消除食品背景雜菌干擾的金黃色葡萄球菌分離方法的改進

區(qū)楚君，尚岱麒，吳酉芝，2，施春雷*

（1 上海交通大學農業(yè)與生物學院 上海200240 2 上海中僑職業(yè)技術大學 上海201319）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下簡稱為金葡菌）一直以來都是我國監(jiān)測的主要食源性致病菌之一。金葡菌之所以受到廣泛的關注，是由于越來越多的案例證實，其不僅在食品中引起人群食物中毒和乳制品污染，而且在醫(yī)療過程中頻繁引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染，導致許多疾病難以完全治愈。金葡菌一般均具有較強的菌膜形成能力，使其廣泛地存在于自然界的各種環(huán)境中，甚至人畜共患[3-4]。同時，菌膜被認為是耐藥性傳播的一種潛在載體，近年來日益凸顯的細菌耐藥性問題使得越來越多研究者的目光投向具有強菌膜形成能力的金葡菌。多項研究發(fā)現(xiàn)金葡菌存在多重耐藥現(xiàn)象[5]，可能成為細菌耐藥性傳播的載體[6]，導致更加嚴重的耐藥性問題。由此，金葡菌被世界衛(wèi)生組織列為“高危害”監(jiān)控對象[7]，我國也逐步提高了對金葡菌的重視程度。

監(jiān)控金葡菌的前提是能夠有效鑒別、分離食品中的金葡菌。試驗中一般依據(jù)GB 4789.10-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》分離、鑒定食品基質中的金葡菌。該方法的主要步驟為：將待檢測的食品放入無菌袋中，加入7.5%氯化鈉肉湯進行增菌培養(yǎng)，然后根據(jù)Baird-Parker 瓊脂平板和血平板上劃線培養(yǎng)后的特異性現(xiàn)象鑒別、分離金葡菌。然而，本實驗室研究人員前期試驗發(fā)現(xiàn)，當檢測冷凍肉（尤其是雞肉）及肉制品時，常會出現(xiàn)一層灰色物質覆蓋在Baird-Parker 瓊脂平板上，改變了培養(yǎng)平板上可疑菌落的表觀形態(tài)（如圖1c所示），嚴重影響研究人員依據(jù)國標進行結果判定的準確性，由此引起誤判而導致出現(xiàn)大量的假陰性結果。初步判斷該物質為冷凍食品中污染的另一類背景雜菌，具有生長速度快（快于金葡菌）且擴散性強的特性，不僅影響人眼判定的結果，而且在后續(xù)試驗中無法分離單菌落，難以獲得較好的純化結果。同時該雜菌也存在溶血現(xiàn)象，在血平板上的培養(yǎng)特征與金葡差異性不大，會產生大量的假陽性結果，因此本試驗不采用血平板作為選擇性平板。為了解決此類食品中存在雜菌污染無法分離金葡菌的問題，本研究根據(jù)金葡菌的生物學特性和其它文獻研究，優(yōu)化國家標準中的增菌方法，引入改良后的胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）平板分離雜菌及純化金葡菌單菌落，以降低假陰性結果的出現(xiàn)，避免多次純化而造成試驗資源的浪費。

圖1 金葡菌受背景雜菌干擾時在Baird-Parker 平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of S.aureus on Baird-Parker plate with the interference of background flora

有研究表明，金葡菌具有耐鹽性，在10%～15%的高鹽環(huán)境中也能生長良好[8]，且在食品中提高鹽濃度一直以來被視為抑制雜菌生長的有效手段。本試驗通過提高增菌液中氯化鈉質量分數(shù)來抑制雜菌的生長，以此改變金葡菌與雜菌的相對豐度，使得金葡菌成為增菌液中的優(yōu)勢菌，更易分離。同時，金葡菌可耐受低濃度的乙醇，0～1.5%乙醇對金葡菌生長無顯著影響[9]，甚至在2.5%～3.5%的乙醇脅迫下，金葡菌的菌膜形成能力會增加[10]。而乙醇作為一種常見的殺菌手段，絕大部分的雜菌對乙醇敏感。據(jù)此，將一定量的乙醇加入胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）平板中，可以達到抑制雜菌生長的作用。除了抑制雜菌生長外，在應對雜菌的擴散性上，考慮增加TSA 中瓊脂的含量，使其難以在培養(yǎng)基中發(fā)生遷移，實現(xiàn)雜菌的分離與金葡菌的純化。本文研究以上3 個因素（增菌液中氯化鈉質量分數(shù)、TSA 中乙醇的添加量和瓊脂的添加量）對雜菌的影響，以期實現(xiàn)抑制雜菌生長和擴散，降低金葡菌分離中出現(xiàn)假陰性結果的可能性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗中涉及的金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 29213、ATCC 43300、Newman、SJTUF 21456、SJTUF 21510 以及分離純化后的雜菌，均為本實驗室保存菌株。

Baird-Parker 瓊脂（BP）、胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）、7.5%氯化鈉肉湯，北京陸橋技術股份有限公司；95%乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LB 平板（10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉、15 g/L 瓊脂）；細菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5424D 型微量臺式離心機、Mastercycler 型PCR 擴增儀，德國Eppendorf 公司；ES-315 型高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 公司；ZQZY-CF 型全溫恒溫培養(yǎng)搖床，上海知楚儀器有限公司；Sunrise 酶標儀，瑞士Tecan 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及工作菌液的制備 取出-80℃超低溫冰箱保存的菌株，使用接種環(huán)在TSA 平板上劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18～24 h。在平板上挑取單菌落轉接至TSB 中，于37℃，200 r/min 條件下在搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10～12 h。取出后，10 000 r/min 離心30 s，棄去上清液，用0.85%氯化鈉的生理鹽水清洗沉淀，重復離心和清洗沉淀2 次，最后調節(jié)菌液的OD600nm 值為0.8 ±0.02。

1.3.2 確定接種比例將ATCC 29213 和雜菌調節(jié)至一致的OD600nm值，按1∶2，1∶1，2∶1 的比例，接種至10 mL 7.5%氯化鈉肉湯中，于37℃，200 r/min 條件下在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。稀釋后涂步于BP 平板上，監(jiān)測2 種菌競爭生長情況，根據(jù)菌落計數(shù)法的結果確定最終的接種比例。

1.3.3 增菌液優(yōu)化設置3 種分別含7.5%，10%，15%氯化鈉的肉湯。將ATCC 29213 和雜菌按1.3.2 節(jié)確定好的比例接種至10 mL 含有不同質量分數(shù)氯化鈉的肉湯中，設置為試驗組。并把1 μL 的ATCC 29213 菌液接種至10 mL 含有不同氯化鈉質量分數(shù)的肉湯中，設置為對照組。把2 組菌液同時置于37℃，200 r/min 條件下的搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)結束后，劃線于BP 平板，監(jiān)測2 組的污染程度，根據(jù)菌落計數(shù)法的結果確定增菌效果。

1.3.4 TSA 分離平板優(yōu)化 根據(jù)實驗室標準，用單因素試驗的方法確定瓊脂質量分數(shù)、乙醇體積分數(shù)以及培養(yǎng)時間每個因素的取值范圍，并設計了如表1所示的正交試驗。以擴散半徑、計數(shù)法和劃線情況對比評價分離效果。其中，在平板中心處點種，培養(yǎng)結束后測量3 處中心點至菌落邊緣的長度，然后取平均值作為擴散半徑。

表1 正交試驗設計Table 1 The design of orthogonal test

1.3.5 驗證性試驗

1.3.5.1 普適性試驗 將本實驗室保存的菌株ATCC 43300、Newman、SJTUF 21456、SJTUF 21510活化后，按1.3.2 節(jié)確定好的比例將純種金葡菌菌株與雜菌混合，然后接種至優(yōu)化后的氯化鈉肉湯中，驗證優(yōu)化后的方法的分離效果。

1.3.5.2 采樣分離試驗 隨機選取不同的采樣點進行食品樣品的采集工作，檢測優(yōu)化后的方法在實際應用中的分離鑒定效果。

1.3.5.3 雜菌種、屬鑒定 將雜菌劃線于改良后的TSA 平板上，挑取單菌落接種至TSB 中，于37℃，200 r/min 條件下在搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10～12 h。使用細菌基因組DNA 提取試劑盒完成DNA 提取。

通過16S rDNA 測序的方法確定雜菌的種、屬，通用引物序列為：27F 5’-AGAGTTT GATCMTGGCTCAG-3’，1492R 5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。相對應的PCR 反應參數(shù)為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s；54℃復性30 s；72℃延伸90 s；72℃復性和延伸10 min；35個循環(huán)。

2 結果與討論

2.1 確定接種比例

BP 平板培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)不同混合接種比例的雜菌都覆蓋了整個平板表面（培養(yǎng)結果沒有明顯區(qū)別，故未放圖）。雜菌的接種比例越高，平板上的污染越明顯，越難以通過人眼辨別金葡菌菌落的典型狀態(tài)。而3 種混合接種比例（1∶2，1∶1，2∶1）分別對應的平板上的金葡菌菌落數(shù)為1.1×107，1.5×107，7.5×106 CFU/mL。根據(jù)雜菌在BP 平板上的污染程度以及金葡菌的菌落總數(shù)，確定本試驗中純種金葡菌和雜菌的混合接種比例為1∶1。

2.2 增菌液優(yōu)化結果

從BP 平板上的培養(yǎng)結果（表2）可以看出，10%氯化鈉肉湯比7.5%氯化鈉肉湯能夠分離出更多的金葡菌。

表2 使用不同氯化鈉質量分數(shù)的肉湯增菌后的平板計數(shù)結果Table 2 Colony counting results after enrichment with different NaCl mass fraction

通過計數(shù)法得到的培養(yǎng)結果顯示，使用7.5%氯化鈉肉湯增菌，對照組培養(yǎng)得到的菌落總數(shù)比試驗組更多，說明金葡菌的生長受到了雜菌的影響。已有研究表明，金葡菌很難與基質中的其它微生物菌群競爭生長，即便是在更利于金葡菌生長的環(huán)境中，其它菌群也能夠以包括營養(yǎng)競爭作用、拮抗作用和改變基質環(huán)境（如競爭消耗提供營養(yǎng)的底物、產生有機酸降低pH 值、增加氧氣的消耗以改變氧濃度和氧化還原電位等）在內的多種方式成為優(yōu)勢菌[11]。

氯化鈉質量分數(shù)增加至10%，試驗組的計數(shù)結果為4.13×107CFU/mL，對照組的計數(shù)結果為4.10×107CFU/mL，兩者間相差不大，由此可以看出，氯化鈉質量分數(shù)高對金葡菌的生長影響并不明顯，而對雜菌的抑制作用更強，使其與金葡的競爭能力下降。已有研究表明，金葡菌菌膜形成相關基因——icaA 在鹽濃度較高的情況下表達量上升[12]，更有利于菌膜形成[13]，由此可減少高鹽濃度的影響。同時，在高氯化鈉質量分數(shù)的刺激下，金葡菌細胞質膜中的脂質成分也會出現(xiàn)變化，雙磷脂酰甘油的合成量上升[14]。此外，金葡菌菌體也會產生相應的應激改變，如細胞體積變大、表面積減小、細胞壁的厚度和重量增加等[15]。這些鹽脅迫反應都能夠減弱高氯化鈉質量分數(shù)對金葡菌生長的影響，增加金葡菌對10%氯化鈉的耐受性。

然而當氯化鈉質量分數(shù)為15%時，無論是BP平板的劃線結果還是計數(shù)結果都表明金葡與雜菌均受到強烈的抑制，僅有少數(shù)菌體幸存。

2.3 TSA 分離平板優(yōu)化結果

表3的試驗結果表明，在培養(yǎng)基中添加乙醇和瓊脂，金葡菌生長不受抑制；而試驗組1～5 的擴散半徑均大于0.2 cm，且劃線結果顯示雜菌和金葡菌無法分離，表明雜菌擴散的程度較高。對比試驗組6 和試驗組9，雜菌生長受到抑制，然而試驗組6 的擴散半徑較大，表明該分離平板條件對雜菌擴散性的抑制作用較差。從整體試驗結果來看，試驗組9 的分離效果最佳，不僅抑制了雜菌的生長，同時也有效地抑制了雜菌的擴散。

表3 TSA 分離平板優(yōu)化效果評價Table 3 Evaluation on the optimization effect of TSA separation plate

2.4 驗證性試驗

普適性試驗結果顯示，4 種金葡菌（ATCC 43300、Newman、SJTUF 21456、SJTUF 21510）在BP 平板上均能被有效辨識，菌落數(shù)分別為5，14，6，6 CFU。在后續(xù)的的分離純化步驟中，金葡菌能夠在改良后的TSA 平板上形成單菌落，如圖2所示，同時雜菌與金葡菌明顯分離，沒有出現(xiàn)擴散現(xiàn)象。

圖2 4 株金黃色葡萄球菌在改良TSA 平板上的菌落形態(tài)Fig.2 The colony morphology of 4 strains on the modified TSA plates

把優(yōu)化后的方法用于實際樣品的分離、鑒定試驗中，通過對比可以看到，食品基質中的金葡菌分離率由2.61%提升為19.98%（表4）。這些實際案例表明該優(yōu)化方法有效地降低了假陰性結果的出現(xiàn)。

表4 方法改進前、后金葡菌分離情況對比Table 4 Comparison of separation of S.aureus before and after the improvement of the method

通過細菌16S rDNA 測序方法鑒定了該雜菌的種屬，結果顯示該雜菌為奇異變形桿菌。

盡管冷鏈儲存和運輸在一定程度上防止了食品的腐敗，但其后不恰當?shù)谋４婧褪圪u方式卻引發(fā)了嚴重的奇異變形桿菌污染。這個問題可能成為未來冷藏和冷凍食品保藏的一大挑戰(zhàn)。

3 結論

從冷凍肉及肉制品中分離金葡菌時，增菌液中氯化鈉質量分數(shù)提高到10%可以有效地抑制背景雜菌的生長，而對金葡菌影響不大。當BP 平板上出現(xiàn)嚴重的雜菌擴散污染時，可挑取疑似菌落劃線于含有2%乙醇和4%瓊脂的TSA 平板上，靜置培養(yǎng)18 h，由此可使金葡菌與雜菌完全分離。利用這一改進的方法，可有效降低假陰性結果的出現(xiàn)。