食源性金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

吳任之，胡欣潔，韓國(guó)全，易艷，舒佳新，曹陽(yáng)，余東梅，趙俊梅，張翼，張雨薇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 食品加工與安全研究所， 四川 雅安， 625014)

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院和社區(qū)中最常見(jiàn)的病原菌之一[1]，常存在于人體鼻腔和皮膚，其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶，可引起人類患上壞死性肺炎、菌血癥等疾病[2]。不同部位分離出的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)具有多樣性和系統(tǒng)性的區(qū)別[3-4]，能引起嚴(yán)重的皮膚及軟組織感染[5-6]。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件常發(fā)生于世界各國(guó)[7-8]。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，金黃色葡萄球菌引起的食源性感染僅次于大腸桿菌[9]。在中國(guó)20%～25%的細(xì)菌性食物毒事件是由金黃色葡萄球菌引起的，2002年—2015年學(xué)校食源性金黃色葡萄球菌疾病暴發(fā)食物中毒事件占9.58%[10-11]?？傮w上看國(guó)內(nèi)外由金黃色葡萄球菌及其毒素引起的食物中毒事件的發(fā)生率在前4位左右。

食品中金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)分離技術(shù)雖是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但前增菌、平板分離、純化鑒定等步驟耗時(shí)4～7 d，菌株分離判別大多借助于肉眼，主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和靈敏度較低[12]，在應(yīng)對(duì)突發(fā)性食品安全事件上，不能滿足快速、準(zhǔn)確、靈敏和特異性高等要求。在食品抽檢方面，每年食品抽檢數(shù)量巨大，部分食品采用三級(jí)采樣方案，傳統(tǒng)分離技術(shù)較難滿足檢驗(yàn)需求。鑒于食源性金黃色葡萄球菌感染的高風(fēng)險(xiǎn)性和嚴(yán)重性，建立特異性高、準(zhǔn)確、快速的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法具有重要意義。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

目前我國(guó)食品中金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢測(cè)》，但標(biāo)準(zhǔn)中推薦的Baird-Parker瓊脂平板不能檢測(cè)出卵黃反應(yīng)為陰性的金黃色葡萄球菌，部分菌株受食品基質(zhì)、加工條件、稀釋液溫度等的影響，菌落外觀可能較粗糙、質(zhì)地較干燥，有出現(xiàn)漏檢、誤檢的可能。姚貴哲等[13]利用傳統(tǒng)檢測(cè)方法與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)快速檢測(cè)方法，對(duì)動(dòng)物食品中金黃色葡萄球菌的分離結(jié)果表明，前者的分離率較后者低25.8%。值得注意的是，王利剛等[14]將全自動(dòng)熒光免疫分析儀(mini-VIDAS)和膜芯片法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的特異性和靈敏性較高。因此，建議在GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢測(cè)》的基礎(chǔ)上，參照2020年版《中國(guó)藥典》將甘露醇氯化鈉瓊脂或顯色培養(yǎng)基與Baird-Parker瓊脂結(jié)合使用。

2 快速檢測(cè)方法

2.1 生化檢測(cè)(顯色培養(yǎng)基)

顯色培養(yǎng)基在致病菌的初篩和鑒定方面得到廣泛應(yīng)用，其基本原理是在分離培養(yǎng)基中加入人工合成的用于檢測(cè)某些菌種的特異性酶底物，該底物由產(chǎn)色基團(tuán)和微生物可代謝物質(zhì)組成，通常為無(wú)色，目標(biāo)微生物在培養(yǎng)基上選擇性生長(zhǎng)，其特征酶能夠降解顯色底物，產(chǎn)生有特殊顏色的代謝產(chǎn)物，使菌落呈現(xiàn)特定的顏色，非目標(biāo)菌被抑制或顯示其他顏色。

WANG等[15]開(kāi)發(fā)的一種基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)的選擇性培養(yǎng)基和快速檢測(cè)方法，對(duì)金黃色葡萄球菌的總分析時(shí)間為5 h。顧其芳等[16]發(fā)現(xiàn)，環(huán)凱金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基和科馬嘉金黃色葡萄球菌的靈敏性和特異性均高于Baird-Parker瓊脂平板，對(duì)緩慢葡萄球菌、溶血葡萄球菌、著色葡萄球菌等的抑制能力較強(qiáng)。顯色培養(yǎng)基在MRSA的分離方面也得到廣泛應(yīng)用[17-20]；Brilliance MRSA 2和ChromID MRSA這兩種選擇性培養(yǎng)基對(duì)食源性MRSA的分離靈敏度>92%、特異性>89%，Brilliance MRSA 2對(duì)陽(yáng)性菌株的確認(rèn)率相對(duì)較低[18]。Brilliance MRSA 2用于檢測(cè)肉雞中MRSA時(shí)，優(yōu)于MRSASelect和ChromID MRSA，且Brilliance MRSA 2瓊脂的相對(duì)敏感性較高，但使用ChromID MRSA檢測(cè)豬相關(guān)的MRSA時(shí)，其相對(duì)敏感性和相對(duì)特異性最高，這可能與樣品中的假陽(yáng)性和假陰性菌株數(shù)量、樣品預(yù)培養(yǎng)時(shí)間以及培養(yǎng)基孵化時(shí)間的長(zhǎng)短有一定關(guān)系[21]。不同MRSA顯色瓊脂出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因與樣品中存在一定量凝固酶陰性葡萄球菌以及帶有編碼?-內(nèi)酰胺抗性的mecA基因非金黃色葡萄球菌有必然關(guān)系[22-24]。同時(shí)不同廠家的顯色培養(yǎng)基的最佳分離時(shí)間不同，ChromID MRSA瓊脂培養(yǎng)48 h后敏感度最高，Colorex MRSA瓊脂則只需要24 h[25]；但沒(méi)有一種顯色培養(yǎng)基能夠百分百的將目標(biāo)菌分離出來(lái)，實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中可將顯色培養(yǎng)基與其他儀器或與其他選擇性培養(yǎng)基聯(lián)合使用。

2.2 以免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA是免疫分析技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法[26]，基本原理是將抗原(或抗體)吸附于固相載體上并保持其免疫活性，再加入酶標(biāo)抗體在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后，分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量，由于酶的催化效率很高，間接的放大了反應(yīng)結(jié)果從而提高反應(yīng)的敏感度。

將ELISA結(jié)合PCR技術(shù)檢測(cè)牛奶中的金黃色葡萄球菌時(shí)，其檢測(cè)敏感性為10 CFU/mL[27]。但ELSIA在金黃色葡萄球菌腸毒素、溶血素的檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛[28]。NOURI等[29]發(fā)現(xiàn)直接酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)牛奶中金黃色葡萄球菌腸毒素檢測(cè)的準(zhǔn)確性明顯高于電泳法、高效液相色譜法、夾心酶聯(lián)免疫吸附法。

2.2.2 酶聯(lián)免疫熒光分析技術(shù)(enzyme-linked fluorescence immunoassay, ELFA)

ELFA是在ELISA的基礎(chǔ)上建立起的一種高靈敏度、快速檢測(cè)方法,其中其中酶聯(lián)免疫熒光分析技術(shù)將酶放大技術(shù)、固相分離技術(shù)和熒光檢測(cè)技術(shù)三者相結(jié)合, 是免疫熒光分析中最為靈敏的方法[30]；原理是利用ELFA技術(shù)，包被了固相抗體的固相吸附器，將樣品中目標(biāo)菌的特異性抗原捕獲，堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗再與目標(biāo)菌的特異性抗原結(jié)合，二抗連接的堿性磷酸酶將底物水解，產(chǎn)生的磷酸-4-甲基傘型酮在370 nm下能夠產(chǎn)生熒光，再將熒光強(qiáng)度與閾值相比較，大于閾值判定為陽(yáng)性，反之為陰性[31]。

王利剛等[14]研究表明mini-VIDAS特異性、靈敏性和抗干擾性均表現(xiàn)良好，但對(duì)陰性樣品的篩檢率僅為80%，這可能與樣品原料及樣品制備過(guò)程中是否曾被金黃色葡萄球菌及其腸毒素污染有一定關(guān)系。食品樣品中假陽(yáng)性菌株產(chǎn)生的特異性抗原也可能與VIDAS的固相抗體相結(jié)合，造成假陽(yáng)性結(jié)果。

2.3 以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法

2.3.1 常規(guī)PCR技術(shù)

PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)高溫變性、低溫退火、中溫延伸等步驟，體外復(fù)制與模板DNA互補(bǔ)子鏈DNA的過(guò)程。該技術(shù)在金黃色葡萄球菌的16S rDNA和耐熱核酸酶(nuc)基因擴(kuò)增方面得到廣泛的應(yīng)用[32-33]。SARAIVA 等[34]表明PCR技術(shù)是動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌鑒定的準(zhǔn)確方法，其利用PCR技術(shù)擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的femA、nuc和coa基因的特異性均為100%，但coa基因的敏感度最低，同時(shí)擴(kuò)增femA和nuc基因能明顯提高敏感度。

在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的多重PCR技術(shù)，在食源性金黃色葡萄球菌的鑒定以及其耐藥基因、腸毒素基因的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用；SAVARIRAJ等[33]、LI等[35]研究表明，利用多重PCR技術(shù)能夠快捷、準(zhǔn)確的分析豬肉源性金黃色葡萄球菌耐藥性和腸毒素。

2.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

LAMP技術(shù)是一種高特異性和靈敏度的DNA擴(kuò)增方法，利用識(shí)別多區(qū)域特異性引物組和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在60～75 ℃等溫條件下，1 h內(nèi)能擴(kuò)增出高達(dá)109拷貝的靶序列。使用的多區(qū)域特異性引物組，被稱為“環(huán)引物”，可加快金黃色葡萄球菌的鑒定和更高的特異性。

基于nuc基因建立的LAMP技術(shù)能夠在2 h內(nèi)檢出金黃色葡萄球菌，最低檢測(cè)限為9×102CFU/mL[36]；但趙玥明等[37]的研究表明，基于nuc基因建立的LAMP技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌純菌最低檢測(cè)限為2.01 CFU/mL，對(duì)肉中金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)限為2.01×101CFU/mL。出現(xiàn)檢出限差異的原因可能是后者使用的Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，該酶是熱啟動(dòng)酶，無(wú)需低溫條件下配制反應(yīng)體系，保證了酶催化反應(yīng)的特異性，因此檢測(cè)限更低。梁玉林等[38]利用反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(reverse transcription-LAMP,RT-LAMP)對(duì)nuc基因設(shè)計(jì)多組引物，在等溫65 ℃條件下，30 min內(nèi)完成RT-LAMP反應(yīng)，對(duì)人工污染脫脂乳樣品的檢測(cè)中，金黃色葡萄球菌靈敏度達(dá)到230 CFU/g。

2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-time fluorescent quantitative PCR, RTQ-PCR)

熒光定量PCR技術(shù)融合了PCR技術(shù)的高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，直接探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，以獲得特定區(qū)段擴(kuò)增產(chǎn)物定量的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，完全閉管操作。其基本原理是基于熒光能量傳遞技術(shù)，通過(guò)受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用，能量從供體發(fā)色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色基團(tuán)，受體熒光染料發(fā)射出的熒光信號(hào)強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測(cè)PCR過(guò)程的熒光信號(hào)便可得知靶序列的初始濃度。

郭夢(mèng)冉等[39]建立一種基于SYBR GreenⅡ染料的RTQ-PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)肉類和乳制品中金黃色葡萄菌的檢測(cè)限分別為4.0×10和 3.5×10 CFU/mL，比普通PCR高出2～3個(gè)數(shù)量級(jí)；王曉[40]針對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因建立的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)冷凍蔬菜中金黃色葡萄球菌的最低檢測(cè)限為104CFU/mL。

2.4 基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)被證明適用于常規(guī)細(xì)菌鑒定，實(shí)現(xiàn)了92%的種類的正確鑒定，該技術(shù)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的生化鑒定，只需從瓊脂平板上挑選細(xì)菌菌落，將它們涂抹到MALDI TOF靶板上，然后在檢測(cè)器中快速分析，通過(guò)在參考菌株的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索匹配度來(lái)識(shí)別[41]。在基質(zhì)輔助激光解析的離子源部分，基質(zhì)與樣本形成共晶體后，從激光中吸收能量使樣本解吸，基質(zhì)與樣本間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣本分子電離，在飛行時(shí)間質(zhì)譜分析器部分，離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)管道，飛行時(shí)間與離子的質(zhì)荷比成正比，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間可測(cè)出質(zhì)荷比，通過(guò)軟件處理得到特征性的指紋圖譜，其基本原理如圖1所示。

圖1 MALDI-TOF-MS檢測(cè)原理圖Fig.1 MALDI-TOF-MS detection principle diagram

B?EHME等[42]，張玲等[43]利用MALDI-TOF-MS鑒定出來(lái)自于乳品和人體的金黃色葡萄球菌，并利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行聚類分型，其構(gòu)建的樹(shù)形圖和16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)一致性較高。該技術(shù)在MRSA菌株分離以及金黃色葡萄球菌腸毒素檢測(cè)方面也有大量運(yùn)用[44]。與傳統(tǒng)生化試驗(yàn)相比，MALDI-TOF-MS能夠更快捷的鑒定金黃色葡萄球菌[45]。

2.5 生物傳感器在金黃色葡萄球菌檢測(cè)方面的運(yùn)用

生物傳感器是一種分析裝置，通過(guò)結(jié)合生物識(shí)別元件和生物材料一起產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)，從而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量，基本原理如圖2所示[46]。

圖2 生物傳感器檢測(cè)原理圖Fig.2 Schematic diagram of biosensor structure

RUBAB等[46]設(shè)計(jì)了一種紙基生物傳感器，基本原理是基于金黃色葡萄球菌蛋白酶在特定多肽底物的蛋白水解活性，該底物夾在磁性納米棒和紙載體上的金表面之間。將外磁體固定在傳感器的背面，以加速磁性納米棒-肽段在試樣掉落時(shí)從傳感器表面解離。用肉眼檢測(cè)到磁性納米棒部分解離引起的顏色變化，再用分析軟件進(jìn)行分析，以便進(jìn)行定量測(cè)量，基本原理如圖3所示。RUBAB等[46]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該生物傳感器在純?nèi)鉁囵B(yǎng)中的檢出限為7 CFU/mL，在食品中的檢出限為40 CFU/mL，在環(huán)境樣品中的檢出限為100 CFU/mL，且只需要1 min即可得出結(jié)果，證明該傳感器能夠用于食源性金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。

圖3 紙基生物傳感器檢測(cè)原理圖Fig.3 Schematic diagram of paper-based biosensor

SUAIFAN等[47]設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)DNA基因組生物傳感器，其原理是用巰基和氨基修飾帶有固定和捕獲探針的基因組DNA生物傳感器系統(tǒng)，作為與靶DNA的互補(bǔ)，采用多壁碳納米管-殼聚糖-鉍修飾玻碳電極，經(jīng)固定化和雜交后，形成一個(gè)三明治(固定DNA-靶DNA-捕獲DNA-鉛納米顆粒)結(jié)構(gòu)，基本原理如圖4。實(shí)驗(yàn)證明，該生物傳感器對(duì)牛肉樣品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為1.23 ng/mL，且靈敏度高、響應(yīng)速度較快。

圖4 電化學(xué)DNA基因組生物傳感器檢測(cè)原理圖Fig.4 Schematic diagram of electrochemical DNA genomic biosensor

BHARDWAJ等[48]首次利用金屬有機(jī)骨架(metal-organic framework，MOF)與噬菌體形成的復(fù)合物完成對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)，該技術(shù)是基于噬菌體設(shè)計(jì)的一種新型生物傳感器。基本原理是先將噬菌體與水、金屬有機(jī)骨架(MOF)NH2-MIL-53(Fe)連接，然后以戊二醛為交聯(lián)劑，使MOF與噬菌體偶聯(lián)，MOF-噬菌體生物傳感器基于光致發(fā)光猝滅現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)樣品中金黃色葡萄球菌的高靈敏度檢測(cè)；結(jié)果表明，該生物傳感器對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限為31 CFU/mL，檢測(cè)范圍為40～4×108CFU/mL；值得注意的是，這種傳感器的感官材料和識(shí)別探針都是微米級(jí)的顆粒，MOF作為一種納米級(jí)熒光標(biāo)記物材料，廣泛運(yùn)用于醫(yī)療、食品設(shè)備，穩(wěn)定性、安全性高于以染料摻雜納米粒子為接合材料設(shè)計(jì)的生物傳感器，原理如圖5。

圖5 MOF-噬菌體生物傳感器檢測(cè)原理圖Fig.5 Schematic diagram of MOF bacteriophage biosensor

3 結(jié)語(yǔ)

金黃色葡萄球菌在生鮮豬肉、冷凍食品、蛋糕、雞肉等食品中時(shí)有檢出，攝入被金黃色葡萄球菌及其腸毒素污染的食品會(huì)引起食物中毒；因此對(duì)食品中金黃色葡萄球菌的早期、快速檢測(cè)顯得尤為重要。近年來(lái)，金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)技術(shù)正在快速更新；國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食源性金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，較難滿足突發(fā)性食物中毒事件的檢測(cè)需要，但該方法成本低，能夠滿足基層食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的需要；顯色培養(yǎng)基操作方便，特異性強(qiáng)，但偶爾產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，沒(méi)有同位素和放射性元素的污染，但會(huì)受食品基質(zhì)以及非金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗原影響，商品化ELISA試劑盒只能檢測(cè)金黃色葡萄球菌的傳統(tǒng)腸毒素。以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法操作較為簡(jiǎn)單，靈敏度高，但是引物的設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。MALDI-TOF-MS的檢測(cè)速度最快，功能最強(qiáng)大，但儀器成本也最貴，基層食品檢測(cè)部門很難配備。生物傳感器的種類較多，靈敏度高，檢測(cè)速度快，但是對(duì)操作人員的專業(yè)知識(shí)要求也較高。總體上看，針對(duì)食源性金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)技術(shù)正在朝著快捷、高靈敏度、高特異性的方向發(fā)展。