熱回流法提取米糠中植物甾醇的工藝優(yōu)化及分離純化

孫莉莉，王維宇，王振強(qiáng)*，王皓

1. 黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院（開封 475004）；2. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院（天津 300457）

米糠主要是由果皮、種皮、外胚乳、糊粉層和胚加工制成的，是稻谷深加工的主要副產(chǎn)品[1]。我國是世界上最大的稻米生產(chǎn)國，稻谷產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的37%左右[1]，年產(chǎn)稻谷2億 t以上，占全國糧食產(chǎn)量的42%。我國米糠年產(chǎn)量約1 000萬 t[2]，是一種量大而廣的可再生資源。但是一般情況下米糠的利用率只有10%～15%，主要用于生產(chǎn)米糠油、肌醇、植酸和谷維素等。據(jù)測定，米糠中含有豐富的植物甾醇，研究顯示，每天攝入1.3 g植物甾醇，搭配合理膳食，可改善血脂異常。植物甾醇是一種活性成分，具有營養(yǎng)價(jià)值高、生理活性強(qiáng)等特點(diǎn)[3]，能夠有效維持體內(nèi)膽固醇平衡的作用，減少心血管病的風(fēng)險(xiǎn)，被科學(xué)家們譽(yù)為生命的鑰匙，被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域[4]。植物甾醇具有良好的抗氧性，可作食品添加劑、動(dòng)物生長劑原料，促進(jìn)動(dòng)物生長，增進(jìn)動(dòng)物健康[4]。該研究從米糠中提取植物甾醇具有方法簡單、成本較低、提取效率高等特點(diǎn)，為稻谷深加工的主要副產(chǎn)品——米糠的綜合利用和植物甾醇綜合開發(fā)提供理論支撐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，河南山信糧業(yè)集團(tuán)；植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇、無水乙醇、磷酸、濃硫酸、氫氧化鈉、丙酮、三氯化鐵、正己烷等試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；SP-2102UV型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BS224s型電子天平，北京市奧多利斯系統(tǒng)有限公司；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

準(zhǔn)確稱取一定量的米糠，干燥，粉碎，采用不同孔徑的篩網(wǎng)過篩后備用。

1.3.2 植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫磷鐵法測吸光度。準(zhǔn)確稱取10 g FeCl3·6H2O，充分溶解于磷酸中，定容至100 mL；配制10%的三氯化鐵溶劑，置于棕色瓶中；取1.5 mL 10%的三氯化鐵溶劑置于100 mL棕色定量瓶內(nèi)，加濃硫酸定容至刻度。準(zhǔn)確稱取一定量的植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解，混合均勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mg/mL的溶液[5]，分別加入3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度。以植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]，如圖1所示。線性方程為y=0.861 6x-0.057 6，R2=0.999 1。

1.3.3 植物甾醇得率計(jì)算

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定植物甾醇得率，按式（1）計(jì)算。

圖1 植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

式中：V為測定液樣品的體積，mL；C為植物甾醇的質(zhì)量濃度，mg/mL；M為稱取的植物甾醇提取物樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 植物甾醇提取的單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 提取溶劑的影響

準(zhǔn)確稱取5 g米糠，篩網(wǎng)孔徑0.125 mm，料液比1：14（g/mL），分別加入70 mL乙醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷等提取溶劑，溫度80 ℃，時(shí)間6 h，進(jìn)行提取。提取完成后，對(duì)提取液進(jìn)行過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、烘干，經(jīng)石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析不同的溶劑對(duì)植物甾醇得率的影響。

1.3.4.2 提取溫度的影響

準(zhǔn)確稱取5 g米糠，篩網(wǎng)孔徑0.125 mm，料液比1：14（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度分別為50，60，70，80和90 ℃，時(shí)間6 h，進(jìn)行提取。提取完成后，對(duì)提取液進(jìn)行過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、烘干，經(jīng)石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析提取溫度對(duì)植物甾醇得率的影響。

1.3.4.3 提取時(shí)間的影響

準(zhǔn)確稱取5 g米糠，篩網(wǎng)孔徑0.125 mm，料液比1：14（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度80℃，時(shí)間分別為2，4，6，8和10 h，進(jìn)行提取。提取完成后，對(duì)提取液進(jìn)行過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、烘干，經(jīng)石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析提取時(shí)間對(duì)植物甾醇得率的影響。

1.3.4.4 料液比的影響

準(zhǔn)確稱取5 g米糠，篩網(wǎng)孔徑0.125 mm，料液比分別為1：8，1：10，1：12，1：14和1：16（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度80 ℃，時(shí)間6 h，進(jìn)行提取。提取完成后，對(duì)提取液進(jìn)行過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、烘干，經(jīng)石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析料液比對(duì)植物甾醇得率的影響。

1.3.4.5 篩網(wǎng)孔徑的影響

分別選用孔徑為0.425，0.250，0.180，0.150和0.125 mm的篩網(wǎng)對(duì)米糠過篩，準(zhǔn)確稱取5 g，料液比1：14（g/mL），加入70 mL乙酸乙酯溶劑，溫度80℃，時(shí)間6 h，進(jìn)行提取。提取完成后，對(duì)提取液進(jìn)行過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、烘干，經(jīng)石油醚溶解，取0.3 mL溶液，加4.7 mL無水乙醇、3 mL磷酸鐵試劑，振蕩混勻，在波長520 nm處測吸光度，分析篩網(wǎng)孔徑對(duì)植物甾醇得率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間、料液比、篩網(wǎng)孔徑4個(gè)因素，以植物甾醇得率為考察指標(biāo)，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)因數(shù)水平

1.3.6 分離純化

1.3.6.1 皂化-萃取提純

將提取液真空干燥后添加乙醇（95%）溶劑，充分溶解后，按料液比1：10（g/mL）加入氫氧化鈉，溫度70 ℃，皂化時(shí)間5 h，進(jìn)行皂化反應(yīng)，對(duì)植物甾醇提取物初步純化。皂化結(jié)束后，對(duì)皂化液進(jìn)行離心，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到植物甾醇粗提物。選擇石油醚為萃取劑，對(duì)皂化后的粗提物連續(xù)萃取3次，對(duì)植物甾醇提取物進(jìn)一步純化。

1.3.6.2 重結(jié)晶提純

利用甲醇作為溶劑，采用升溫溶解、降溫結(jié)晶的方式，對(duì)皂化-萃取提純后的植物甾醇提取物進(jìn)行重結(jié)晶提純。按表2配制5組甲醇-植物甾醇提取物（液料比）樣品，分別加入一定量的甲醇，升溫溶解，混合均勻后，放入冰箱5 ℃冷藏，放置24 h后，抽濾，用冷甲醇沖洗濾餅及產(chǎn)品，于50 ℃真空干燥，每組樣品重結(jié)晶3次，分析甲醇與提取物的液料比對(duì)植物甾醇重結(jié)晶提純的影響。

表2 甲醇-植物甾醇提取物的液料比

2 結(jié)果與分析

2.1 植物甾醇提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑的影響

由圖2可知，采用乙醇、乙酸乙酯、石油醚和正己烷作為提取溶劑，植物甾醇得率的大小順序?yàn)橐宜嵋阴ィ臼兔眩菊和椋疽掖?，乙酸乙酯的提取效果明顯優(yōu)于其他試劑。綜合分析，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對(duì)植物甾醇得率的影響

2.1.2 提取溫度的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的增大，植物甾醇得率逐漸提高；當(dāng)溫度為80 ℃時(shí)，植物甾醇得率最大；再增大提取溫度，植物甾醇得率緩慢減小[7]。這是因?yàn)樵龃筇崛囟饶軌虼龠M(jìn)植物甾醇的有效溶出；提取溫度過高，可能導(dǎo)致植物甾醇的穩(wěn)定降低。綜合分析，選擇提取溫度80 ℃比較合適。

圖3 提取溫度對(duì)植物甾醇得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間的影響

由圖4可知，隨著時(shí)間的增加，植物甾醇得率逐漸增大[7]。當(dāng)提取時(shí)間為6 h時(shí)，植物甾醇得率基本趨于穩(wěn)定；再延長提取時(shí)間，植物甾醇得率增加不明顯。這是因?yàn)檠娱L提取時(shí)間有利于植物甾醇提取，隨著提取的進(jìn)行，各物質(zhì)的濃度逐漸減小，再延長提取時(shí)間，提取效果增加不明顯。綜合分析，選擇提取時(shí)間6 h比較合適。

2.1.4 料液比的影響

由圖5可知，隨著料液比的增加，植物甾醇得率逐漸提升。當(dāng)料液比為1：14（g/mL）時(shí)，植物甾醇得率比較高；之后再增大溶劑用量，植物甾醇得率增加不明顯。這是因?yàn)樘崛￠_始階段，增加溶劑用量有利于植物甾醇的有效溶出；當(dāng)提取進(jìn)行到一定程度時(shí)，各物質(zhì)的濃度比較小，繼續(xù)增加溶劑用量，植物甾醇得率提升不明顯。綜合分析，選擇料液比1：14（g/mL）比較合適[8]。

圖4 提取時(shí)間對(duì)植物甾醇得率的影響

圖5 料液比對(duì)植物甾醇得率的影響

2.1.5 篩網(wǎng)孔徑的影響

由圖6可知，篩網(wǎng)孔徑為0.125 mm時(shí)，植物甾醇得率最大，隨著篩網(wǎng)孔徑的增大，植物甾醇得率逐漸減小，當(dāng)篩網(wǎng)孔徑增大到0.150 mm時(shí)，再繼續(xù)增大篩網(wǎng)孔徑，植物甾醇得率急劇降低。這是因?yàn)?，篩網(wǎng)孔徑越大，米糠過篩后顆粒越大，提取時(shí)越不利于植物甾醇的有效溶出。綜合分析，篩網(wǎng)孔徑為0.125 mm比較合適。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，熱回流法從米糠中提取植物甾醇的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即提取溫度70 ℃、提取時(shí)間6 h、料液比1：14（g/mL）、篩網(wǎng)孔徑0.125 mm；提取溫度、提取時(shí)間、料液比、目數(shù)等因素對(duì)植物甾醇得率的影響主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即提取時(shí)間＞篩網(wǎng)孔徑＞提取溫度＞料液比。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，植物甾醇得率為4.43 mg/g。

圖6 篩網(wǎng)孔徑對(duì)植物甾醇得率的影響

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，提取時(shí)間對(duì)結(jié)果具有顯著性影響（p＜0.05），提取溫度、料液比和目數(shù)對(duì)結(jié)果無顯著性影響（p＞0.05）[9]。

表4 方差分析結(jié)果

2.3 分離純化

2.3.1 皂化-萃取提純

經(jīng)皂化反應(yīng)、初步提純，采用石油醚為萃取劑，連續(xù)萃取3次，對(duì)植物甾醇提取物進(jìn)一步純化，植物甾醇含量為12.21%。

2.3.2 重結(jié)晶提純

利用甲醇作為溶劑，對(duì)皂化-萃取提純后的植物甾醇提取物進(jìn)行重結(jié)晶提純，每組試樣重結(jié)晶3次，結(jié)果見表5。不添加甲醇溶劑時(shí)，植物甾醇含量較低，但是植物甾醇收率比較高；添加甲醇溶劑后，隨著甲醇溶劑的增加，植物甾醇含量逐漸提升，但是植物甾醇收率較低。綜合分析，當(dāng)甲醇-植物甾醇提取物液料比為3：1（mL/g）時(shí)，重結(jié)晶提純效果最好，植物甾醇含量為67.31%。

表5 重結(jié)晶提純結(jié)果

3 結(jié)論

熱回流法從米糠中提取植物甾醇的最佳工藝條件為A2B2C3D3，即提取溫度70 ℃、提取時(shí)間6 h、料液比1：14（g/mL）、篩網(wǎng)孔徑0.125 mm。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，植物甾醇得率為4.43 mg/g；提取溫度、提取時(shí)間、料液比、目數(shù)對(duì)植物甾醇得率的影響主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即提取時(shí)間＞篩網(wǎng)孔徑＞提取溫度＞料液比；提取時(shí)間對(duì)結(jié)果具有顯著性影響（p＜0.05），提取溫度、料液比和篩網(wǎng)孔徑對(duì)結(jié)果無顯著性影響（p＞0.05）。經(jīng)皂化反應(yīng)、初步提純，采用石油醚為萃取劑，多次萃取，對(duì)植物甾醇提取物進(jìn)一步純化，植物甾醇含量為12.21%；在此基礎(chǔ)上，利用甲醇作為溶劑，進(jìn)行重結(jié)晶提純，當(dāng)甲醇-植物甾醇提取物的液料比為3：1（mL/g）時(shí)，重結(jié)晶提純效果最好，植物甾醇含量為67.31%。