胰蛋白酶水解制備綠豆分離蛋白多肽的工藝

張玉霞*，梁瓊，黎淵珠，鄒亞男，薛梅，梁麗琴

1. 海南工商職業(yè)學(xué)院海洋學(xué)院（?？?570203）；2. 海南省食品藥品檢驗所?？诜炙ê？?570311）；3. 海南科技職業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院（?？?571126）4. 山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（臨汾 041004）

胰蛋白酶是人體及動物體內(nèi)普遍存在的一種蛋白水解酶[1]，胰蛋白酶在pH 5.0時最穩(wěn)定，可在低溫下貯存數(shù)周而不喪失活性；低于此pH時酶易變性；當pH 高于5.0時，酶易自溶而失去活性[2-3]。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對有堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨酸）的羧基所組成的肽鍵有著高度的特異性[4]。胰蛋白酶不僅能水解肽鍵，而且也能水解酰氨鍵和酯鍵[5]。對其催化水解活性的敏感度為酯鍵＞酰銨鍵＞肽鍵[6]。用其來水解提取綠豆中的蛋白質(zhì)，所得到的蛋白質(zhì)有利于人體的吸收消化[7]，并可以直接用于制作飲料、果凍、糕點等食品，且無其他副作用，可促進食品工業(yè)的發(fā)展。

試驗以綠豆磨粉為原料，用胰蛋白酶進行酶解，在酶解pH、溫度（T）和[酶]/[底物]（[E]/[S]）等單因素試驗基礎(chǔ)上，對水解條件進行正交試驗，以確定胰蛋白酶提取綠豆蛋白的最佳條件。然后，對在最佳提取條件下得到的綠豆蛋白溶液進行凝膠過濾層析法純化，最后用純化的綠豆蛋白樣品做SDS-PAGE電泳，測得其中所含的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。此次試驗結(jié)果可以為綠豆蛋白的加工和利用提供理論的依據(jù)，從而帶來很好的經(jīng)濟效益。

1 材料與試驗方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試劑與材料

綠豆磨粉（臨綠一號綠豆，九陽料理機磨粉）；胰蛋白酶（USA進口、上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠）；牛血清白蛋白（Mr 6700、上海宏觀生化技術(shù)有限公司）；考馬斯亮藍G 250（上海綠島科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)）；丙烯酰胺（C3H5HO、中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站）；N, N’-甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2、中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司）；Sephadex G-200（上?；瘜W(xué)試劑廠）；低分子量標準蛋白（Sigma公司，電泳純）；上述試劑均為分析純品。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

TGL-16G-A型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV-7504C紫外分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；LG10-2.4A型高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；BSZ-160自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠）；HL-2恒流泵（上海嘉鵬科技有限公司）；DYY-2C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYCZ-24D垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）；KQ50型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XWT-S系列小型臺式記錄儀（上海自動化儀表股份有限公司）；層析實驗冷柜（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；1×50 Z形層析柱（上海亞榮生化儀器廠）；HD-2001-B-C核酸蛋白檢測儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 綠豆磨粉蛋白含量及綠豆蛋白溶液多肽含量的測定

采用凱氏定氮法[8]進行測定。

1.2.2 綠豆蛋白多肽制備率的計算[9]

1.2.3 單因素法測定最佳水解條件[10-11]

1.2.3.1 最佳水解溫度的測定

取10支試管，在各管加入0.5 g綠豆粉和9 mL pH 8.5的緩沖液，每兩管為一平行組，分別編號為30，37，40，45和50 ℃，在每個試管中加入1 mL 0.5%胰蛋白酶液，搖勻后分別置于各溫度的水浴鍋中反應(yīng)9h，時間到后取出置于100 ℃的水浴鍋中滅酶10 min，冷卻后以8 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液槍取10 μL，加990 μL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍溶液，2 min后在595 nm下測定吸光度。

1.2.3.2 最佳水解時間的測定[12]

取22支試管，在各管中加入0.5 g綠豆面和9 mL pH 8.5的緩沖液，每兩管為一平行組，分別按2，4，6，8，10，11，12，13，14，15和16 h編號，在每個試管中加入1 mL 0.5%胰蛋白酶液，整個反應(yīng)體系為10 mL，使酶/底物濃度比為1%，搖勻后置于37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)。到時間后分別取兩管置于100 ℃的水浴鍋中滅酶10 min，冷卻，以8 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液槍取10 μL，加990 μL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍溶液，2 min后在595 nm下測定吸光度。

1.2.3.3 最佳水解pH的測定

取14支試管，在各管加入0.5 g綠豆粉，每兩管為一平行組，分別加入pH 7，7.5，8，8.5，9，9.5和10的緩沖液各9 mL，加1 mL 0.5%的酶液，置于37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)9 h，時間到后分別取出置于100 ℃的水浴鍋中滅酶10 min，冷卻，以8 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液槍取10 μL，加990 μL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍溶液，2 min后在595 nm下測定吸光度。

1.2.3.4 最佳[酶]/[底物]的測定

取10支試管，在各管加入0.5 g綠豆粉和9 mL pH 8.5的緩沖液，每兩管為一平行組，分別編號為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%，在0.5%組的試管中加入0.5 mL 0.5%胰蛋白酶液，1%的加入1 mL，1.5%的加入1.5 mL，2%的加入2 mL，2.5%的加入2.5mL，搖勻后分別置于37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)9 h，時間到后取出置于100 ℃的水浴鍋中滅酶10 min，冷卻后以8 000 r/min離心10 min，取上清液定容至10 mL。用移液槍取10 μL，加990 μL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍溶液，2 min后在595 nm下測定吸光度。

1.2.4 正交試驗測定最佳水解條件[13-15]

在單因素試驗基礎(chǔ)上，分別為4個因素設(shè)置3個合適的水平，因素水平如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.5 凝膠層析法純化綠豆蛋白多肽[16-18]

將凝膠預(yù)處理后裝柱（試驗所選用的柱子型號為0.9 cm×30 cm），根據(jù)預(yù)計的床體積，稱取所需的Sephadex G-100干凝膠放入錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，然后置于沸水浴中煮沸2 h。加樣時要求平整的柱床平面，用滴管將清蛋白（約5 mL）緩慢而均勻地加到柱床表面，待樣品滲入后，用滴管沿柱壁向柱內(nèi)加入少量的洗脫液，待洗脫液距柱床表面1～2 mm時，再用滴管加入約4 cm的洗脫液，接上恒壓洗脫瓶開始洗脫，并馬上打開調(diào)整好的收集器開始收集，流速為5 mL/（6 min·管），收集30管。用同樣的方法將球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白層析純化；樣品全部收集后，在280 nm波長處測定其吸光度，并繪制洗脫曲線。

1.2.6 綠豆多肽的超濾膜分離[19-20]

配制5%濃度的綠豆多肽酶解液，首先用截留分子質(zhì)量為5 kDa的超濾膜進行一級超濾處理，壓力0.18 MPa。其次用截留分子質(zhì)量為1 kDa的超濾膜對濾過液進行二次處理，壓力為0.21 MPa。

1.2.7 綠豆蛋白多肽的氨基酸組成分析[21]

在最佳工藝條件下制備綠豆蛋白多肽，采用高效液相色譜儀測定其氨基酸組成。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 溫度、時間、pH、[酶]/[底物]對綠豆蛋白提取率的影響

2.1.1 溫度對提取率的影響

從圖1可以看出，在37 ℃時，胰蛋白酶對綠豆蛋白多肽的制備率較高，而低于或是高于37 ℃時，提取率都很低。任何酶反應(yīng)都有其最適的溫度范圍，低溫使酶的活性基團發(fā)生鈍化，隨著溫度的升高，酶的活性基團逐漸被釋放，而當溫度超過最適溫度時，隨著溫度的升高，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，活性下降，提取率亦隨之下降。胰蛋白酶在37 ℃時活性最高，這與人和動物的體溫環(huán)境較為吻合，能夠較好地消化食物中的蛋白質(zhì)。

圖1 溫度對綠豆蛋白多肽制備率的影響

2.1.2 時間對提取率的影響

從圖2可以看出，在15 h之前隨著水解時間的延長，綠豆蛋白多肽的制備率增長趨勢顯著，近似正比關(guān)系；在15 h之后，水解增長趨勢減緩。這主要是因為隨著水解時間的延長，水解產(chǎn)物的濃度逐漸增大，過高的產(chǎn)物濃度會對水解反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。

圖2 時間對綠豆蛋白多肽制備率的影響

2.1.3 pH對提取率的影響

從圖3可以看出，在堿性條件下，綠豆蛋白的提取率隨著pH的升高而增加，在pH 8.5之前呈正比增長，pH 8.5之后增長趨勢較緩慢，增長量很小。因此，在pH 8.5的條件下提取較為合適。

圖3 pH對綠豆蛋白多肽制備率的影響

2.1.4 [酶]/[底物]對提取率的影響

從圖4可以看出，隨著[酶]/[底物]的增加，綠豆蛋白的提取率也在增加，在1.5%之前，提取率的增長較快，而在1.5%之后，提取率的增長較緩慢。這主要因為在底物濃度不能被酶完全飽和時，提取率隨[酶]/[底物]的增加而呈正比增加，但當酶濃度逐漸增加到底物濃度不能使其飽和時，提取率不再隨其呈正比增加。

圖4 [酶]/[底物]對綠豆蛋白多肽制備率的影響

2.2 正交試驗確定酶解條件的最佳組合

從表2可以看出，4個因素對胰蛋白酶水解制備綠豆蛋白多肽的影響程度大小依次為A＞B＞D＞C，其最佳組合為A3B3C3D3，即溫度37 ℃，時間15 h，pH 9，酶/底物2%。此外時間越長，水解越徹底，提取率越高，但考慮到這樣耗時，于生產(chǎn)益處不大，酶量大有利于提取率的提高，但是這樣也會增加成本，且增加能耗，從表2可以看出，當酶/底物比為2%時，制備率與1.5%時相比并沒有較大的提高。故適宜的酶解條件為溫度37 ℃，時間15 h，pH 9，酶/底物1.5%。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 凝膠層析

從圖5可以看出，從1～38管之間均有吸光度，即均含有蛋白質(zhì)，高峰管為16～21管之間，從1～38管中選取幾管用作SDS-PAGE電泳。

圖5 綠豆蛋白的層析圖譜

2.4 超濾膜分離綠豆蛋白多肽

綠豆蛋白水解液經(jīng)超濾膜超濾分離，共得到3個分子質(zhì)量組分的多肽，分別為＜1 kDa，1～5 kDa以及＞5 kDa。對3個組分進行比例分析，其所占比例分別為35.63%，56.24%及8.13%，這說明胰蛋白酶酶解后的綠豆蛋白多肽的分子質(zhì)量大多＜5 kDa，有利于人體吸收。

2.5 綠豆蛋白中氨基酸組成

綠豆蛋白在酸水解過程中，色氨酸被破壞，天冬酰胺和谷氨酰胺被水解成天冬氨酸和谷氨酸，因而表3中天冬氨酸和谷氨酸的含量都很高。與8種必需氨基酸的FAO/WHO推薦值相比，綠豆蛋白中的Val（纈氨酸）、Ile（異亮氨酸）、Leu（亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）及Lys（賴氨酸）含量分別都比較高，除了Cys（半胱氨酸）含量較低外，其余必需氨基酸含量均接近或達到FAO/WHO推薦值，整體氨基酸含量較均衡，因而具有蛋白質(zhì)開發(fā)應(yīng)用價值。

表3 綠豆蛋白的氨基酸組成及含量 單位：g/100 g蛋白

3 結(jié)論

1) 綠豆磨粉在胰蛋白酶作用下水解生成綠豆水解蛋白液，其最佳水解條件為酶解溫度37 ℃，pH 9.0，時間15 h。[酶]/[底物]1.5%。在此條件下，胰蛋白酶1次制備綠豆蛋白多肽的提取率可達60.50%。

2) 利用超濾膜對綠豆多肽酶解液超濾分離，共得到3個分子質(zhì)量組分的多肽，分別為＜1 kDa，1～5 kDa以及＞5 kDa。對3個組分進行比例分析，其所占比例分別為35.63%，56.24%及8.13%，這說明胰蛋白酶酶解后的綠豆蛋白多肽的分子質(zhì)量大多＜5 kDa，有利于人體吸收。

3) 高效液相色譜分析綠豆蛋白多肽的氨基酸組成，將結(jié)果與8種必需氨基酸的FAO/WHO推薦值相比，綠豆蛋白多肽中的Val（纈氨酸）、Ile（異亮氨酸）、Leu（亮氨酸）、Phe（苯丙氨酸）及Lys（賴氨酸）含量分別都比較高，除了Cys（半胱氨酸）含量較低外，其余必需氨基酸含量均接近或達到FAO/WHO推薦值，整體氨基酸含量較均衡。