蘭坪烏骨綿羊黑色素及其候選基因研究進(jìn)展

岳 丹,劉興能,熊和麗,2,和曉明,彭超超,朱俊紅,鄧衛(wèi)東*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201;2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650201)

綿羊不僅是生產(chǎn)肉和毛的重要農(nóng)業(yè)牲畜之一，還是生物學(xué)和比較基因組學(xué)研究的理想動(dòng)物模型。與普通綿羊比，蘭坪烏骨綿羊的皮膚、肌肉、骨骼、內(nèi)臟顏色均較深(黑色)[1]，與烏骨雞相關(guān)研究一致，該顏色是由于存在過多的黑色素所致[2]。并且蘭坪烏骨綿羊的深色特征在雜交試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)具有遺傳現(xiàn)象[3]。烏骨烏肉特征主要依賴于其體內(nèi)含有豐富的黑色素，前人做了大量試驗(yàn)，并推測蘭坪烏骨綿羊真黑色素的沉積受多基因調(diào)控[4]。如果能進(jìn)一步從分子水平探明黑色素合成機(jī)理并找出其主效基因，將有利于黑色素在動(dòng)物體內(nèi)的沉積，更有利于黑色素產(chǎn)品的開發(fā)與利用，從而推動(dòng)黑色素的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。

1 黑色素的形成

Berzelius于1840年首次使用黑色素(Melanin)這一名稱[5]。天然黑色素是一類含氮高聚物，由酚酞和吲哚類物質(zhì)經(jīng)過氧化聚合而成的生物色素[6]。主要分黑/棕色的真黑素和紅/黃色的脫黑素兩種類型，兩類的區(qū)別在于是否含有硫原子，不含硫原子的為黑/棕色的真黑色素；含有硫原子的為紅/黃色的脫黑色素[7]。目前已有研究表明，黑色素細(xì)胞的形成經(jīng)歷四個(gè)階段：黑色素小體形成、黑色素小體成熟、黑色素合成和黑色素小體轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。黑色素細(xì)胞的合成過程如圖1所示。

黑色素小體起始于黑色素細(xì)胞內(nèi)的多囊泡內(nèi)體(multivesicular endosomes/bodies，MVBs)。色素細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)前黑色素小體蛋白(premelanosome protein，PMEL)在MVBs中經(jīng)加工形成淀粉樣纖維基質(zhì)，誘導(dǎo)黑色素的原纖維產(chǎn)生[9]。研究表明原纖維的擴(kuò)展促進(jìn)了未成熟黑色素小體的延長[10]，因此，依賴PMEL的原纖維形成是黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素小體延長所必需的。其次，酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(tyrosinase-related protein 1,TRP-1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(tyrosinase-related protein 2,TRP-2)的活性是黑色素合成的關(guān)鍵因素，在黑色素小體成熟階段，TYR、TRP-1、TRP-2選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)至黑色素小體[11]。眼白化病基因(ocular albinism 1，OA1)能在黑色素小體的膜和內(nèi)吞溶酶體中表達(dá)，影響其與前黑色素小體蛋白17(premelanosome protein 17，PMEL 17)的相互作用進(jìn)而影響黑色素小體的結(jié)構(gòu)[12]。OA1基因編碼的OA1蛋白是一種黑色素小體膜蛋白，具有連接溶酶體和黑色素小體的作用[13]；黑色素瘤T細(xì)胞抗原(melanoma antigen recognized by T-cells 1，MART-1 或MLANA)與PMEL 17相互結(jié)合形成復(fù)合體，影響黑色素小體的成熟[10]；膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(membrane associated transporter protein，MATP)也對黑色素小體的成熟有重要影響，主要會(huì)導(dǎo)致黑色素小體形成紊亂，造成黑色素含量減少[12]。以上研究顯示，黑色素小體的有效成熟以及酪氨酸酶等物質(zhì)的活性與黑色素的合成有著密切的相關(guān)性，阻斷黑色素小體的成熟是減少黑色素合成的關(guān)鍵。α-黑色素細(xì)胞刺激激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)與黑皮質(zhì)激素-1受體(melanocortin-1 receptor，MC-1R)結(jié)合可誘導(dǎo)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)增加從而引發(fā)小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)的表達(dá)上調(diào)，MITF編碼的產(chǎn)物主要調(diào)控TYR、TRP-1和TRP-2的活性，進(jìn)而促進(jìn)真黑色素的合成[14-16]。在黑色素小體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，OA1基因起著關(guān)鍵作用，黑色素-黑色素小體運(yùn)輸?shù)街車慕琴|(zhì)細(xì)胞受OA1基因的調(diào)控，每個(gè)成熟的黑色素-黑色素小體與周圍的角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成一個(gè)功能單位，由每個(gè)功能單位共同來完成黑色素的運(yùn)輸與代謝[17]。同時(shí)，GTPase家族蛋白RAB27A以及效應(yīng)因子黑色素親和素SLAC2A和肌動(dòng)蛋白相關(guān)的肌球蛋白Va(114-116)形成三聚體的復(fù)合物是黑色素轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵，并且研究表明MITF基因編碼的產(chǎn)物能促進(jìn)RAB27A蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響黑色素的轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。

2 影響蘭坪烏骨綿羊的相關(guān)基因

2.1 酪氨酸酶(TYR)基因家族

黑色素的合成受一系列酶學(xué)反應(yīng)的控制，TYR是黑色素合成的關(guān)鍵酶[19]。在黑色素的合成過程中，除了對TYR的活性有要求外，對TYR同源基因的酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TYRP-1)和酪氨酸相關(guān)蛋白2(TYRP-2)的需求也是必需的[20]。Saranggarajan 等[21]研究表明，TYRP-1影響黑色素細(xì)胞的增殖和黑色素小體的成熟；TYRP-1還參與黑色素小體結(jié)構(gòu)的完整性并影響黑色素細(xì)胞的增殖和凋亡[22]。黑色素細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，ASP通過拮抗a-MSH抑制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)在黑色素細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制TYRP-1和TYRP-2的表達(dá)量，降低了真黑色素的合成量[23]。

表1 TYR基因家族影響蘭坪烏骨綿羊黑色素合成代謝的研究Table 1 TYR gene family affects melanin anabolic metabolism in Lanping black-bone sheep

Deng[3,24-25]研究顯示蘭坪烏骨綿羊比蘭坪普通綿羊有顯著高的酪氨酸酶活力和血漿比色。李文[26]通過對TYR基因的A945G和C1440G位點(diǎn)設(shè)計(jì) PCR-SSCP 檢測 TYR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的基因型與綿羊毛色沒有顯著差異。王鑫玉[27]的試驗(yàn)顯示高活力的TYR導(dǎo)致總黑色素和真黑色素合成顯著增多、蘭坪烏骨綿羊血漿比色顯著高于普通綿羊，但對綿羊毛色并無顯著差異。蘭坪烏骨綿羊組織器官中黑色素含量與綿羊毛色深淺成正比關(guān)系，但是血漿中總黑色素的含量與毛色并無這一規(guī)律。所以可以推斷，影響烏骨烏肉形成的黑色素沉積機(jī)制是區(qū)別于影響皮膚毛囊之外的機(jī)制或多者兼而有之，還有待進(jìn)一步研究討論。曹繡娟[28]對TYRP1基因的C1107T、C1107T和A1470C位點(diǎn)互作效應(yīng)對蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀進(jìn)行研究，其結(jié)果與Li等[29]一致，蘭坪烏骨綿羊的組織器官中黑色素及相關(guān)色素含量高于普通綿羊與羅姆綿羊的結(jié)果并不是由于TYRP1基因編碼SNP的變異造成的；譚玉文[23]研究顯示TYRP2基因的A605G位點(diǎn)在各種毛色綿羊之間沒有顯著性差異。與何奕多等[30]研究一致，TYR、TYRP1、TYRP2三個(gè)基因在蘭坪烏骨綿羊和蘭坪普通綿羊中的表達(dá)量無顯著差異。前人做了大量TYR基因家族與黑色素合成的相關(guān)性研究，顯示TYR基因家族與蘭坪烏骨綿羊被毛顏色和烏骨烏肉特征沒有顯著關(guān)聯(lián)。但在黑色素合成過程中毋庸置疑TYR基因家族起著十分重要的作用。

2.2 RAB基因家族

Rab蛋白是膜相關(guān)GTP酶中的大家族，Rab蛋白與GTP結(jié)合可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸，但與GDP結(jié)合失去活性。大量研究表明Rab-GTP酶家族在控制黑小體的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)中起十分重要的作用[31-33]。

表2 RAB基因家族影響蘭坪烏骨綿羊黑色素合成代謝的研究Table 2 RAB gene family affects melanin anabolic metabolism in Lanping black-bone sheep

膜相關(guān)GTP酶家族中的一員RAB21基因編碼的RAB21蛋白。RAB21蛋白被Varp的 VPS9 結(jié)構(gòu)域激活后，調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞樹突的形成。RAB21基因的突變可能導(dǎo)致RAB21蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而對黑色素細(xì)胞樹突的形成造成影響，進(jìn)而導(dǎo)致黑小體轉(zhuǎn)運(yùn)至周圍的角質(zhì)細(xì)胞[34]。將蘭坪烏骨綿羊與普通綿羊RAB21基因的EX1-A90G、EX2-A207T以及EX3-T237C多態(tài)位點(diǎn)的基因型與血漿中黑色素含量指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果蘭坪烏骨綿羊的雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量均高于普通綿羊。在相同基因型不同綿羊類群中，除總黑色素外，蘭坪烏骨綿羊其他指標(biāo)(血漿比色、TYR活性等)均高于普通綿羊。在EX2-A207T位點(diǎn)處，只存在于蘭坪烏骨綿羊中AA基因型綿羊的血漿比色含量顯著高于TA和TT型，因此可推斷AA基因型為蘭坪烏骨綿羊的優(yōu)勢基因[35]。

He等[36]基于牛或其他哺乳動(dòng)物和高度同源的綿羊EST的保守序列信息，克隆了蘭坪烏骨綿羊RAB2A、RAB3A和RAB7A基因的編碼序列并對確定的核苷酸序列進(jìn)行了序列分析和必要的功能分析。結(jié)果顯示，蘭坪烏骨綿羊RAB2A基因在心臟、肝臟、腎臟、背最長肌和腿部肌肉組織中適度表達(dá)，而在脾臟和皮膚組織中幾乎無表達(dá)；蘭坪烏骨綿羊RAB3A基因在脾臟和肝臟中活躍，在心臟、腎臟、腿部肌肉、背最長肌和皮膚中無表達(dá)；蘭坪烏骨綿羊RAB7A基因在肝臟中過表達(dá)，在心臟、脾臟、腎臟、背最長肌和皮膚中表達(dá)較弱，而在腿部肌肉中則幾乎不表達(dá)。研究表明，RAB7A基因可通過調(diào)節(jié)溶酶體降解來控制細(xì)胞的生長、遷移和分化，從而控制表皮生長因子和表皮生長因子受體復(fù)合物的內(nèi)吞運(yùn)輸，RAB7A的GTP結(jié)合形式還通過調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞的成熟來促進(jìn)黑色素生成[37]。但崔嘉[38]的研究顯示RAB7A基因G805A 位點(diǎn)的多態(tài)性與蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀于毛色沒有顯著關(guān)聯(lián)，RAB7A基因的表達(dá)豐度與蘭坪烏骨綿羊各組織中黑色素含量是否相關(guān)需進(jìn)一步研究。以上研究表明，RAB基因家族對蘭坪烏骨黑色素合成的影響存在種間關(guān)系，具體的影響機(jī)理還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.3 SLC基因家族

陳禹翰[39]利用RNA-Seq技術(shù)，分析檢測蘭坪烏骨綿羊和普通綿羊的SNP，發(fā)現(xiàn)在谷胱甘肽代謝通路(Ko00480)中，酶 EC2.5.1.18 為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。過量谷胱甘肽(GSH)能夠在體內(nèi)多巴醌多巴向下一代谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(r-GTP)半胱氨酸多巴的行動(dòng)中迅速形成谷胱甘肽多巴，谷胱甘肽多巴會(huì)導(dǎo)致黑色素的表達(dá)水平下調(diào)。而SLC7A11基因編碼的蛋白質(zhì)(xCT)負(fù)責(zé)將細(xì)胞外的胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，直接調(diào)節(jié)毛發(fā)中黑素細(xì)胞脫色素的產(chǎn)生[40]。老鼠而SLC7A11基因突變后xCT蛋白缺失，直接影響毛色由紅色變?yōu)榛疑@著降低了毛發(fā)中脫黑色素的含量，但奇怪的是真黑色素含量不受影響[40]。假設(shè)敲除SLC7A11基因或?qū)SH與其他化合物作用，減少谷胱甘肽多巴的形成，進(jìn)而減少其對黑色素生成的影響，因此是否會(huì)使蘭坪烏骨綿羊黑色素沉積增加，還需要進(jìn)一步研究。Lamason[41]研究顯示，SLC24A5基因在黑色素合成過程中對其pH有相應(yīng)影響，但崔嘉[42]研究表明，SLC24A5基因在烏骨綿羊中存在 6 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，3個(gè)位于內(nèi)含子上，還有2個(gè)錯(cuò)義突變 ( G762C 和 G805A) 和 G933A 同義突變位于外顯子處。SLC24A5基因的多態(tài)位點(diǎn)對蘭坪烏骨綿羊的烏質(zhì)特征并無顯著影響。就現(xiàn)有的研究顯示，SLC基因家族對蘭坪烏骨綿羊黑色素的形成無顯著關(guān)聯(lián)。

2.4 黑皮質(zhì)素受體1(MC1R)基因

MC1R基因編碼的MC1R蛋白通過腺苷酸環(huán)化酶調(diào)控黑色素的合成種類，是影響黑色素形成的重要基因之一。Deng[25]對MC1R基因的整個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行了測序，并發(fā)現(xiàn)了A12G和G144C兩個(gè)沉默突變位點(diǎn)。PCR-RFLP結(jié)果顯示，GG基因型羊比CC基因型羊在混合羊組中表現(xiàn)出更高的酪氨酸酶活性。具有GG和GC基因型的綿羊在蘭坪烏骨綿羊中表現(xiàn)出顯著的黑色被毛，然而CC基因型的綿羊在普通綿羊中其主要的繁殖特性總是呈現(xiàn)白色被毛。該發(fā)現(xiàn)與以前的研究結(jié)果相似，即黑皮膚中的酪氨酸酶活性強(qiáng)于白皮膚。因此，等位基因G和C可能分別有助于高酪氨酸酶活性的表達(dá)。舒文[43]研究表明，MC1R與Agouti信號蛋白(ASIP)之間的相互作用對酪氨酸酶蛋白家族(TYR、TYRPl、TYRP2)的3個(gè)酶活性的表達(dá)水平有重要影響，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)蘭坪烏骨綿羊和蘭坪普通綿羊MC1R基因的頻率差異不顯著?？梢酝茰yMC1R基因不是影響蘭坪烏骨綿羊毛色和烏質(zhì)性狀的主效基因。

2.5 小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)

MITF基因是小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，早在1993年小鼠MITF基因被克隆并發(fā)現(xiàn)其基因位于mi位點(diǎn)[44]。小鼠中該基因的結(jié)構(gòu)基因由9個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼由419個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的MITF蛋白[45]。研究發(fā)現(xiàn)，MITF基因?qū)谏丶?xì)胞存活、遷移、繁殖和分化起著決定性作用[46]。Kijas等[47]關(guān)于MITF基因在藏羊的研究表明，MITF表達(dá)可以影響黑色素沉積，從而影響被毛顏色。李春艷等[48]的研究利用MITF基因在蘇尼特羊(典型的季節(jié)性發(fā)情品種)和小尾寒羊(典型的常年發(fā)情品種)的組織表達(dá)特征在不同繁殖狀態(tài)下綿羊各組織中的表達(dá)差異以及該基因表達(dá)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系。采樣下丘腦等組織，通過 PCR 技術(shù)探索MITF基因在不同繁殖狀態(tài)下綿羊不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，MITF基因在兩個(gè)綿羊品種的不同組織中有表達(dá)，并且在子宮、輸卵管及卵巢中表達(dá)量較高。宛夢雅[49]采用100 只蘭坪烏骨綿羊、96只蘭坪普通綿羊血液，測定血漿酪氨酸酶活力、黑色素含量等血液生化指標(biāo)。通過對MITF基因的擴(kuò)增，結(jié)果顯示烏骨綿羊與普通綿羊MITF基因的C491T位點(diǎn)處，具有CC基因型的綿羊酪氨酸酶活力、脫黑色素、堿溶性黑色素和血漿比色的值顯著高于綿羊AA和TC型，因此可推測CC基因型為烏骨綿羊的主要基因型，但具體影響機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

2.6 其他基因

Xi等[50]克隆了蘭坪烏骨綿羊Sfxn1，Snai2和Cno基因的完整編碼序列并進(jìn)行了序列分析和組織表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)蘭坪烏骨綿羊Sfxn1基因在腎臟中高度表達(dá)，在心臟、肝臟和腿部肌肉中中度表達(dá)，在脾、背最長肌和皮膚幾乎沒有表達(dá)；蘭坪烏骨綿羊Snai2基因在脾臟和腎臟中過表達(dá)，在心臟、肝臟和背最長肌中弱表達(dá)，腿部肌肉和皮膚幾乎沒有表達(dá)；蘭坪烏骨綿羊Cno基因在脾臟、腎臟和腿部肌肉中表達(dá)，在心臟、肝臟、背最長肌和皮膚中幾乎不表達(dá)。綿羊Sfxn1、Snai2和Cno基因與牛的Sfxn1、Snai2和Cno基因具有高度同源性并具有相同域。這意味著綿羊和牛的Sfxn1、Snai2和Cno基因表現(xiàn)出類似的功能。試驗(yàn)表明，綿羊Sfxn1、Snai2和Cno基因編碼的蛋白比牛的遺傳關(guān)系更緊密。這說明它們的功能在不同物種又有所不同。這意味著即使它們在一個(gè)個(gè)體或一個(gè)物種中，不同的基因也具有不同的進(jìn)化模式。

本課題組研究影響黑色素合成代謝主要因素的結(jié)果表明，蘭坪烏骨綿羊中TYR基因是影響黑色素沉積的主要原因，TYR酶活性對黑色素有限制作用；RAB基因家族的表達(dá)豐度可能與烏質(zhì)性狀存在關(guān)聯(lián)；SLC基因家族就目前的報(bào)道來看，與黑色素的形成沒有顯著關(guān)聯(lián)，但SLC7A11與GST互作效應(yīng)對蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的影響需進(jìn)一步研究。目前，本課題組正在積極探索基因?qū)豕蔷d羊控制烏質(zhì)性狀的機(jī)理進(jìn)行試驗(yàn)。

3 研究展望

蘭坪烏骨綿羊有著與烏骨雞一樣的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，雖然本課題組就蘭坪烏骨綿羊黑色素生成的途徑做了大量相關(guān)試驗(yàn)，但目前控制蘭坪烏骨綿羊?yàn)踬|(zhì)性狀的主效基因尚未確定，也沒有探明黑色素相關(guān)功能基因之間的相互關(guān)系，并對黑色素集中擴(kuò)散的機(jī)制仍然處在探索與推測階段。對黑色素相關(guān)功能基因的研究，還需要進(jìn)一步從分子水平找到主效基因，進(jìn)而闡明相關(guān)基因之間的相互關(guān)聯(lián)，為蘭坪烏骨綿羊的保護(hù)、開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。