細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用上發(fā)揮作用。SMARCAD1可作為輔助診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)記物，未來可考慮進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探討SMARCAD1在胃癌發(fā)病機(jī)制中的作用。