頭針抑制腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制初探*

張 菶，鄒 偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)后血腫、水腫與炎癥等病理反應(yīng)參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程，而神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡是ICH后神經(jīng)功能缺損的重要原因之一[1-2]。作為在動(dòng)物胚胎期決定各種前體細(xì)胞分化并參與多種組織器官生長發(fā)育的重要通路，Shh通路在成體動(dòng)物生理及病理?xiàng)l件下，在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要功能[3]?！鞍贂?huì)”透“曲鬢”針刺法作為臨床治療腦卒中的常用方法，在改善腦卒中后神經(jīng)功能缺損方面發(fā)揮著重要作用，目前已有研究發(fā)現(xiàn)針刺頭穴可抑制腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]，但該針刺法在ICH后是否可發(fā)揮相似作用以及通過何種機(jī)制達(dá)到這一效果仍待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 75只體質(zhì)量(250±20)g雄性SD大鼠，購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào):No.SCXK(Heilongjiang)2013-004]。人工飼養(yǎng)于室溫20 ℃、相對(duì)濕度50%和光照12 h(7:30—19:30)的環(huán)境，每日適量進(jìn)水進(jìn)食，造模前12 h禁水禁食。本實(shí)驗(yàn)獲黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC:2019-05-13-01)，且遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與護(hù)理指南(2011年,第8版)》[5]執(zhí)行。

1.1.2 儀器 針灸針(0.3 mm×25 mm,華佗牌,中國);牙鉆(Strong90,世新,韓國);立體定位儀(68001,RWD,中國);組織包埋機(jī)(TES99,MEDITE,德國);石蠟切片機(jī)(HM355S,Thermo Fisher Scientific,美國);光學(xué)顯微鏡(BX53,Olympus,日本);病理圖像分析系統(tǒng)(Motic Med6.0,麥克奧迪,中國);低溫冷凍離心機(jī)(Fresco17,Thermo Fisher Scientific,美國);酶標(biāo)儀(MultiSkan3,Thermo Fisher Scientific,美國);電泳儀(Powerpac Universal,Bio-Rad,美國);NC膜(0.45 μm孔徑,Millipore,美國);凝膠成像分析系統(tǒng)(GelDoc XR+,ProteinSimple,美國)。

1.1.3 試劑 PBS(P1010,Solarbio Technology,中國);Smo一抗(ab113438,Abcam,美國);Gli1一抗(ab151796,Abcam,美國);Smo和Gli1二抗(S004F,TDY Biotech,中國);10×Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液(P0014C,Beyotime Biotechnology,中國);上樣緩沖液(P0015,Beyotime Biotechnology,中國);麗春紅(P0022,Beyotime Biotechnology,中國);ECL(WBKLS0500,Millipore,美國);purmorphamine(S3042,Selleck,美國);TUNEL試劑盒(1684817,Roche,德國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模方法 ICH造模采用Sinar等[6]提出的自體血注入法。大鼠10%水合氯醛以350 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，剪毛備皮，俯臥位固定于立體定位儀。手術(shù)刀以矢狀位沿正中線劃開頭皮，暴露前囟點(diǎn)，在其向右旁開3.5 mm、向后旁開0.2 mm部位用牙鉆鉆孔。同時(shí)將鼠尾尖剪斷，并用微量注射器抽取50 μL自體血后將其固定于立體定位儀上，使針尖對(duì)齊鉆孔，并使針尖在觸及腦表面后再進(jìn)針6 mm，到達(dá)尾狀核，將血以20 μL/min速度注入腦內(nèi)，避免外溢，同時(shí)包扎鼠尾傷口。出針后，牙科水泥封閉鉆孔，縫合傷口并消毒。手術(shù)全程動(dòng)物體溫保持在37 ℃。

1.2.2 成功模型篩選方法 ICH成功模型篩選及干預(yù)后神經(jīng)功能恢復(fù)評(píng)價(jià)均采用Bederson神經(jīng)功能評(píng)分[7]，該評(píng)分法將神經(jīng)功能分為：0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：懸尾實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)側(cè)前爪不完全伸展；2分：對(duì)側(cè)前爪抗推力下降；3分：水平放置后向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。神經(jīng)功能評(píng)分1～3分為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分假手術(shù)組、模型組、模型+針刺組(針刺組)、模型+激動(dòng)劑組(激動(dòng)劑組)和模型+非經(jīng)非穴組(非經(jīng)非穴組)。實(shí)驗(yàn)首日，75只大鼠中隨機(jī)挑選60只按上述方法復(fù)制ICH模型，待蘇醒后隨機(jī)平均分入除假手術(shù)組的其他4組中，每組各15只。假手術(shù)組造模時(shí)用相同劑量生理鹽水替代。

1.2.4 干預(yù)方法 假手術(shù)組和模型組:造模后不做處理。激動(dòng)劑組:腹腔注射Shh通路激動(dòng)劑purmorphamine，將其配成1 mg/mL濃度，每日1 mg/kg劑量腹腔注射直至取材[8]。針刺組:每日“百會(huì)”透“曲鬢”針刺治療。本實(shí)驗(yàn)挑選我院針灸科5名平均年齡27.9歲且針灸技術(shù)成熟的住院醫(yī)師為針刺組大鼠進(jìn)行干預(yù)。大鼠俯臥位，四肢固定，按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[9]確定選穴部位，取規(guī)格0.3 mm×25 mm針灸針從百會(huì)穴(兩耳連線中點(diǎn))向右側(cè)曲鬢穴(右耳屏前緣)透刺，進(jìn)針深度約20 mm，使針尖剛透過曲鬢穴皮膚表面為度;行針時(shí)用拇指和食指把持針柄，手工形式順逆方向交替捻針，轉(zhuǎn)速200 r/min;每日固定時(shí)間行針1次，每次30 min，在此期間共捻針3次，每次6 min，每6 min捻針完畢后休息6 min再進(jìn)行下一次捻針，休息時(shí)留針。非經(jīng)非穴組:在“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法水平向后1 cm部位予以針刺，其他與針刺組相同。

1.2.5 取材方法 所有大鼠連續(xù)干預(yù)5 d后取腦組織，取材前再次通過Bederson評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損情況。隨后各組15只大鼠中的5只做HE染色，5只做TUNEL檢測，5只做western blot。其中，做HE染色和TUNEL檢測的大鼠先后用150 mL生理鹽水和150 mL 4%多聚甲醛/0.1M PBS(pH=7.2～7.4)灌注后取材，之后4 ℃固定于4%多聚甲醛/0.1M PBS(pH=7.2～7.4)內(nèi)；做western blot大鼠直接冰上取腦，之后-80 ℃保存。

1.2.6 觀察指標(biāo)檢測方法

1.2.6.1 HE染色 組織分別經(jīng)梯度酒精和100%二甲苯脫水、透明，石蠟包埋后冠狀位在出血半暗帶區(qū)切成厚5 μm切片，依次浸入二甲苯和梯度酒精脫蠟，蘇木精染色，0.5%鹽酸乙醇液分化，再依次經(jīng)100%酒精和100%二甲苯脫水、透明，樹膠封片，光鏡下400倍在出血半暗帶觀察腦組織病理損傷程度。

1.2.6.2 TUNEL檢測 組織固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片和脫蠟與HE染色相同。之后0.1%Triton-X-100孵育2 min，避光條件TUNEL反應(yīng)液37 ℃孵育1 h，DAB顯色5 min后蘇木精染色。400倍光鏡下每張切片在出血半暗帶隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。凋亡率=(某視野凋亡陽性細(xì)胞/某視野全部細(xì)胞)×100%。最后計(jì)算3個(gè)視野凋亡率平均值。

1.2.6.3 Western blot 組織研磨后冰上裂解30 min，15 000 rpm勻漿、4 ℃離心20 min。樣品與BCA液1:8混合，酶標(biāo)儀570 nm波長讀取光密度值。配制8%、12%的SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，待測蛋白每孔上樣20 μg。電泳：濃縮膠恒壓90 V,20 min；分離膠恒壓160 V，通過預(yù)染蛋白marker確定電泳時(shí)間。轉(zhuǎn)膜、封閉后加入Smo或Gli1一抗4 ℃過夜，次日取出換二抗孵育40 min，ECL顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)測量條帶IOD值，IOD值與β-actin比值即為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)ICH大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

治療前，模型組、針刺組、激動(dòng)劑組和非經(jīng)非穴組Bederson評(píng)分與假手術(shù)組比較顯著升高(P<0.01)。與同組治療前比較，5 d后模型組、針刺組、激動(dòng)劑組、非經(jīng)非穴組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.01)。療后針刺組和激動(dòng)劑組評(píng)分分別與模型組比較明顯下降(均P<0.01)，但針刺組與激動(dòng)劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非經(jīng)非穴組評(píng)分雖較模型組比較略有下降，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而仍較針刺組和激動(dòng)劑組明顯升高，與兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，療后針刺組與激動(dòng)劑組分別同假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后神經(jīng)功能評(píng)分比較

2.2 針刺對(duì)ICH大鼠出血半暗帶區(qū)病理損傷的影響

模型組出血半暗帶區(qū)有血腫形成，周圍散在大量紅細(xì)胞，血腫周圍組織間隙、細(xì)胞內(nèi)見明顯水腫，組織結(jié)構(gòu)排列紊亂。針刺組出血半暗帶區(qū)組織結(jié)構(gòu)仍紊亂，但血腫基本消失、水腫明顯減輕，可見凋亡、壞死神經(jīng)細(xì)胞。激動(dòng)劑組與針刺組差異不明顯。非經(jīng)非穴組出血半暗帶區(qū)有一定數(shù)量紅細(xì)胞浸潤，伴細(xì)胞水腫、組織間隙增寬及組織排列不規(guī)整等現(xiàn)象。而假手術(shù)組腦組織相同區(qū)域結(jié)構(gòu)完整，無病理損傷。見圖1。

注：黑色箭頭所示為病理損傷情況。

2.3 針刺對(duì)ICH大鼠出血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較假手術(shù)組明顯升高，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。針刺組和激動(dòng)劑組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別與模型組比較明顯下降(均P<0.01)，但針刺組與激動(dòng)劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非經(jīng)非穴組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率雖較模型組略有下降，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而仍較針刺組和激動(dòng)劑組明顯升高，與兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、表2。

注：白色箭頭所指為凋亡細(xì)胞。

表2 各組大鼠腦出血半暗帶區(qū)凋亡細(xì)胞率

2.4 針刺對(duì)ICH大鼠腦組織Smo、Gli1蛋白表達(dá)的影響

模型組Smo蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。針刺組和激動(dòng)劑組Smo蛋白表達(dá)分別與模型組比較明顯升高(均P<0.01)，但針刺組與激動(dòng)劑組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非經(jīng)非穴組Smo蛋白表達(dá)雖較模型組略有升高，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而仍較針刺組和激動(dòng)劑組明顯下降，與兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腦組織Smo蛋白表達(dá)

模型組Gli1蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。針刺組和激動(dòng)劑組分別與模型組比較明顯升高(均P<0.01)，但針刺組與激動(dòng)劑組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非經(jīng)非穴組Gli1蛋白表達(dá)雖較模型組略有升高，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而仍較針刺組和激動(dòng)劑組明顯下降，與兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠腦組織Gli1蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠腦組織Smo、Gli1蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

腦出血在中醫(yī)學(xué)屬中風(fēng)范疇，該病按臨床表現(xiàn)可分為中經(jīng)絡(luò)和中臟腑。中風(fēng)病因是外感內(nèi)傷共同致病的結(jié)果，且有虛實(shí)之分；按病機(jī)可分為肝陽上擾、痰熱腑實(shí)、風(fēng)痰瘀阻、氣虛血瘀和正氣虛脫等證型。但中風(fēng)病名的變化經(jīng)歷了漫長過程，該詞最早見于《素問》的“飲酒中風(fēng)、新沐中風(fēng)”，但多指外感風(fēng)邪致汗出增多。宋元以前醫(yī)家所指中風(fēng)病，在臨床表現(xiàn)方面與現(xiàn)代所指中風(fēng)已十分接近，但發(fā)病機(jī)制方面多認(rèn)為是外感風(fēng)邪為主。隨著對(duì)中風(fēng)病認(rèn)識(shí)的加深，宋元以后，朱丹溪在《丹溪心法》中提到:“中風(fēng)大率主血虛有痰”，即中風(fēng)病因是血虛致脾失濡養(yǎng)，脾虛生痰上犯于腦而致[10]，這與現(xiàn)代觀點(diǎn)相似。王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中認(rèn)為中風(fēng)病因應(yīng)是元?dú)馓潛p[11]，他贊同張景岳的“非風(fēng)”觀點(diǎn)，更強(qiáng)調(diào)了中風(fēng)病并非外感風(fēng)邪所致。

針刺療法治療中風(fēng)已有近千年歷史，唐宋以后更多醫(yī)家將針刺作為治療中風(fēng)的主要手段。元代王國瑞在《扁鵲神應(yīng)針灸玉龍經(jīng)》采用頭針治療中風(fēng)[12]，文中提到:“中風(fēng)不語最難治,頂門發(fā)際亦堪施，百會(huì)穴中明補(bǔ)瀉，及時(shí)蘇醒免災(zāi)危”。明代陳氏在《神應(yīng)經(jīng)》中則采用體針治療中風(fēng)[13]，以上均為中風(fēng)的針刺治療提供了理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)中選取“百會(huì)”透“曲鬢”作為治療腦出血的唯一方法，其原因在于：百會(huì)穴位于頭部巔頂，為多條陽經(jīng)之匯，針刺該穴可振奮臟腑之陽氣，促進(jìn)肢體功能恢復(fù)。此外，針刺百會(huì)穴可開竅醒神，用于肝陽上亢或痰濁蒙蔽清竅所致昏仆。再者，百會(huì)屬督脈穴，針刺該穴可促進(jìn)腎精轉(zhuǎn)輸、填補(bǔ)腦髓。曲鬢穴作為頭穴之一，常用于治療頭痛、頭暈等頭疾。而透刺法相較刺激單一穴位而言，一針貫穿二穴，擴(kuò)大了頭皮表面刺激面積。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法可通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖[14]、抑制炎癥反應(yīng)[15]、減輕腦組織血腫和水腫[16]等多途徑促進(jìn)ICH后神經(jīng)功能恢復(fù)，且近年也有研究發(fā)現(xiàn)，針刺可在腦卒中疾病中抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17]，但其機(jī)制是多方面的。許多實(shí)驗(yàn)均表明，Shh信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[3,18]。對(duì)該通路的抑制不僅在癌細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡并減少癌細(xì)胞增殖的作用[19]，同時(shí)在腎損傷[20]、骨骼肌缺血再灌注損傷[3]等創(chuàng)傷性疾病中，通過激活該通路Smo、Gli1等蛋白表達(dá)，可發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。Smo是Shh通路上游蛋白，當(dāng)該通路被激活后，Smo擺脫了Ptch1的束縛，通過在細(xì)胞膜原纖毛表面大量聚集激活下游因子Gli1。Gli基因是1987年Kinzler[21]研究膠質(zhì)細(xì)胞瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)的編碼鋅指蛋白家族的基因，作為Shh通路的下游因子，當(dāng)該通路被激活后，Gli1會(huì)以激動(dòng)子形式進(jìn)入胞核，激活轉(zhuǎn)錄，不僅發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，同時(shí)也可抑制細(xì)胞凋亡[3,18]。

本實(shí)驗(yàn)Shh通路關(guān)鍵蛋白Smo和Gli1的western blot結(jié)果可看出，激動(dòng)劑組在模型組一定程度上調(diào)兩種蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上，再次上調(diào)兩種蛋白表達(dá)。說明作為Shh通路激動(dòng)劑的purmorphamine可明顯上調(diào)該通路關(guān)鍵因子表達(dá)，從而激活該通路。而且觀察各組凋亡細(xì)胞率可知，激動(dòng)劑組相較模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯下降，結(jié)合western blot結(jié)果可推測，激動(dòng)劑組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的下降可能與Shh通路激動(dòng)劑激活該通路有關(guān)。在腦出血半暗帶觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中，“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法作為針刺組唯一干預(yù)方法，相較模型組可明顯抑制ICH后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且可達(dá)到與Shh通路激動(dòng)劑相同的水平。繼而觀察western blot結(jié)果，針刺組Smo和Gli1蛋白表達(dá)與激動(dòng)劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上可知，“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法可能通過激活Shh通路抑制ICH后出血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

此外，通過HE染色結(jié)果可知，Shh通路激動(dòng)劑purmorphamine和“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法均可在腦出血半暗帶明顯改善ICH大鼠各種病理損傷，且達(dá)到相似效果。腦出血半暗帶血腫、水腫和炎癥等病理損傷的緩解亦可為出血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的減輕提供必要的大環(huán)境，結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦可推測“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法可能通過激活Shh通路改善腦出血半暗帶各種病理損傷，繼而下調(diào)該區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平，以達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的目的。