枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BJ3-2發(fā)酵薏米高產(chǎn)川芎嗪和溶纖酶體系優(yōu)化

文安燕，秦禮康, 2*，曾海英，朱怡

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學(xué), 西南藥食兩用資源開發(fā)利用國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州 貴陽，550025)3(貴州省植保站，貴州 貴陽，550001)

發(fā)酵是一種通過微生物或酶的作用改變植物基質(zhì)的理化結(jié)構(gòu)并潛在地提高其生物活性的有效途徑[1]。利用微生物對(duì)薏米進(jìn)行發(fā)酵，可改善薏米的組織結(jié)構(gòu)，提高制品營養(yǎng)、風(fēng)味及食用品質(zhì)，增強(qiáng)產(chǎn)品功能活性。以紅曲霉發(fā)酵薏米，可獲得112.649 mg/kg的洛伐他汀，同時(shí)紅曲薏米制品具有抗氧化及降血脂作用[2-3]。YIN等[4]以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) NCU137發(fā)酵薏米，發(fā)現(xiàn)多種營養(yǎng)成分含量增加，風(fēng)味獨(dú)特，黏度特性穩(wěn)定。WANG等[5]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis(natto)]發(fā)酵薏米制品改善了高血脂倉鼠的脂質(zhì)代謝、抗氧化狀態(tài)及腸道菌群。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米中游離氨基酸、γ-氨基丁酸、總多酚、黃酮、總?cè)坪娃曹吁ズ枯^原料顯著增加，同時(shí)還產(chǎn)生新化合物——川芎嗪[6-7]。

薏米被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”和藥食同源的“糧藥”之一[8]。薏苡籽粒(薏仁谷)，最外層為堅(jiān)韌的薏米殼，殼下為種皮層，加工脫殼后即得糙薏米，再精碾去皮拋光即為精薏米，同時(shí)產(chǎn)生碎薏米和薏米糠[9]。我國薏米加工技術(shù)仍停留在初級(jí)階段，多數(shù)企業(yè)僅限于薏米原料銷售及簡(jiǎn)單烘焙制粉；碎薏米作為薏米加工過程中的主要副產(chǎn)物，其主要用于飼料生產(chǎn)[10]。因此，薏米精深加工產(chǎn)品亟待開發(fā)。課題組前期借鑒日本納豆研發(fā)思路，基于B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米可高產(chǎn)川芎嗪前期成果，擬以貴州興仁薏米(精薏米、糙薏米和碎薏米)為原料，采用B.subtilisBJ3-2為發(fā)酵菌株分別對(duì)3種薏米進(jìn)行不添加前體物質(zhì)的單一基質(zhì)發(fā)酵，通過單因素及Box-Behnken試驗(yàn)構(gòu)建高產(chǎn)川芎嗪和溶纖酶的薏米發(fā)酵體系，為薏米高值化加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米，貴州興仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；黃豆，合力超市；B.subtilisBJ3-2，貴州大學(xué)吳擁軍教授贈(zèng)送；川芎嗪、尿激酶，Sigma；其余相關(guān)生理生化試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

H2-16KR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；FD-1P冷凍干燥機(jī)，上海田楓實(shí)業(yè)有限公司；1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米的工藝流程

B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米工藝流程具體如下：

1.4 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米的工藝單因素試驗(yàn)

以川芎嗪含量和溶纖酶酶活為指標(biāo)，考察發(fā)酵方式、料水比(g∶mL)(薏米∶水)=1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6)、裝載量(10%、14%、18%、22%和26%)、蒸煮時(shí)間(10、20、30、40、50 min)、初始pH(5.5、6、6.5、7、7.5)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、發(fā)酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)和發(fā)酵時(shí)間(48、60、72、84、96 h)等因素對(duì)發(fā)酵效果的影響。采用控制變量法，其發(fā)酵的初始條件為料水比1∶1(g∶mL)、裝載量18%、蒸煮時(shí)間20 min、pH 7.0、接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃和發(fā)酵時(shí)間72 h。

1.5 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米的Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵方式、料水比、裝載量、蒸煮時(shí)間、pH、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的取值范圍，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析，以川芎嗪含量和溶纖酶酶活為響應(yīng)值，得出B.subtilis發(fā)酵薏米的最佳發(fā)酵工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。B.subtilisBJ3-2發(fā)酵黃豆和CICC 20637發(fā)酵薏米按B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米的優(yōu)化條件制備。

1.6 分析方法

川芎嗪待測(cè)樣液制備：取3.00 g干燥粉末，加入15 mL 80%乙醇溶液，超聲處理30 min，功率500 W，溫度30 ℃；超聲完成后以8 000 r/min離心15 min，取上清液。按以上步驟再提取2次，收集上清液并定容至50 mL，過0.22 μm膜，得供試液。川芎嗪測(cè)定采用HPLC測(cè)定[6]。

溶纖酶待測(cè)樣制備：取25.00 g薏米發(fā)酵鮮樣于50 mL滅菌的生理鹽水中浸泡24 h，再以4 000 r/min離心30 min，取上清液待測(cè)。溶纖酶酶活采用纖維蛋白平板法測(cè)定[11]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品至少3次重復(fù)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)方差分析，圖標(biāo)采用Origin繪制。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵方式對(duì)B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響

由圖1可知，靜態(tài)發(fā)酵中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活顯著高于動(dòng)態(tài)發(fā)酵(P<0.05)。靜態(tài)發(fā)酵中，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米的川芎嗪含量和溶纖酶酶活分別為1.88 mg/g干基(dry weight，DW)和854.37 U/g；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米中分別為2.97 mg/g DW和720.84 U/g；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵碎薏米中分別為0.61 mg/g DW和501.22 U/g。固態(tài)發(fā)酵具有缺少游離水的流動(dòng)，供氧足和消耗能量低等優(yōu)勢(shì)；動(dòng)態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵完全和生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)[12]。薏米呈顆粒狀，動(dòng)態(tài)發(fā)酵不利于B.subtilisBJ3-2附著在薏米表面，限制其生長繁殖；靜態(tài)發(fā)酵過程中B.subtilisBJ3-2可深入薏米基料中并穿入基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，利于B.subtilisBJ3-2生長、繁殖及代謝。吳晶晶[13]也發(fā)現(xiàn)紅曲霉發(fā)酵固態(tài)大米培養(yǎng)基中川芎嗪的含量比液體培養(yǎng)基高3倍。因此，其以靜態(tài)發(fā)酵方式進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

A-川芎嗪產(chǎn)量；B-溶纖酶酶活圖1 發(fā)酵方式對(duì)B.subtilis發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響Fig.1 Effect of fermentation methods on the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis-fermented adlay

2.2 料水比、裝載量和蒸煮時(shí)間對(duì)B.subtilis發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響

隨著料水比、裝載量和蒸煮時(shí)間的增加，薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活呈先增加后減少的趨勢(shì)(圖2)。料水比為1∶1.2(g∶mL)時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活都達(dá)到最大值；在B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米中，料水比為1∶1.2(g∶mL)時(shí)川芎嗪產(chǎn)量達(dá)最大值，但溶纖酶酶活在料水比為1∶1.4(g∶mL)時(shí)達(dá)最大值；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵碎薏米中，川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活均在料水比為1∶1.4(g∶mL)時(shí)達(dá)最大值。裝載量為14%時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活達(dá)到最大值；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米和碎薏米中，裝載量為10%時(shí)川芎嗪產(chǎn)量最高，而溶纖酶酶活在裝載量為14%時(shí)最高。蒸煮時(shí)間為30 min時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米中川芎嗪產(chǎn)量達(dá)最大值，而溶纖酶酶活在蒸煮時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最大值；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米中，川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活均在30 min時(shí)達(dá)最大值；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵碎薏米中，川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活均在蒸煮時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最大值。料水比較低，水分不能滿足菌體生長繁殖所需水分；料水比過高，樣品易發(fā)黏結(jié)塊致使供氧不足[14]。同時(shí)，裝載量過少導(dǎo)致底物被消耗快且水分蒸發(fā)快；裝載量過高致使發(fā)酵過程中溶氧較少且菌體分布不均勻[15]。此外，蒸煮時(shí)間較短，薏米顆粒質(zhì)地硬且松散；當(dāng)蒸煮時(shí)間過長，薏米易發(fā)黏結(jié)塊致使溶氧量少[16]。因此，料水比、裝載量和蒸煮時(shí)間選擇為1∶1.4(g∶mL)、14%和30 min。

A、D、G-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵糙薏米；B、E、H-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵精薏米；C、F、I-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵碎薏米圖2 料水比、裝載量和蒸煮時(shí)間對(duì)B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響Fig.2 Effect of cooking time on the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 初始pH對(duì)B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響

隨著初始pH的增加，川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活先增加后減少(圖3)。初始pH值為7.0時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米和精薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活達(dá)最大值。B.subtilisBJ3-2發(fā)酵碎薏米中，川芎嗪產(chǎn)量在初始pH值為7時(shí)達(dá)到最大值，但溶纖酶酶活卻在pH值為6.5時(shí)達(dá)最大值。弱酸環(huán)境有利于B.subtilisBJ3-2生長繁殖及代謝合成乙偶姻(川芎嗪的前體物)，但過酸的環(huán)境條件下，菌株生長緩慢，延遲期較長[17]。ZHU等[18]利用兩階段pH值控制培養(yǎng)法來獲取高產(chǎn)量川芎嗪，即發(fā)酵48 h前pH值控制為5.5、48 h后pH值調(diào)控為7.0，獲得7.43 g/L的川芎嗪。但納豆激酶最適pH值為8.0，而堿性條件下川芎嗪不穩(wěn)定[19]。因此，pH 7.0是B.subtilisBJ3-2生長繁殖并同時(shí)獲得較高水平的川芎嗪和溶纖酶的保證。

2.4 接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響

隨著接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的增加，川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活先增加后減少(圖4)。接種量為9%時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米和碎薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活達(dá)最大值；在B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米中，川芎嗪產(chǎn)量在接種量為9%時(shí)達(dá)到最大值，而溶纖酶酶活在接種量為7%時(shí)達(dá)到最大值。發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活達(dá)最大值。B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米和碎薏米中，川芎嗪產(chǎn)量在發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)為最大值，但溶纖酶酶活在40 ℃時(shí)為最大值。川芎嗪產(chǎn)量在發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí)為最大值；而發(fā)酵時(shí)間為84 h時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米、精薏米和碎薏米中溶纖酶酶活達(dá)最大值。接種量較少，致使菌體發(fā)酵周期延長及菌體活力低誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的酶少；接種量過大，菌體生長旺盛并較快達(dá)穩(wěn)定期，后迅速老化自溶，次級(jí)產(chǎn)物生成的時(shí)間短[20]。朱兵峰[21]建立了多階段轉(zhuǎn)速偶聯(lián)溫度控制發(fā)酵策略：0～48 h時(shí)，控制培養(yǎng)溫度37 ℃；48～120 h，控制培養(yǎng)溫度55 ℃，川芎嗪的產(chǎn)量達(dá)7.12 g/L。

A-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵糙薏米；B-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵精薏米；C-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵碎薏米圖3 初始pH值對(duì)B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響Fig.3 Effect of initial pH on the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay

A、D、G-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵糙薏米；B、E、H-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵精薏米；C、F、I-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵碎薏米圖4 接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the tetramethylpyrazine and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay

2.5 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵薏米的Box-Behnken優(yōu)化結(jié)果

為確定B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米最佳發(fā)酵條件，選擇接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，以川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析，Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。如表2～表4所示，在B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米、精薏米和碎薏米中，回歸模型極顯著(P<0.01)，失項(xiàng)擬合不顯著(P>0.05)，說明該回歸模型擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。

表1 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵糙薏米產(chǎn)川芎嗪和溶纖酶的Box-Behnken優(yōu)化結(jié)果Table 1 Box-Behnken design matrix of experimental values of the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)，并分析川芎嗪產(chǎn)量和纖溶酶酶活的發(fā)酵基質(zhì)(薏米和黃豆)及菌株(B.subtilisBJ3-2和CICC 20637)依懶性。經(jīng)驗(yàn)證(圖5)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米中川芎嗪產(chǎn)量為6.15 mg/g DW，纖溶酶酶活為2 236.47 U/g，比未優(yōu)化的發(fā)酵糙薏米分別增加了3.27和2.64倍；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵精薏米中川芎嗪產(chǎn)量為6.93 mg/g DW，纖溶酶酶活為2 097.26 U/g，比未優(yōu)化的發(fā)酵糙薏米分別增加了2.34和2.97倍；B.subtilisBJ3-2發(fā)酵碎薏米中川芎嗪產(chǎn)量為5.09 mg/g DW，纖溶酶酶活為2 011.56 U/g，比未優(yōu)化的發(fā)酵糙薏米分別增加了8.48和4.01倍。而在B.subtilisBJ3-2發(fā)酵黃豆中，溶纖酶酶活(2 674.68 U/g)高于B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米，但川芎嗪產(chǎn)量(0.05 mg/g DW)遠(yuǎn)低于B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米。在B.subtilisCICC 20637發(fā)酵薏米中，川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活均低于B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米。而原料加工過程中，糙薏米通過精碾去皮拋光才獲得精薏米，同時(shí)產(chǎn)生占總質(zhì)量5%～10%的碎薏米和5%的薏米糠[21]，因此，綜合考慮加工成本，糙薏米可作為發(fā)酵高產(chǎn)川芎嗪和溶纖酶的最佳原料。

表2 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵糙薏米的回歸模型方差分析Table 2 Regression analysis of variance in B.subtilis BJ3-2 fermented dehulled adlay

圖5 不同發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵菌株中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活結(jié)果Fig.5 Results of the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in different substrate-and bacterial strain-fermentation注：BDA-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵糙薏米；BPA-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵精薏米；BBA-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵碎薏米；BSB-B.subtilis BJ3-2發(fā)酵黃豆；CDA-B.subtilis CICC 20637發(fā)酵糙薏米；CPA-B.subtilis CICC 20637發(fā)酵精薏米；CBA-B.subtilis CICC 20637發(fā)酵碎薏米

川芎嗪是中藥川芎的主要生物活性成分，但川芎嗪含量較低(平均含量2.19 μg/g)。在其他發(fā)酵產(chǎn)品如醋、白酒和豆豉中，川芎嗪含量分別為0.001～0.131 mg/g[22]、88.70～1 417.59 μg/L[23]和0.511 μg/g[24]，其含量均低于B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米中川芎嗪含量。利用微生物高效合成川芎嗪主要集中于篩選優(yōu)良菌株、添加前體物質(zhì)、優(yōu)化培養(yǎng)條件或改造細(xì)胞工程等[25]，但目前專注于轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基基料的相關(guān)研究較少。XIAO等[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加30.1 g/L的乙偶姻和67.7 g/L的磷酸二銨，可得到8.34 g/L的川芎嗪，這是目前研究中的川芎嗪最高產(chǎn)量。本研究以單一薏米為發(fā)酵基料，構(gòu)建了B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米高產(chǎn)川芎嗪的優(yōu)化模型，其含量分別為B.subtilisBJ3-2發(fā)酵黃豆和CICC 20637發(fā)酵糙薏米的204和12倍，表明B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米是一種高產(chǎn)川芎嗪的新方法。

表3 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵精薏米的回歸模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance in B.subtilis BJ3-2fermented polished adlay

表4 B.subtilis BJ3-2發(fā)酵碎薏米的回歸模型方差分析Table 4 Regression analysis of variance in B.subtilis BJ3-2 fermented broken adlay

3 結(jié)論

通過單因素和Box-Behnken試驗(yàn)分析，接種量為9.0%、發(fā)酵溫度為40 ℃和發(fā)酵時(shí)間為93 h時(shí)，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活分別為6.15 mg/g DW和2 236.47 U/g，接種量為8.1%、發(fā)酵溫度為38 ℃和發(fā)酵時(shí)間為96 h時(shí)，發(fā)酵精薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活分別為6.94 mg/g DW和2 142.18 U/g，但碎薏米中川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶酶活均明顯偏低。綜合考慮加工成本，B.subtilisBJ3-2發(fā)酵糙薏米可作為高產(chǎn)川芎嗪產(chǎn)量和溶纖酶的最佳發(fā)酵體系。擬在B.subtilisBJ3-2發(fā)酵薏米高產(chǎn)川芎嗪工藝優(yōu)化基礎(chǔ)上，將對(duì)發(fā)酵過程中川芎嗪合成的關(guān)鍵酶及前體物進(jìn)行關(guān)聯(lián)剖析，并采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)揭示其高產(chǎn)川芎嗪機(jī)理等相關(guān)研究，為延長薏米加工產(chǎn)業(yè)鏈和開發(fā)高值化新產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。