高良姜素?PLGA納米粒的處方優(yōu)化及其表征

陳瑩子，朱 蓉，孫旭怡，吳鑫福，張 鈺，羊玉英，魏 娜，秦貞苗

（1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口571199；2.長沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 長沙410219）

高良姜素（galangin，GL）是從姜科植物高良姜（AlpiniaofficinarumHance）干燥根莖中提取分離得到的黃酮類化合物（3，5，7-三羥基黃酮）［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，高良姜素具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、抗胃腸道出血、抗?jié)兒臀葛つけＷo(hù)等生物學(xué)活性［2］。但由于高良姜素難溶于水、膜透過性差、在體內(nèi)容易消除、生物利用度低等缺點(diǎn)［3，4］，嚴(yán)重限制了其臨床發(fā)展。納米粒是一種新型載藥體系，具有提高藥物穩(wěn)定性、增加藥物對(duì)生物膜的透過性、提高藥物生物利用度等優(yōu)點(diǎn)［5，6］，杜先華等［7］發(fā)現(xiàn)通過微乳載藥體系可以提高良附中高良姜素的吸收，提高其生物利用度。本實(shí)驗(yàn)以生物可降解材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為載體材料，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化高良姜素-PLGA納米粒（GLPLGA NPs）的處方，并從表觀形態(tài)、粒徑分布和ze?ta電位等方面進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

UltiMate 3000型高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；JY 92?IIDN型超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Delsa Na?no C型納米粒度/ζ電位分析儀（美國Beckman Coulter公司）；KUBOTA 5922型冷凍離心機(jī)（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）；JB?3A型定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海雷磁新涇儀器有限公司）；AX224ZH型電子天平［奧豪斯（常州）儀器有限公司］；XW?80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

高良姜素原料藥（德斯特生物公司，純度≥90%）；高良姜素對(duì)照品（成都麥德生科技有限公司，純度≥98%）；PLGA（MW=18 000，LA/GA=75/25，濟(jì)南岱罡生物技術(shù)有限公司）；聚乙烯醇（PVA，0588低黏度型，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；2?羥基?β?環(huán)糊精（2?HP?β?CD，阿拉丁試劑（上海）有限公司）；透析袋（MW7000，美國Viskase公司）；甲醇為色譜純（美國BCR公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 GL?PLGA NPs制備

采用改良乳化?溶劑揮發(fā)法［8］制備GL?PLGA?NPs。取處方量高良姜素和PLGA溶解于丙酮?乙醇（4∶1）混合溶液中，形成有機(jī)相，另配制PVA?2?HP?β?CD混合溶液為水相，冰浴下間斷超聲10 min（功率60%，工作3 s，間隔3 s），形成初乳，繼續(xù)磁力攪拌7～8 h，揮去有機(jī)溶劑，離心（5 000 r/min，10 min）后取上清液即為GL?PLGA?NPs溶液。同法制得不含高良姜素得空白PLGA納米粒溶液。

1.3 GL?PLGA NPs中高良姜素含量測定方法建立

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：甲醇?0.2%磷酸（65∶35）；檢測波長：266 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.2 溶液配制 對(duì)照品溶液：精密稱取高良姜素對(duì)照品10 mg置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為400μg/mL的對(duì)照品溶液；供試品溶液：精密量取GL?PLGA NPs溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；空白溶液：取適量空白PLGA納米粒溶液，同“供試品溶液”法制備空白溶液。

1.3.3 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，可見高良姜素與基質(zhì)成分分離情況良好，處方中的輔料對(duì)樣品測定無干擾。見圖1。

圖1 高良姜素色譜圖Fig 1 HPLC chromatogr ams of galangin

1.3.4 線性范圍考察 精密量取高良姜素對(duì)照品溶液適量，分別配制成濃度為20、40、60、80和100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液20μL注入液相色譜儀，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定。以高良姜素濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=1.6288C?0.326 1，r=0.999 7。結(jié)果表明高良姜素濃度在20～100μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

1.3.5 儀器精密度試驗(yàn) 取“1.3.4”項(xiàng)下40μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 差（relative standard deviation，RSD）值 為0.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

1.3.6 回收率試驗(yàn) 分別精密量取“1.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.4、0.5、0.6 mL各3份置于10 mL容量瓶中，加入空白PLGA納米粒溶液0.5 mL，制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，測得平均回收率為97.89%，平均RSD值為0.90%（n=9）。見表1。

圖2 高良姜素對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Calibr ation curve of galangin r eference solution

表1 回收率試驗(yàn)測定結(jié)果（n=9）Tab 1 Results of recovery tests（n=9）

1.4 納米粒的表征

1.4.1 GL?PLGA NPs粒徑測定 取適量GL?PLGA NPs溶液用去離子水稀釋10倍，用激光粒度測定儀測定GL?PLGA NPs稀釋液的平均粒徑和分布。

1.4.2 GL?PLGA NPs包封率測定 采用透析法［8］測定GL?PLGA NPs的包封率。精密量取GL?PLGA NPs溶液2 mL置于透析袋中，兩端扎緊，放入盛有40%乙醇溶液的錐形瓶中，37℃振搖24 h（1 000 r/min），吸取適量透析介質(zhì)過濾進(jìn)樣，計(jì)算游離藥物量M游離，再按“1.3.2”項(xiàng)下制備供試品溶液過濾進(jìn)樣，測定GL?PLGA NPs中總含藥量M總，按公式包封率=［（M總－M游離）/M總］×100%計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 GL?PLGA NPs處方單因素考察

2.1.1 乳化劑PVA質(zhì)量濃度的考察 固定有機(jī)相為5 mL丙酮?乙醇（4∶1）的混合溶液，PLGA濃度為1%（W/V），藥物濃度為0.1%（W/V），有機(jī)相和水相的比例為1∶8，考察水相中PVA質(zhì)量濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對(duì)納米粒粒徑和多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）的影響。PVA濃度對(duì)納米粒的粒徑和PDI影響較大，隨著PVA濃度增大，納米粒粒徑先減小后增大。見圖3。

圖3 PVA濃度對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響（n=3）Fig 3 Effect of differ ent concentr ationsof PVA onnanoparticlesizeand entrapment efficiency（n=3）

2.1.2 有機(jī)相和水相體積比的考察 固定有機(jī)相為5 mL丙酮?乙醇（4∶1）的混合溶液，水相為40 mL 1%PVA+1.5%2?HP?β?CD的混合溶液，PLGA濃度為1%（W/V），藥物濃度為0.1%（W/V），考察有機(jī)相和水相的體積比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響。當(dāng)固定有機(jī)相體積不變，增加水相體積時(shí)，納米粒粒徑先減小后增大，包封率先增大后減小，結(jié)果與乳化劑的影響相似，但總體影響變化不大。當(dāng)有機(jī)相和水相的體積比為1∶8時(shí)，納米粒粒徑最小，包封率最高。見圖4。

圖4 有機(jī)相和水相體積比對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響（n=3）Fig 4 Effect of different organic phase/aqueous phase vol?ume r atio on nanopar ticle size and entrapment effi?ciency（n=3）

2.1.3 PLGA質(zhì)量濃度的考察 固定有機(jī)相為5 mL丙酮?乙醇（4∶1）的混合溶液，水相為40 mL 1%PVA+1.5%2?HP?β?CD的混合溶液，藥物濃度為0.1%（W/V），考察PLGA質(zhì)量濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響。隨著PLGA濃度的增加，納米粒粒徑逐漸增大，包封率先增大后減小。見圖5。

圖5 PLGA濃度對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響（n=3）Fig 5 Effect of different concentrations of PLGA on nanopar ticle size and entrapment efficiency（n=3）

2.1.4 藥物質(zhì)量濃度的考察 固定有機(jī)相為5 mL丙酮?乙醇（4∶1）的混合溶液，水相為40 mL 1%PVA+1.5%2?HP?β?CD的混合溶液，PLGA濃度為1%（W/V），考察藥物質(zhì)量濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響。隨著藥物濃度的增加，納米粒粒徑未見明顯變化，而包封率逐漸減小。見圖6。

圖6 藥物濃度對(duì)納米粒粒徑和包封率的影響（n=3）Fig 6 Effect of differ ent dr ug concentr ations on nanopar?ticle size and entrapment efficiency（n=3）

2.2 GL?PLGA NPs正交試驗(yàn)的優(yōu)化

綜合單因素考察結(jié)果，選取對(duì)納米粒影響較大的3個(gè)因素：PVA濃度、PLGA濃度和藥物濃度，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以粒徑和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用綜合加權(quán)評(píng)分法［9］對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，粒徑和包封率的權(quán)重系數(shù)均為0.5，按下面公式計(jì)算綜合評(píng)分，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析。見表2～4。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表(%)Tab 2 Orthogonal factor level(%)

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析Tab 4 Analysis of variance

由直觀分析結(jié)果可知，影響GL?PLGA NPs制備的因素主次順序?yàn)锽（PLGA濃度）>A（PVA濃度）>C（藥物濃度），最優(yōu)處方為A2B2C3，即PVA濃度為1.5%，PLGA濃度為1.0%，藥物濃度為0.20%；從方差分析結(jié)果可知，PLGA濃度對(duì)納米粒的制備影響顯著，其他因素均對(duì)納米粒制備無顯著性影響。

2.3 GL?PLGA NPs優(yōu)化處方驗(yàn)證

按最優(yōu)處方制備3批GL?PLGA NPs，測得平均 粒 徑 為（256.50±1.32）nm，平 均 包 封 率 為75.3%，批間重復(fù)性好，處方工藝穩(wěn)定。

2.4 形態(tài)觀察

取優(yōu)化處方制備的GL?PLGA NPs溶液適量，置于銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸負(fù)染1 min，室溫自然晾干，于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)。制得的GL?PLGA NPs呈球形，大小較均勻，表明光滑圓整，粒子間無明顯粘連現(xiàn)象，分散性良好。見圖7。

2.5 粒徑分布和zeta電位

取優(yōu)化處方制備的GL?PLGA NPs溶液適量，于激光粒度測定儀測定其粒徑分布和zeta電位，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。見圖8、9。圖中納米粒粒徑呈正態(tài)分布，峰形較窄，平均粒徑為（249.00±2.44）nm，PDI為0.059；zeta電位為?4.86 mV，表明納米粒體系較穩(wěn)定，不容易發(fā)生聚集等現(xiàn)象。

圖7 GL?PLGA NPs透射電鏡圖Fig 7 Transmission electron microscopic image of GL?PLGA NPs

圖8 GL?PLGA NPs粒徑分布Fig 8 Particle size distribution of GL?PLGA NPs

圖9 GL?PLGA NPs Zeta電位Fig 9 Zeta potential of GL?PLGA NPs

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用改良的自乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒，實(shí)驗(yàn)過程中分別采用注射器和直接加入的方式滴加有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)超聲過程中使用注射器吸取有機(jī)相深入液面下靠近超聲探頭周邊將其緩慢加入，并在保證杯壁不會(huì)觸碰探頭的情況下振搖溶液，得到的納米粒粒徑適宜且分布均勻；而直接加入有機(jī)相溶液乳化不均勻且出現(xiàn)輕微的分層現(xiàn)象，這可能是因?yàn)橹苯蛹尤胗袡C(jī)相很難控制滴速，有機(jī)相無法在水相中均勻分布，從而出現(xiàn)分層［10］。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定納米粒中高良姜素的含量，《中國藥典》2015版中記載的色譜條件流動(dòng)相為甲醇?0.2%磷酸溶液（55∶45）［11］，實(shí)驗(yàn)中使用該流動(dòng)相條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)將高良姜素和雜質(zhì)峰無法完全分離，且出現(xiàn)拖尾峰，通過對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)整，當(dāng)選擇甲醇?0.2%磷酸溶液（65∶35）作為流動(dòng)相時(shí)，主要成分和雜質(zhì)峰分離較好，且無拖尾峰。實(shí)驗(yàn)曾采用低速離心法測定包封率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包封率隨著離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的增加而降低，去除的上清液中依然可見淡黃色的游離藥物，說明該方法無法將游離藥物和納米粒完全分開，故而后期采用透析法進(jìn)行測定。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)PVA濃度增大時(shí)，溶液的表面張力下降［12］，納米粒粒徑減小，而當(dāng)乳化劑濃度大于臨界膠束濃度時(shí)，體系的黏度增加，粒子間容易發(fā)生粘連［13］，使得粒徑隨之增大。而當(dāng)PLGA濃度增大后體系黏度增加，粒子間不易分散，因此得到的粒子粒徑偏大；同時(shí)，PLGA濃度增大，包裹的藥物增加，納米粒的包封率增大，但隨著PLGA的濃度繼續(xù)增大，體系乳化程度變慢，親水性藥物向水相擴(kuò)散的幾率增加［14?17］，因此包封率反而降低。雖然提高藥物濃度可以增加藥物包載到納米粒中的藥量，但若藥物過多，包裹藥物的PLGA數(shù)量相對(duì)變少，導(dǎo)致藥物包封不完全造成損失，降低了包封率［18］。

本研究初步優(yōu)化了GL?PLGA NPs的處方，成功制備了粒徑適宜、包封率較高的納米粒，對(duì)于納米粒的體外釋放性能和生物利用度還有待進(jìn)一步研究。