不同產地黃芪藥材和飲片的HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜分析△

鐘榮榮，李默影，肖蘇萍*，王繼永，高永堅，張斯杰，周朗，王海蝶

1.中國中藥有限公司，北京 102600；2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院 中藥創(chuàng)新中心，上海 201203；3.中國中藥控股有限公司，廣東 佛山 528303 4.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、排膿托毒、斂瘡生肌之功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃芪中富含皂苷類、黃酮類、多糖類等化合物，對免疫性疾病、機體能量代謝疾病、血液病及心血管疾病等有治療作用[2]。為了全面評價黃芪藥材質量，國內外學者分別建立了不同的指紋圖譜方法對其進行分析[3-9]，但對于多批次不同產地黃芪藥材和飲片用同一種前處理方法，采取二極管陣列檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用法(DAD-ELSD)比較分析其指紋圖譜，目前還鮮見報道。

本實驗采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用法(HPLC-DAD-ELSD)建立黃芪藥材和飲片指紋圖譜分析方法，考察了方法的精密度、穩(wěn)定性和重復性，確定了23個共有峰，指認了6個指紋峰，并測定分析了40批不同產地黃芪藥材和飲片指紋圖譜相似度及藥材和飲片之間的對應相似性。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；XS205DU型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TWJR-B 230×230型加熱板(上海百申儀器設備有限公司)；Sigma3-18型臺式高速離心機(美國Sigma公司)。

1.2 試藥

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號：111920-201606，純度≥97%)、芒柄花素(批號：111703-201504，純度≥98%)均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品3-O-3′，4′-二乙?；?β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-環(huán)黃芪醇(批號：1324005-51-7，純度≥97%)、芒柄花苷(批號：R28O8F46957，純度≥98%)、毛蕊異黃酮(批號：Y24N9Y75652，純度≥98%)、黃芪皂苷Ⅱ(批號：B20566，純度≥98%)均購于上海源葉生物科技有限公司；色譜純乙腈、HPLC級甲酸(賽默飛世爾科技有限公司)；甲醇、無水乙醇均為分析純(北京化工廠)；水為實驗室自制超純水。

所有黃芪藥材和飲片樣品經(jīng)中國中藥有限公司王繼永研究員鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao干燥根及切制飲片，樣品信息見表1，樣品分級標準見表2。

表1 黃芪藥材和飲片樣品信息

表2 黃芪藥材質量分級標準

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的制備

取對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪皂苷Ⅱ、3-O-3′，4′-二乙?；?β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-環(huán)黃芪醇、芒柄花素適量，精密稱定，加50%甲醇制成質量濃度為10 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取黃芪粗粉5 g，加熱回流提取3次，加水量分別為50、40、30 mL，每次1 h。合并濾液，加入乙醇至醇體積分數(shù)為70%，靜置1 h，4000 r·min-1離心20 min(離心半徑為13.5 cm)。取上清液濃縮至干，加水20 mL使溶解，以等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，濃縮至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以0.5%甲酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫(0～10 min，90%～80%A；10～30 min，80%～70%A；30～55 min，70%～40%A；55～55.1 min，40%～90%A；55.1～60 min，90%A)；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL；流速為1 mL·min-1；檢測波長為254 nm；ELSD參數(shù)：載氣氣壓為241 kPa，漂移管溫度為90 ℃；增益為50。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1精密度試驗 精密吸取S1樣品溶液，連續(xù)進樣6次，以芒柄花苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.4.2重復性試驗 取S1樣品6份，按2.2項下方法制備，分別進樣測定，以芒柄花苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于5%，表明本方法重復性良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗 精密吸取S1供試品溶液，分別在0、6、12、18、24 h進樣，以芒柄花苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積。結果表明，各共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于5%，表明供試品在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 黃芪藥材和飲片指紋圖譜的建立

取上述40批黃芪樣品，分別按2.2項下方法制備，按2.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004A版)軟件，對黃芪藥材和飲片指紋圖譜進行自動匹配，標定共有峰，依次編號。建立40批不同產地黃芪HPLC-ELSD和HPLC-DAD指紋圖譜，并進行相似度評價，結果見圖1～4和表3。

注：A.對照品；B.黃芪樣品對照圖譜(R)；7.黃芪皂苷Ⅱ；11.3-O-3′，4′-二乙?；?β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-環(huán)黃芪醇。圖1 黃芪樣品HPLC-ELSD指紋圖譜對照圖譜

圖2 黃芪樣品HPLC-ELSD指紋圖譜

注：A.對照品；B.黃芪樣品對照圖譜(R)；3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；6.芒柄花苷；9.毛蕊異黃酮；12.芒柄花素。圖3 黃芪樣品及對照品HPLC-DAD指紋圖譜對照圖譜

圖4 黃芪樣品HPLC-DAD指紋圖譜

表3 40批黃芪藥材和飲片相似度

如圖1所示，與對照品比對后，鑒定峰7為黃芪皂苷Ⅱ、峰11為3-O-3′，4′-二乙?；?β-D-吡喃木糖基-6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-環(huán)黃芪醇。

如圖3所示，與對照品比對后，鑒定峰3為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、峰6為芒柄花苷、峰9為毛蕊異黃酮、峰12為芒柄花素。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本實驗考察了柱溫25、30、35 ℃下的色譜分析情況，根據(jù)色譜峰的分離度和峰形效果，選取35 ℃作為最佳柱溫。選用Waters-X Bridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent Zorbax SB C18(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱進行分析，結果表明，Waters-X Bridge C18和Agilent C18色譜柱的色譜峰分離度較差且時間較長，效率低，故最終選用Agilent Zorbax SB C18(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱。對ELSD參數(shù)進行了考察，最終條件為漂移管溫度90 ℃，檢測器增益50，氣體壓力241 kPa。

3.2 相似度評價分析

本實驗建立的指紋圖譜方法能較全面地反映黃芪藥材和飲片中的黃酮類和皂苷類成分，可為黃芪藥材和飲片質量控制提供參考，具有較強的實用性。比較藥材與其對應的切制飲片的指紋圖譜，除山西產的藥材樣品相似度為0.86外，藥材和飲片DAD指紋圖譜相似度均大于0.94，ELSD指紋圖譜相似度均大于0.89，說明黃芪飲片切制、干燥過程對藥材成分影響較小。

除2個樣品外，DAD均比ELSD指紋圖譜相似度高，這可能與DAD只對有光吸收的化合物適用有關，專屬性更強，響應干擾小，相似度更高。

40批6個不同產地的黃芪藥材和飲片中，除山西、內蒙古產的2個樣品相似度為0.860和0.868外，DAD指紋圖譜相似度均大于0.92，除甘肅產的1個樣品為0.783外，ELSD指紋圖譜相似度均大于0.85，提示產地對黃芪質量有一定影響。

3.3 黃芪等級分析

傳統(tǒng)的藥材分級方法多注重于外觀性狀，通常是根據(jù)藥材的個頭大小、質地、顏色、味道等。本研究中32批劃分等級的黃芪藥材以上、下端直徑大小進行分級，但不同等級黃芪藥材樣品中，DAD和ELSD指紋圖譜相似度均沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性，提示等級間黃芪質量不均一，這可能與黃芪化學成分之間可能存在相互轉化等情況有關[10]，也可能為黃芪藥材劃分等級的標準不適用，后續(xù)可繼續(xù)進行黃芪藥材分等級指標研究。

3.4 指紋圖譜分析

由指紋圖譜可見，各峰分離較好，利用DAD和ELSD 2種檢測器聯(lián)用方法對黃芪皂苷類和黃酮類成分進行了全面分析，同時供試品制備方法相對簡單、易操作，本方法可用于定性評價黃芪藥材和飲片質量。