Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化工藝對黃精多糖的影響△

金鵬程，吳麗華，吳昕怡，李智敏，田浩，肖丹*

1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南 昆明 650221；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 楚雄 651300

中藥材產(chǎn)地加工是指在藥材基原植物的最佳采收年限、采收期內(nèi)對其進(jìn)行采收，在采收地進(jìn)行去除非藥用部位、清洗、分級挑選、切制、浸漂、蒸制、煮制、發(fā)汗、干燥、分割部位、包裝等1個或多個加工炮制步驟[1-3]，是中藥產(chǎn)業(yè)鏈中原料與飲片的中間環(huán)節(jié)[4]，也是保證和提高藥材質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)[5-6]。滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.為百合科黃精屬植物，味甘，性平，歸脾、肺、腎經(jīng)，主要用于脾胃氣虛、內(nèi)熱消渴、肺虛燥咳等[7]，臨床多用于改善心肺功能，治療糖尿病、脂肪肝，延緩衰老[8-10]。黃精多糖為滇黃精的主要有效成分，也是《中華人民共和國藥典》2020年版中滇黃精的質(zhì)量評價指標(biāo)[7]。

目前，滇黃精產(chǎn)地加工大多采用自然曬干，自然環(huán)境與晾曬條件等因素對藥材品質(zhì)影響較大。不同加工炮制方法得到的滇黃精質(zhì)量參差不齊，存在加工過程耗時長、藥材易霉變、黃精多糖含量降低等問題[11-13]。為提高滇黃精藥材質(zhì)量、減少黃精多糖的損失，需要對其產(chǎn)地加工炮制一體化工藝開展研究。目前，滇黃精產(chǎn)地加工多運(yùn)用傳統(tǒng)單因素試驗和正交試驗法[14-18]。響應(yīng)面優(yōu)化法相對于傳統(tǒng)方法，可全面系統(tǒng)考察因素與因素之間、因素與響應(yīng)面之間的交互作用[17]?，F(xiàn)有關(guān)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化工藝對黃精多糖的影響文獻(xiàn)鮮有報道。因此，本研究采用單因素試驗與響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合的方法，以黃精多糖作為評價指標(biāo)，優(yōu)化滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化工藝，為滇黃精藥材產(chǎn)地加工炮制一體化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-5500型紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；150B型中藥材粉碎機(jī)(瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)；FA1004型萬分之一電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

D-無水葡萄糖對照品(批號：110833-201707，純度：99.9%，中國食品藥品檢定研究院)；無水乙醇、蒽酮、濃硫酸均為分析醇；水為純化水。

滇黃精均由玉溪市祥馨農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司種植，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為百合科黃精屬植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.。

2 方法與結(jié)果

2.1 預(yù)處理

取基地種植的3 年生滇黃精植株，去除地上部分，取根莖部，去除泥沙、須根，洗凈備用。

2.2 黃精多糖測定

2.2.1對照品溶液制備 精密稱取對照品D-無水葡萄糖33.0 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取D-無水葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置20 mL刻度試管中，加水至2.0 mL，搖勻，置冰水浴中，緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，混勻，沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min。按紫外-可見分光光度法，以純化水為空白對照，在582 nm處測定吸光度(A)。

2.2.3線性關(guān)系考察 按照2.2.2項下方法，測定A。以A為縱坐標(biāo)(Y)，黃精多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=0.004 4X+0.063 5(r=0.997 6)，表明D-無水葡萄糖在0.033～0.198 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2.4供試品溶液制備 精密稱取60 ℃干燥至恒重的供試品粉末0.250 0 g，置圓底燒瓶中，加入80%乙醇150 mL，浸泡30 min，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，濾渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣和濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加熱回流1 h，趁熱過濾，濾渣和燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液，冷卻，移至250 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL具塞試管中，加水至2 mL，搖勻，冰水浴中緩慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，混勻，沸水浴10 min，取出，立即冰水浴10 min。按紫外-可見分光光度法，在582 mm波長處測定A。

2.2.5精密度試驗 精密量取D-葡萄糖對照品溶液0.5 mL，以純化水為空白對照，在582 nm波長處測定A，RSD為0.46%，表明方法精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，以純化水為空白對照，分別在0、2、4、6、8 h測定A，RSD為0.77%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性試驗 精密稱取滇黃精供試品粉末6份，每份0.25 g，按2.2.4項下方法制備供試品溶液，以純化水為空白對照，在582 nm波長處測定A，RSD為0.55%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率試驗 取已知黃精多糖含量的滇黃精樣品6份，每份0.25 g，按2.2.4項下方法制備，分別于具塞試管中加入對照品溶液1 mL，在582 nm波長處測定A，計算加樣回收率，平均加樣回收率為97.54%，RSD為0.90%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 單因素試驗

2.3.1蒸制時間 取按2.1項下方法凈制的滇黃精鮮品，分別蒸制5、10、15、20、25、30 min，切3 mm厚片，60 ℃干燥至水分<15%，考察不同蒸制時間對滇黃精中黃精多糖含量的影響。如圖1所示，蒸制時間為5～20 min時，黃精多糖含量隨蒸制時間增加，20 min時達(dá)到最大值，此時，黃精多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.55%；蒸制20～30 min，黃精多糖含量隨蒸制時間增加而下降。因此，選擇20 min為最佳蒸制時間；10、30 min為后續(xù)優(yōu)化實驗的最低、最高水平。

圖1 不同蒸制時間下黃精多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3.2切片厚度 取按2.1項下方法凈制的滇黃精鮮品，蒸制20 min后，分別切片1、2、3、4、5 mm，60 ℃干燥至水分<15%，考察滇黃精切片厚度對黃精多糖含量的影響。如圖2所示，切片厚度為1～3 mm時，黃精多糖含量隨片厚增加而增大；切片厚度達(dá)3 mm時黃精多糖含量達(dá)到最大值；切片厚度為3～5 mm時，黃精多糖含量隨片厚增加呈下降趨勢。因此，選擇3 mm為滇黃精最佳切片厚度；1、5 mm為后續(xù)優(yōu)化試驗的最低、最高水平。

圖2 不同切片厚度下黃精多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3.3干燥溫度 取按2.1項下方法凈制后滇黃精鮮品，蒸制20 min、切制成3 mm厚片，分別按30、40、50、60、70、80、90、100 ℃干燥至水分<15%，確定不同干燥溫度對黃精多糖的影響。如圖3所示，干燥溫度為40～60 ℃時，黃精多糖含量隨干燥溫度的增加而增加；60 ℃時黃精多糖含量達(dá)到最大值；60～100 ℃時，黃精多糖含量隨干燥溫度增加呈下降趨勢。因此，選擇60 ℃為滇黃精最佳干燥溫度，40、80 ℃為后續(xù)優(yōu)化試驗的最低、最高水平。

圖3 不同干燥溫度下黃精多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

2.4.1試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，選取3個因素為自變量，分別為蒸制時間(A)、切片厚度(B)、干燥溫度(C)，每個因素取3個水平，以黃精多糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計中心組合試驗。各因素及水平設(shè)計見表1。采用Design-Expert 8.0.5b軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計方案，方案與結(jié)果見表2。共考察17組工藝參數(shù)，其中13～17組為中心設(shè)計(零點(diǎn)試驗)。

表1 滇黃精加工炮制工藝Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平

表2 滇黃精加工炮制工藝Box-Behnken的試驗設(shè)計方案與結(jié)果

2.4.2方差分析及數(shù)據(jù)處理 回歸模型方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3，擬合得到回歸方程為Y=0.138+0.012A+0.059B+0.023C+0.60×10-4AB-0.238×10-4AC+0.306×10-4BC-0.246×10-3A2-0.855×10-2B2-0.186×10-3C2，P<0.01，r為0.990 5，表明該模型對本實驗的擬合度較好，在本實驗研究范圍內(nèi)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 滇黃精加工炮制工藝回歸模型方差分析結(jié)果

因素B、B2、C2對響應(yīng)值的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，因素A、C、A2對響應(yīng)值的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此，滇黃精產(chǎn)地加工各因素對黃精多糖的影響不是簡單的線性關(guān)系，A、B、C 3個因素之間存在顯著交互作用。本模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項P=0.818>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該回歸模型與實驗數(shù)據(jù)擬合程度良好、試驗誤差小，可以采用其優(yōu)化滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化工藝。

運(yùn)用Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，3D圖直觀體現(xiàn)A、B、C 3個因素之間兩兩交互作用對黃精多糖含量的影響，結(jié)果見圖4～6。滇黃精A、B交互作用響應(yīng)面3D圖坡度平緩，表明這2個因素交互作用較弱，對黃精多糖含量影響較小。滇黃精C與A、C與B交互作用響應(yīng)面3D圖坡度較陡，表明C與A、C與B交互作用較強(qiáng)，對黃精多糖含量影響顯著。根據(jù)Design-Expert 8.0.5b軟件分析計算，滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化優(yōu)化工藝為A：22.24 min、B：3.66 mm、C：61.19 ℃，預(yù)測黃精多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.29%。

圖4 多糖提取率隨蒸制時間和切片厚度變化的響應(yīng)面

圖5 多糖提取率隨干燥溫度和蒸制時間變化的響應(yīng)面

圖6 多糖提取率隨干燥溫度和切片厚度的變化的響應(yīng)面

2.5 驗證實驗

根據(jù)2.4.2項下優(yōu)化工藝及實際操作條件調(diào)整為滇黃精凈制樣品A:22 min、B:3.6 mm、C:61 ℃，制備3 批樣品，分別測定黃精多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，平均值為12.21%，與相應(yīng)條件預(yù)測值相接近。結(jié)果表明，本研究所建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠，滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化優(yōu)化工藝重復(fù)性好、可行性高、可操作性強(qiáng)。

3 討論

中藥材產(chǎn)地加工炮制一體化是原料到飲片且控制藥材質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)之一[1-2]。目前，產(chǎn)地加工仍處于傳統(tǒng)經(jīng)驗指導(dǎo)操作，因此，對各步驟過程應(yīng)做到科學(xué)、規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，為中藥原料質(zhì)量提供保障[3-5]。本研究對滇黃精蒸制時間、切片厚度、干燥溫度進(jìn)行單因素考察，確定后續(xù)響應(yīng)面分析各因素最高水平和最低水平。通過對黃精多糖含量測定，選擇蒸制時間22 min、切片厚度3.6 mm、干燥溫度61 ℃作為優(yōu)化工藝。按優(yōu)化工藝制備測定的黃精多糖實際值與預(yù)測值相接近。結(jié)果表明，本研究所建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠，優(yōu)化后滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化工藝重復(fù)性好、可行性高、可操作性強(qiáng)，具有實際意義。滇黃精產(chǎn)地加工炮制一體化對滇黃精原料生產(chǎn)和飲片加工環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化，能夠有效減少黃精多糖的損失、保證藥材質(zhì)量，為中藥飲片、中藥制劑做好原料質(zhì)量保障。