去泛素化酶USP12抑制肺腺癌增殖和促凋亡

張 閩，許 亮，金美芳，李曉未，王浥霏

（1.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215003；2.蘇州市立醫(yī)院東區(qū)檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215001）

世界范圍內(nèi)，肺癌致死率占惡性癌癥致死率首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）作為其主要病理類型呈顯著增長趨勢[1-2]。盡管目前的靶向治療能顯著改善肺癌病人生存率和生活質(zhì)量，仍有許多病人因缺乏治療靶點(diǎn)而受死亡威脅[3-6]。眾多研究[7]表明肺腺癌的發(fā)生發(fā)展與去泛素化酶（eubiquitylating enzyme, DUB）家族的功能密不可分。人類泛素特異性蛋白酶（ubiquitinspecific protease, USP）亞家族是去泛素化酶家族中研究最廣泛，且擁有最多成員的家族[8]。該家族蛋白結(jié)構(gòu)具有多樣性，且屬于半胱氨酸蛋白酶類，能夠通過水解作用移除靶蛋白上的泛素鏈，使蛋白不易被泛素化降解，從而促進(jìn)目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能[9]。眾多研究[10-11]顯示USP家族成員能夠參與癌細(xì)胞DNA修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)展和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等眾多過程。且越來越多的研究將特異性激活的USP家族成員作為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物開發(fā)，這使得對(duì)USP家族成員功能和作用機(jī)制的研究顯得尤為重要。作為USP家族成員之一，USP12被報(bào)道與前列腺癌的發(fā)生相關(guān)，但其在肺腺癌中的作用尚不清晰，本文旨在對(duì)USP12在肺腺癌中的表達(dá)以及功能進(jìn)行研究，為肺癌臨床治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA網(wǎng)站（http://gepia2.cancer-pku.cn/#help）是一個(gè)在線數(shù)據(jù)庫，涵蓋了TCGA數(shù)據(jù)庫的癌癥病人信息，以及GTEx數(shù)據(jù)庫中正常人體中基因表達(dá)信息。本研究通過對(duì)比該網(wǎng)站中483 例肺癌病人數(shù)據(jù)和347 例正常及癌旁組織數(shù)據(jù)，分析USP12在肺癌與正常組織中的表達(dá)差異。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 細(xì)胞系：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549與H1299均購于中科院上海細(xì)胞庫。兩種細(xì)胞系均使用含10%胎牛血清和青鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于CO2濃度為5%、濕度飽和的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長至80%密度傳代，并選擇處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 抗體與試劑：細(xì)胞RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、胰酶、RIPA蛋白裂解液和3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司；USP12，Caspase 3，cleaved-Caspase 3和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒、凋亡檢測試劑盒均購于美國Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 s h U S P 1 2載體與p C D H-U S P 1 2構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)U S P 1 2基因序列設(shè)計(jì)s h U S P 1 2干擾序列如下：s h U S P 1 2-1，5'-CCCUAAGAAGUUCAUCACAAGAUUA-3'；shUSP12-2，5'-UCGAGGCCAUUAUAUUGCAA UAGUU-3'；將干擾序列與pLKO載體連接得到pLKO-shUSP12核心載體，之后與pVSVG、pREV、pGAG包裝體系共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞系中，24 h后離心收集含有病毒顆粒的上清并用0.45 μmol/L濾器過濾，使用稀釋法測定病毒滴度，得到感染細(xì)胞的合適濃度。將A549與H1299細(xì)胞以每孔3×104的密度接種于24孔板，加入含有病毒與聚凝胺（polybrene）的培養(yǎng)基，48 h后更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)1 周，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shUSP12的細(xì)胞系，通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)確定是否成功敲除USP12。

1.3.2 pCDH-USP12過表達(dá)載體構(gòu)建：通過NCBI網(wǎng)站下載USP12 CDS區(qū)全長序列，基因組模板經(jīng)PCR擴(kuò)增后將所得序列連接于pCDH-CMV-MCSEF1-Puro載體而獲得pCDH-USP12過表達(dá)載體。將pCDH-USP12與包裝載體pMD2、pAX2共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞系中，24 h后收集病毒上清，測定病毒滴度，并用于感染肺癌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48 h更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)1 周，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDH-USP12的細(xì)胞系，通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)確定是否成功敲除USP12。

1.3.3 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)：(1)樣品制備：肺腺癌A549與H1299細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后，使用RIPA試劑進(jìn)行裂解并提取蛋白，樣品經(jīng)BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并加入適量5×上樣緩沖液，于100 ℃加熱5 min使蛋白變性；(2)電泳：配置分離膠濃度為10%的SDS-PAGE凝膠，各實(shí)驗(yàn)組取等量的蛋白樣品30 μg加樣于泳道，并設(shè)置蛋白marker組，恒流30 mA進(jìn)行電泳50 min；(3)轉(zhuǎn)膜與封閉：電泳結(jié)束后將蛋白膠置于醋酸纖維膜上，采用200 mA恒流60 min進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)印，轉(zhuǎn)印后的NC膜置于5%脫脂牛奶中，搖床上室溫封閉2 h；(4)抗體孵育：蛋白一抗按說明書比例稀釋，將膜置于抗體中，4 ℃過夜孵育，第二天將膜取出，PBST溶液清洗3 次，每次5 min，將膜置于二抗中，室溫下?lián)u床上孵育45 min，PBST洗膜；(5)顯色：使用ECL發(fā)光液對(duì)膜進(jìn)行孵育顯色，對(duì)目的條帶進(jìn)行拍照。

1.3.4 MTT實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染shUSP12或pCDH-USP12的A549、H1299細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，按每孔3 000 個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)定5 個(gè)復(fù)孔，每孔中培養(yǎng)基體積為100 μL，每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)基。在相應(yīng)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)（24、48、72、96 h）向每孔加入各20 μL濃度為5 mg/μL的MTT溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育。4 h后取出96孔板，將培養(yǎng)基吸除干凈并在每孔中加入150 μL的DMSO，使用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染shUSP12或pCDHUSP12的A549、H1299細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，按每孔1 000 個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，每孔中加入2 mL完全培養(yǎng)基體積，每隔24 h更換新鮮培養(yǎng)基，10 d后待細(xì)胞增殖為肉眼可見的單克隆時(shí)取出孔板，PBS清洗3 次，加入溶解于4%多聚甲醛的結(jié)晶紫溶液，染色10 min后棄掉溶液，并使用PBS緩慢清洗克隆，對(duì)克隆進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.3.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：A549與H1299細(xì)胞用胰酶消化并轉(zhuǎn)移至不同EP管中，PBS清洗兩次并將溶液棄去，避光進(jìn)行如下操作，每管中加入配置好的AnnexinⅤ染色液將細(xì)胞重懸，置于冰上孵育30 min，之后每管加入1 μL PI染色液，置于37 ℃孵育5 min，使用Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖。

1.3.7 免疫組織化學(xué)染色（IHC）：從上海芯超公司購買了含有75 例肺腺癌與癌旁組織的芯片，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)其中USP12蛋白水平進(jìn)行檢測與統(tǒng)計(jì)分析，主要步驟如下：(1)抗體結(jié)合：組織芯片置于二甲苯和濃度梯度的乙醇中進(jìn)行脫蠟；2% H2O2孵育10 min去除內(nèi)源性過氧化物酶作用；0.1% Triton X-100覆蓋組織透化10 min；芯片置于抗原修復(fù)液中95 ℃加熱15 min，室溫下冷卻；5% BSA對(duì)組織進(jìn)行封閉20 min，PBS清洗5 min；組織覆蓋一抗，放置于4 ℃過夜進(jìn)行孵育；室溫下二抗孵育30 min；(2)染色：稀釋好的DAB染液覆蓋于組織上進(jìn)行染色，PBS清洗后使用蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，清水緩慢沖洗；(3)脫水封片：組織置于濃度梯度的乙醇和二甲苯中進(jìn)行逐步脫水，中性樹膠封片；(4)顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與作圖，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩獨(dú)立樣本比較數(shù)據(jù)使用Student'st檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05即視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去泛素化酶USP12在肺癌中的表達(dá)分析 我們首先通過GEPIA網(wǎng)站對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌病人及GTEx數(shù)據(jù)庫正常人體組織中USP12基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP12在肺癌病人組織中的水平顯著低于正常組織中（圖1A）。此外，我們通過免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)USP12在75 例肺腺癌與癌旁組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫分析一致，USP12在肺癌病人組織中表達(dá)低于對(duì)應(yīng)癌旁組織（圖1B），圖1C為2 例代表性染色結(jié)果，表明USP12可能在肺癌中發(fā)揮抑癌作用。

圖1 USP12在肺癌病人中表達(dá)情況與免疫組化染色

2.2 敲低去泛素化酶USP12促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖 為進(jìn)一步確定USP12在肺癌中的促癌作用，我們對(duì)USP12是否影響肺癌細(xì)胞增殖進(jìn)行了研究，使用轉(zhuǎn)染shUSP12敲低肺癌細(xì)胞A549及H1299細(xì)胞系中USP12水平，并通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定了shUSP12的有效性（圖2A）。我們通過MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖存活能力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的對(duì)照組相比，USP12敲低后的A549與H1299細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，培養(yǎng)96 h后細(xì)胞存活率呈顯著差異（圖2B、2C）。

圖2 敲低USP12能夠促進(jìn)肺癌A549與H1299細(xì)胞增殖

2.3 過表達(dá)去泛素化酶USP12抑制肺癌細(xì)胞增殖 我們接下來通過轉(zhuǎn)染pCDH-USP12對(duì)肺癌細(xì)胞中USP12進(jìn)行過表達(dá)，并通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，確定了pCDH-USP12的有效性（圖3A）。MTT實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示培養(yǎng)96 h后細(xì)胞存活率呈顯著差異，克隆形成率明顯降低，表明過表達(dá)USP12能夠抑制肺癌A549與H1299細(xì)胞的增殖能力與存活能力（圖3B、3C）。

圖3 過表達(dá)USP12能抑制肺癌細(xì)胞增殖

2.4 過表達(dá)去泛素化酶USP12能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡

我們通過Annexin Ⅴ/PI雙染色對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示USP12水平升高后，肺癌A549與H1299細(xì)胞的凋亡水平顯著升高（圖4A、4B）。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)USP12后，細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase 3酶活性顯著增強(qiáng)，伴隨片段化Caspase 3蛋白水平升高（圖4C）。

圖4 過表達(dá)USP12能促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡

3 討論

眾多臨床研究證明癌蛋白水平升高與抑癌蛋白水平下降是癌癥發(fā)生的一大特征，泛素化（ubiquitination）與去泛素化（deubiquitination）過程作為調(diào)控蛋白降解的重要途徑在癌癥研究領(lǐng)域備受關(guān)注[12]。蛋白質(zhì)在泛素化酶的作用下與泛素鏈相連，進(jìn)而被蛋白酶體識(shí)別并發(fā)生水解。而去泛素化酶則通過去除蛋白質(zhì)上的泛素鏈穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能，參與信號(hào)傳導(dǎo)、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期與凋亡等重要細(xì)胞生理過程[1,13]。USP家族是去泛素化酶家族中最大的亞家族，該家族成員結(jié)構(gòu)高度保守，在不同癌癥中發(fā)揮促癌或抑癌功能，其中大多數(shù)成員在癌癥中發(fā)揮著促進(jìn)作用，如USP2在乳腺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤和前列腺癌組織中表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)的正常癌旁組織[14-17]。少數(shù)USP例如CYLD具有腫瘤抑制因子的特征，抑制肝癌、皮膚癌和結(jié)腸癌的發(fā)生或轉(zhuǎn)移[18-20]。另有幾種USP在不同癌癥背景下發(fā)揮促癌或抑癌功能，例如USP9X在結(jié)腸癌發(fā)揮腫瘤抑制作用，而在肺癌和多種血液癌癥中呈現(xiàn)高表達(dá)水平[21-23]。

USP12起初被定義為組蛋白H2B和H2A去泛素化酶[24-25]。對(duì)其酵母同源物結(jié)構(gòu)研究顯示，USP12參與肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞極性和內(nèi)吞作用[26]。USP12還可以通過影響Notch蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，下調(diào)其在細(xì)胞表面的水平，從而抑制下游信號(hào)作用[27]。USP12在癌癥中的研究主要集中于前列腺癌中，其缺失能夠顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡并引起細(xì)胞周期抑制[28-29]。Burska等[28]報(bào)道稱USP12在前列腺癌細(xì)胞中可以直接去泛素化作用穩(wěn)定雄激素受體AR蛋白結(jié)構(gòu)，同時(shí)通過組蛋白去泛素化影響USP12轉(zhuǎn)錄而間接調(diào)控其水平。USP12下調(diào)AKT磷酸化水平而影響其與雄激素受體信號(hào)相互作用[30]。此外，USP12不僅作為癌癥發(fā)展的標(biāo)志物，還與治療抵抗性和癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)，可能的機(jī)制為USP12通過去泛素化MDM2和AR，調(diào)控抑癌基因TP53和癌基因AR在前列腺癌細(xì)胞中的水平[31]。但USP12在肺癌中的具體功能并未見報(bào)道。

本研究首先通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌病例分析發(fā)現(xiàn)USP12在肺癌腫瘤組織中高表達(dá)，并通過肺癌組織芯片免疫組化染色確證這一現(xiàn)象，說明USP12在肺癌中可能發(fā)揮抑癌功能。MTT與克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)USP12對(duì)肺癌細(xì)胞增殖呈時(shí)間依賴性抑制。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示過表達(dá)USP12后肺癌細(xì)胞凋亡比例顯著增加。Caspase為經(jīng)典細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)表示USP12過表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡伴隨Caspase 3酶活性的激活。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探究USP12在NSCLC中的具體調(diào)控機(jī)制。針對(duì)USP12在NSCLC中的深入研究可能為靶向去泛素化酶家族在肺腺癌中的治療提供更多依據(jù)。