基于核磁共振技術(shù)比較四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉的化學(xué)成分

韓君 李厚聰 張志鋒

【摘 要】 目的：基于核磁共振技術(shù)比較四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉的化學(xué)成分。方法：對(duì)四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉進(jìn)行紅外吸收光譜（IR）、紫外吸收光譜（UV）及核磁共振（NMR）波譜（包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC）進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：分析其UV和IR譜圖特征吸收峰對(duì)應(yīng)的基團(tuán)，并對(duì)其1H NMR和13CNMR信號(hào)進(jìn)行了歸屬，分析了其化學(xué)成分。結(jié)論：該研究將為厚樸的其它相關(guān)研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】 厚樸;核磁共振（NMR）;紅外吸收光譜（IR）;紫外吸收光譜（UV）;1H-1H COSY;1H-13C HSQC

Abstract：Objective Comparison of Chemical Components of Water-Extracted Freeze-dried Powder of Root Bark and Stem Bark of Mangnolia Officinalis Produced in Sichuan based on Nuclear Magnetic Resonance.Method The water-extracted freeze-dried powder of magnolia officinalis root bark and stem bark produced in Sichuan will be measured with infrared absorption spectrum（IR）， ultraviolet absorption spectrum （UV） and nuclear paramagnetic resonance spectrum （NMR） （including 1H NMR，13C NMR，1H-1H COSY，1H-13C HSQC） in this paper.Result To analyze their groups corresponding to characteristic absorption peak of UV and IR spectrogram， classify their 1H and 13CNMR signals and analyze their chemical components.Conclusion The research will provide a reference for other relevant studies of magnoliae officinalis.

Keywords：Magnolia officinalis Rehd. et Wils.; NMR; IR; UV; 1H-1H COSY; 1H-13C HSQC

厚樸藥材規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中，按來源將厚樸劃分為溫樸和川樸2種，按取皮部位再劃分為4種規(guī)格筒樸、蔸樸、根樸、枝樸，每一種規(guī)格又按長(zhǎng)度和質(zhì)量劃分一等、二等、三等、四等若干等級(jí)[1-2]。厚樸規(guī)格等級(jí)劃分主要是以性狀特征、特征圖譜、揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性化學(xué)成分差異為依據(jù)[3]，然而特征圖譜需要大量標(biāo)準(zhǔn)品以及現(xiàn)有研究缺少對(duì)厚樸相關(guān)化合物的多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑及其規(guī)律的研究，操作性不強(qiáng)，揮發(fā)性成分由于其成分復(fù)雜， 其中性質(zhì)相似的組分保留時(shí)間較為接近， 色譜峰重疊嚴(yán)重， 較難準(zhǔn)確定性和定量[4];依據(jù)性狀特征劃分商品規(guī)格等級(jí)，這種方法是否有科學(xué)內(nèi)涵又值得商榷[5]。

核磁共振技術(shù)（NMR）具有良好的分析復(fù)雜成分的能力，近年來廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)和復(fù)雜成分分析，并取得了良好的效果[6-8]，其中有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道采用一維NMR光譜對(duì)厚樸進(jìn)行相關(guān)研究[9]，但一維NMR方法譜峰分離不佳譜圖上識(shí)別不了更多的化學(xué)基團(tuán)，二維NMR譜除了包含一維NMR譜中的信息，還含有更多的結(jié)構(gòu)信息[10]。本研究應(yīng)用核磁共振技術(shù)1HNMR、13CNMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC對(duì)四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉進(jìn)行化學(xué)成分分析，彌補(bǔ)了化學(xué)分析中特征圖譜需要大量標(biāo)準(zhǔn)品以及現(xiàn)有研究缺少對(duì)厚樸相關(guān)化合物的多級(jí)質(zhì)譜的裂解途徑及其規(guī)律的研究。臨床中厚樸入藥的形式多為水煎煮湯劑，故本研究對(duì)水提物化學(xué)成分進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與軟件

Bruker AVANCEII 500MHz超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀（瑞士布魯克公司），5mm核磁管（美國(guó)Norell公司）;臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）;BSA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;UV-2550紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）;Spectrum Two FI-IR Spectrometer（PerkinEImer公司）;NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1軟件處理。

1.2 材料與試劑 收集四川省共8份厚樸樣本，由西南民族大學(xué)張志鋒教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.，詳細(xì)信息見表1;氘代二甲基亞砜 （DMSO-d6）購(gòu)自美國(guó)CIL公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 稱取厚樸樣品60g置于圓底燒瓶中加水1000mL，加熱回流1h，提取液于65℃減壓濃縮，濃縮液冷凍干燥，取固體粉末10mg至NMR樣品管中，加入氘代二甲基亞砜0.6mL溶解，3500r/min離心5min，移液槍取上清液轉(zhuǎn)移至NMR樣品管中用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 NMR實(shí)驗(yàn)條件1H和13C-NMR的工作頻率分別為500.13和125.95MHz，實(shí)驗(yàn)溫度為25℃，譜寬分別為12376.24和35971.22Hz。1H-1H COSY和1H-13C HSQC實(shí)驗(yàn)分別采用COSYGPMFQF和HSQCEDETGPSI標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序。1H-1H COSY的F2維（1H）和F1維（1H）譜寬均為5000Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=2048×256，累加次數(shù)為16;HSQC的F2維（1H）和F1維（13C）譜寬分別為5000Hz和25155Hz，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣t2×t1=1024×256，累加次數(shù)為16[11]。NMR譜圖通過Bruker Topspin 4.0.8及MestReNova 9.0.1軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 厚樸根皮水提凍干粉的UV與IR分析 厚樸根皮水提物的紫外吸收光譜的譜圖上（圖1）可以清晰見到兩個(gè)吸收帶，205nm為強(qiáng)吸收帶（K帶），是分子中共軛烯烴的吸收帶，屬于π→π*躍遷。284nm為弱吸收帶（R帶），是分子中羰基的吸收帶，屬于n→π*躍遷。紅外吸收光譜在波數(shù)3381、1075cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羥基;在波數(shù)2932、1413cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有亞甲基和甲基;在波數(shù)1608cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羰基基團(tuán);在波數(shù)1506、914cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有烯烴;在波數(shù)1270、1230cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有醚鍵;在波數(shù)820cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有苯環(huán);3150～3260cm-1區(qū)間應(yīng)該還有一個(gè)vC=C-H烯烴碳?xì)涞纳炜s振動(dòng);在990cm-1附近未出現(xiàn)一個(gè)明顯的端烯的特征峰，從該譜圖推知（圖2），含有magnoloside B類似物的特征峰，同樣也含有厚樸酚類似物的羥基、烯烴、亞甲基、苯環(huán)等特征峰。

2.2 厚樸根皮水提凍干粉的NMR分析 根皮水提凍干粉的核磁測(cè)試溶劑：氘代DMSO-d6。它的核磁共振氫譜（圖3）信號(hào)盡管比較復(fù)雜，但依然可辨相對(duì)主要的信號(hào)。它的氫譜在芳香區(qū)域顯示一組典型的1，2，4-三取代苯環(huán)信號(hào)：6.93 （2H， m）、6.79 （1H， d， J=8.8 Hz），在烯烴信號(hào)區(qū)域檢測(cè)到一組乙烯基：5.93 （1H， m）、5.06 （1H，br d，J=17.0Hz）、5.00 （1H， br d， J=10.0Hz），此外在高場(chǎng)區(qū)檢測(cè)到一個(gè)積分值為兩個(gè)氫的寬雙峰信號(hào)：3.27 （2H， br d， J=6.7Hz）。它的碳譜（圖4）也檢測(cè)到一系列信號(hào)，借助二維核磁HSQC信號(hào)（圖5），可辨識(shí)高場(chǎng)區(qū)一個(gè)亞甲基碳信號(hào)：38.7;源于乙烯基的兩個(gè)碳：115.1、138.2;苯環(huán)上的三個(gè)次甲基碳：115.9、127.8、131.1。在二維核磁1H，1H-COSY譜中（圖6），觀察到高場(chǎng)處的那個(gè)亞甲基雙峰信號(hào)與乙烯基氫信號(hào)均有相關(guān)，以及苯環(huán)上由于3J耦合而產(chǎn)生的相關(guān)信號(hào)?；谏鲜鲆痪S、二維核磁圖譜的仔細(xì)分析，可得出該結(jié)構(gòu)中含有苯丙素結(jié)構(gòu)單元，考慮到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提示該結(jié)構(gòu)存在對(duì)稱因素——即完全對(duì)稱的苯丙素二聚體，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，最終確定上述核磁信號(hào)與厚樸酚結(jié)構(gòu)（1）（圖7）是吻合的。

此外，在氫譜中還檢測(cè)到一組微量的、但是可以辨識(shí)的反式烯氫信號(hào)：6.30 （1H， d， J=15.8Hz）、7.47 （1H， d， J=15.8Hz），提示很可能來源于肉桂?；?在高場(chǎng)區(qū)可見雙峰甲基信號(hào)：1.12 （3H， d， J=6.0Hz），借助HSQC譜可知該甲基的碳信號(hào)位于17.8ppm，在1H，1H-COSY譜觀察到該甲基雙峰與3.77的連氧氫信號(hào)有耦合，提示微量成分中很可能含有鼠李糖片段。在氫譜的3.0～4.0ppm、碳譜的60～85ppm區(qū)間可見若干來源于糖上的信號(hào)，氫碳譜的芳香區(qū)也有若干信號(hào)，考慮到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，推測(cè)根皮水提凍干粉中還含有微量的苯乙醇苷類成分，如magnoloside A、magnoloside B。但由于在提取物中的占比相對(duì)微量，尚不能做到準(zhǔn)確的定性。

四川產(chǎn)厚樸根皮水提凍干粉的主要成分是厚樸酚，微量成分為苯乙醇苷類。

2.3 厚樸干皮水提凍干粉的UV與IR分析 厚樸干皮水提取的紫外吸收光譜的譜圖上（圖1）可以清晰見到三個(gè)吸收帶，204nm為強(qiáng)吸收帶（K帶），是分子中共軛烯烴的吸收帶，屬于π→π*躍遷。284nm為弱吸收帶（R帶），是分子中羰基的吸收帶，屬于n→π*躍遷。322nm為弱吸收帶（R帶），是分子中共軛羰基的吸收帶，共軛結(jié)構(gòu)使能量下降，吸收光發(fā)生了紅移，屬于n→π*躍遷。紅外吸收光譜在波數(shù)3393、1074cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羥基;在波數(shù)2934、1418cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有亞甲基和甲基;在波數(shù)1607cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有羰基基團(tuán);在波數(shù)1516cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有烯烴;在波數(shù)1269cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有醚鍵;在波數(shù)814cm-1處有吸收，表明樣品分子中含有苯環(huán)。該紅外譜圖中同樣能在3150～3260cm-1區(qū)間觀察到一個(gè)被掩蓋掉的強(qiáng)吸收峰，在990cm-1附近細(xì)看可隱約觀察到一個(gè)待出的的端烯峰，從該譜圖（圖2）推知，含有magnoloside B類似物的特征峰，同樣也含有厚樸酚類似物的羥基，烯烴，亞甲基，苯環(huán)等特征峰以及隱約的端烯峰，因此該譜圖應(yīng)含有magnoloside B及厚樸酚類似物。

2.4 厚樸干皮水提凍干粉的NMR分析 干皮水提凍干粉的核磁測(cè)試溶劑：氘代DMSO-d6。在氫譜（圖3）中檢測(cè)到一組特征性的反式烯氫信號(hào)：6.30 （1H， d， J=15.8Hz）、7.47 （1H， d， J=15.8Hz），在6.55～7.15ppm區(qū)間可見多組苯環(huán)的1，2，4-三取代芳?xì)湫盘?hào)，在3.6～4.0ppm未見芳甲醚信號(hào)，可推斷上述信號(hào)來源于咖啡?；?在高場(chǎng)區(qū)檢測(cè)到雙峰甲基信號(hào)：1.12 （3H， d， J=6.0Hz），借助HSQC譜（圖5）確定該甲基的碳信號(hào)位于17.7ppm，在1H，1H-COSY譜（圖6）觀察到該甲基雙峰與3.78的連氧氫信號(hào)有耦合，提示了鼠李糖片段的存在。在氫譜的2.63ppm處檢測(cè)到連苯環(huán)的亞甲基信號(hào)，通過HSQC譜確定該亞甲基的碳信號(hào)位于35.1ppm，在1H，1H-COSY譜中觀察到該亞甲基氫與3.52/3.80處有相關(guān)，可初步推斷為苯乙醇苷類。在氫譜的5.53ppm處檢測(cè)到一個(gè)耦合常數(shù)為2.9Hz的三重峰，這是吡喃阿洛糖C-3位氫的診斷性信號(hào)，大幅度低場(chǎng)位移提示了阿洛糖的C-3位羥基與咖啡酸成酯。此外，在4.0～5.0ppm區(qū)間可見多個(gè)阿洛糖端基氫、葡萄糖端基氫以及鼠李糖端基氫信號(hào)，前兩者為耦合接近8Hz的雙峰，后者呈現(xiàn)寬單峰，在氫譜的3.0～4.0ppm、碳譜的60～85ppm區(qū)間可見若干來源于糖上的信號(hào)。考慮到厚樸已報(bào)道化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，調(diào)研相關(guān)文獻(xiàn)中的核磁數(shù)據(jù)，可確定干皮水提凍干粉中富含苯乙醇苷類成分，如magnoloside A、magnoloside B或它們的結(jié)構(gòu)類似物。由于該類成分的核磁信號(hào)異常復(fù)雜，又是多個(gè)類似結(jié)構(gòu)的混合物，未能確定具體的苯乙醇苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

此外，它的核磁共振氫譜中在烯烴信號(hào)區(qū)域依稀可辨一組乙烯基：5.93 （1H， m）、5.06 （1H， br d， J=17.0Hz）、5.00 （1H， br d， J=10.0Hz），這是厚樸酚的特征性信號(hào)。盡管信號(hào)非常微弱，但對(duì)它的結(jié)構(gòu)定性是可靠的。

四川產(chǎn)厚樸干皮水提凍干粉富含苯乙醇苷類成分，此外依稀可見微量的厚樸酚。

2.5 四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉NMR變量數(shù)據(jù)差異性檢驗(yàn) 選擇SPSS軟件對(duì)四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉NMR變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用平方歐式距離作為厚樸根皮和干皮間距離的計(jì)算方式。

由表2可知，P值為0.987，大于0.05，故根皮組內(nèi)的的數(shù)據(jù)沒有差異性。

由表3可知，P值為0.976，大于0.05，故干皮組內(nèi)的的數(shù)據(jù)沒有差異性。

由表4可知，在萊文方差等同性檢驗(yàn)中，P值為0.134，大于0.05，所以選擇等方差的數(shù)據(jù)。在平均值等同性t檢驗(yàn)中，P值為0.012，小于0.05，所以可以認(rèn)為根皮和干皮組之間存在差異。四川產(chǎn)厚樸根皮和干皮水提凍干粉聚類分析結(jié)果如圖8所示。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 常規(guī)1H-NMR中水峰信號(hào)很強(qiáng)，溶劑信號(hào)雖然弱些，但相對(duì)于除水峰以外的其它信號(hào)仍然很大。上述信號(hào)不僅直接影響了對(duì)所處區(qū)域其它信號(hào)的觀測(cè)，更主要是由于水峰和溶劑信號(hào)構(gòu)成了核磁共振中自由衰減信號(hào)的主體，必然會(huì)抑制低濃度組分信號(hào)的信噪比改善[12]。

預(yù)飽和方法是所有壓制水峰的方法中最方便，效果也最好的方法。針對(duì)樣品的自身特殊性和實(shí)驗(yàn)的目的要求，確定了以雙溶劑預(yù)飽和脈沖序列為獲取1H-NMR圖譜的技術(shù)手段，該脈沖序列具有對(duì)多組信號(hào)進(jìn)行選擇性壓制功能[12]如圖9所示。脈沖序列：RD-90°-t1-90°-tm-90°-FID參數(shù)：t1為2.4s、混合時(shí)間tm為100ms、譜寬10000Hz、累加次數(shù)為32。

3.2 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)對(duì)四川產(chǎn)厚樸根皮與干皮水提凍干粉進(jìn)行紅外吸收光譜（IR）、紫外吸收光譜（UV）及核磁共振（NMR）波譜（包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC）進(jìn)行了測(cè)定，分析了其UV和IR譜圖特征吸收峰對(duì)應(yīng)的基團(tuán)，并對(duì)其1H NMR和13C NMR信號(hào)進(jìn)行了歸屬，上述波譜學(xué)數(shù)據(jù)說明了四川產(chǎn)厚樸根皮水提凍干粉的主要成分是厚樸酚，微量成分為苯乙醇苷類，厚樸干皮水提凍干粉富含苯乙醇苷類成分，此外依稀可見微量的厚樸酚，其中水溶性成分苯乙醇苷被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于厚樸之中，并由于其突出的生物活性而引起了更多的關(guān)注，比如止痙攣的作用、酶抑制效果、抗氧化性[13]。值得注意的是，在早期研究中，苯乙醇苷和厚樸苷A均在胃腸功能障礙動(dòng)物模型中均表現(xiàn)出明顯的療效[14]，這意味著苯乙醇苷可能有助于厚樸藥材發(fā)揮臨床效果。因此，明確了厚樸干皮與根皮生物活性成分差異，為合理選擇厚樸不同藥用部位作為原材料開發(fā)不同功效的藥物提供參考。同時(shí)該研究為建立中藥厚樸不同規(guī)格核磁共振化學(xué)信息提供參考資料，亦為中藥厚樸規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定提供基礎(chǔ)資料。

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