雜醇油酶法制備天然等同酯香料的研究

孟冠男, 劉 亞, 雷 聲, 劉國榮, 王成濤,*, 文雁君

(1.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心， 云南 昆明 650202；3.河南中大恒源生物科技股份有限公司， 河南 臨潁 462600)

雜醇油是一種無色或淡黃色揮發(fā)性油狀液體，其主要成分為異戊醇、異丁醇、正丙醇等[1]，雜醇油是淀粉、糖蜜、纖維水解糖等原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精的副產(chǎn)物之一[2]，在酒精發(fā)酵過程中伴隨產(chǎn)生，在酒精精餾提取時被分離出來，提取率約占酒精產(chǎn)量的0.24%～0.7%，據(jù)相關(guān)協(xié)會資料顯示，2018年我國發(fā)酵酒精產(chǎn)量已達(dá)6.47×109L，近年由于燃料乙醇需求增加，國內(nèi)發(fā)酵酒精產(chǎn)量不斷增加，雜醇油產(chǎn)量也隨之增長。因此，提高雜醇油資源利用率、附加值，具有重要經(jīng)濟(jì)和社會意義。

目前，我國對雜醇油的利用主要有兩條途徑：第一，雜醇油經(jīng)精制分餾得到C2、C3、C4醇和異戊醇等，作為燃料或溶劑。第二，硫酸催化酯化雜醇油制備混合酯。濃硫酸具有強烈腐蝕性，不符合環(huán)境友好生產(chǎn)的要求，該工藝制備的酯香料不具有“天然性”、價格低，使其在香精香料配制應(yīng)用時受到一定限制[3]。

非水相酶催化是利用生物酶在非水介質(zhì)(如有機溶劑、超臨界流體、氣相、離子液體等)中進(jìn)行的催化反應(yīng)[4-5]。酶在非水相體系的催化具有許多特點[6-10]：酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)域選擇性、鍵選擇性和熱穩(wěn)定性等都有所改變；酶熱穩(wěn)定性更高，如脂肪酶Novozym 435 FG在60～70 ℃時仍有較高酶活力；非水相體系中酶分子表面一層水化層對維持酶構(gòu)象及活力是十分重要，需要保持分子有水的微環(huán)境；非水相反應(yīng)抑制了水參與的副反應(yīng)(如酯化、肽合成等)，且有效提高有機底物的溶解度；反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)物易于分離純化等。近年非水相酶催化研究方面取得較大進(jìn)展[10-15]，發(fā)現(xiàn)脂肪酶、蛋白酶、羥基化酶、過氧化物酶等在非水相體系中能進(jìn)行酯化、?；?、糖苷、聚合等，完成短鏈酯、糖酯、肽、手性醇、葡萄糖苷、生物柴油等合成轉(zhuǎn)化。雜醇油酶法轉(zhuǎn)化制備的酯香料，可稱為“天然等同香料”[16]，較化學(xué)合成香料價格高多倍。

本研究以發(fā)酵來源的乙酸和雜醇油為主要原料，篩選適宜脂肪酶，研究無溶劑體系中酶轉(zhuǎn)化的影響因素，優(yōu)化其酯化條件，以期為天然等同酯香料開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸丙酯均為分析純，國藥化學(xué)試劑公司；活性炭粒，國藥化學(xué)試劑公司；正己烷、異戊醇、丙酮、丁酮、叔丁醇、乙醚均為分析純，4A分子篩、小鋼瓶，北京化學(xué)試劑公司；脂肪酶Novozym 435FG、Lipozyme TLIM、Lipozyme TL、Lipozyme 50BG、Greasex 200MG、LIPEX 100T、NovoCor ADL，丹麥諾維信公司；0.45 μm有機相濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；雜醇油(發(fā)酵法制備酒精的副產(chǎn)物)，山東裕方生物化工有限公司；去離子水、高純水，實驗室純化自制。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL- 10C型高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；HQ45型恒溫?fù)u床，中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；DF- 101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；BS200S- WE1型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司； DHG- 9145A型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科儀有限公司；6890N- 5975C型氣相色譜- 質(zhì)譜儀，美國安捷倫公司；JXD- 02型超聲儀，北京金星超聲波設(shè)備技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1雜醇油預(yù)處理

預(yù)制雜醇油的制備：200 mL雜醇油于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中90 ℃減壓蒸餾脫色，收集物經(jīng)40 g 4A分子篩150 r/min搖床10 h脫水。

1.3.2脂肪酶種類的篩選

依據(jù)脂肪酶對乙酸和異戊醇合成異戊酯的轉(zhuǎn)化率篩選脂肪酶。分別取乙酸和預(yù)制異戊醇各3 mL混合均勻，加脂肪酶70 mg、4A分子篩2.0 g，密封，于45 ℃、140 r/min搖床反應(yīng)36 h。

脂肪酶相對活力測定：按GB 601—2016《化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》規(guī)定，0.01 mol/L NaOH溶液滴定，酚酞為指示劑，利用NaOH滴定計算反應(yīng)剩余乙酸量，根據(jù)乙酸消耗量計算酯產(chǎn)率，以此表征脂肪酶相對活力，見式(1)。

酶促酯產(chǎn)率=(V1-V2)/V1×100%。

(1)

式(1)中，V1表示空白實驗消耗NaOH的體積，mL；V2表示加入脂肪酶后所消耗NaOH的體積，mL。

1.3.3制備酯香料的方法及單因素實驗

基本反應(yīng)體系為預(yù)制雜醇油3 mL、脂肪酶Novozym 435FG 70 mg、4A分子篩2.0 g、乙酸1.5 mL分批次逐漸加入，水浴45 ℃、搖床140 r/min、密封反應(yīng)36 h。對于上述基本反應(yīng)體系和條件，采用固定其他、替換改變其中之一因素條件的方式，分別考察脂肪酶量(30、50、70、90、110 mg)、4A分子篩量(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g)、乙酸加入次數(shù)(1～6次)、乙酸加入的間隔時間(0、1、2、3、4、5 h)、反應(yīng)溫度(30、35、40、45、50 ℃)、反應(yīng)時間(12、18、24、30、36 h)、搖床轉(zhuǎn)速(0、100、120、140、160、180 r/min)等單因素條件對酯產(chǎn)率的影響，每組3次平行重復(fù)，反應(yīng)體系中不另加其他溶劑。

反應(yīng)結(jié)束后用一次性注射器吸取1.5 mL上清液，0.45 μm有機相濾膜過濾，取100 μL，用正己烷定容至5 mL，用氣相色譜- 質(zhì)譜測定產(chǎn)物酯含量[6]。

1.3.4氣相色譜-質(zhì)譜測定條件

參照文獻(xiàn)[16]確定氣相色譜- 質(zhì)譜測定條件。

DB-WAX毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣器溫度250 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL；檢測器溫度250 ℃；柱溫在60 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至90 ℃，以20 ℃/min上升到230 ℃，保持3 min，共計23.5 min；載氣為氦氣，流速 4.6 mL/min, 壓力為1.1×105Pa。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置不同濃度乙酸異戊酯(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL)、乙酸正丙酯(0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mg/mL)、乙酸異丁酯(0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用氣相色譜- 質(zhì)譜儀分析，繪制酯濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。

雜醇油制得酯產(chǎn)率的計算見式(2)。

酯產(chǎn)率=(C1×50×b×1 000×M1)/ (2.38a×M2)×100%。

(2)

式(2)中，C1為產(chǎn)物乙酸異戊酯(或乙酸異丁酯、乙酸正丙酯)密度，mg/mL；M1為異戊醇(或異丁醇、正丙醇)的摩爾質(zhì)量，g/mol；M2為乙酸異戊酯(或乙酸異丁酯、乙酸正丙酯)的摩爾質(zhì)量，g/mol；a為異戊醇(或異丁醇、正丙醇)在預(yù)制雜醇油中所占體積分?jǐn)?shù)；b為無溶劑反應(yīng)體系的體積，為4.5 mL。

1.3.6制備酯香料的條件優(yōu)化

結(jié)合單因素實驗結(jié)果，采用正交試驗方法優(yōu)化雜醇油制備酯香料的條件，正交試驗因素與水平見表1。氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用測定產(chǎn)物酯含量，分析比較各因素的極差(R值)，使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，檢驗顯著性差異。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.7超聲處理的實驗條件

反應(yīng)體系中預(yù)制雜醇油3 mL、分子篩1.0 g、脂肪酶70 mg、1.5 mL乙酸分6次加入(間隔1 h)，于45 ℃水浴，小鋼瓶密閉反應(yīng)6 h。超聲頻率28、50、135 Hz，超聲功率0.1、0.3、0.5 W/cm2；對照組為無超聲處理的搖床實驗。采用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用測定產(chǎn)物酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件對酯香料產(chǎn)率的影響

2.1.1脂肪酶種類的影響

采用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用分析預(yù)制雜醇油的組成成分，其異戊醇、異丁醇、正丙醇占比分別為93.50%、2.70%、1.65%。因此，選擇異戊醇與乙酸為底物，考察脂肪酶催化合成乙酸異戊酯的轉(zhuǎn)化率為對象，篩選適宜的脂肪酶。不同脂肪酶對酯產(chǎn)率的影響見圖1。由圖1可知，Novozym 435FG和Greasex 200MG的轉(zhuǎn)化率較高，分別為92.62%、80.12%，其余脂肪酶的酯化活力很弱，甚至未見活性。由于脂肪酶Novozym 435FG測定酶活力約為8 000 U/g(此值接近商品宣稱酶活力)，且為固定化酶顆粒，也便于回收再利用，因此，選擇Novozym 435FG作為實驗研究用酶。

圖1 脂肪酶種類的篩選Fig.1 Selection of lipases species

2.1.2脂肪酶加入量的影響

在預(yù)制雜醇油3 mL、4A分子篩2.0 g、乙酸1.5 mL分6次加入(每次間隔3 h)，水浴45 ℃、搖床140 r/min，反應(yīng)36 h的條件下，考察Novozym 435FG脂肪酶加入量對酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖2和圖3。由圖2和圖3可知，脂肪酶Novozym 435 FG加入到70 mg時酯產(chǎn)率達(dá)到80%以上，繼續(xù)增加酶量，產(chǎn)率增加不大。一般認(rèn)為酶催化反應(yīng)速率與產(chǎn)量是隨著脂肪酶增加而不斷增加，但是這種理論在非水相中不一定適用，Habulin等[13]在研究果糖酯合成時，發(fā)現(xiàn)非水相中脂肪酶過量增加，由于酶本身之間的競爭作用爭奪必需水，產(chǎn)物量反而下降，甚至停止反應(yīng)。

圖2 脂肪酶加入量對酯產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of lipase addition on ester yield

圖3 雜醇油制備酯香料反應(yīng)產(chǎn)物的色譜Fig.3 Chromatogram of reaction products in preparation of ester aromas from fusel oil

2.1.3分子篩加入量的影響

酯化反應(yīng)是生成水的可逆反應(yīng)，產(chǎn)物水分子會改變酶的微環(huán)境，進(jìn)而影響酶活性，水過多時將向逆向水解反應(yīng)進(jìn)行。分子篩是一種良好除水劑，吸收水分促使酯化反應(yīng)進(jìn)行。在預(yù)制雜醇油3 mL、Novozym 435FG脂肪酶70 mg，乙酸1.5 mL分6次加入(每次間隔3 h)，水浴45 ℃、搖床140 r/min、反應(yīng)36 h的條件下，考察4A分子篩加入量對酯產(chǎn)率的影響，見圖4。由圖4可知，分子篩加入量為1.0 g以上時，3種酯產(chǎn)率接近最大值，繼續(xù)增加分子篩用量，產(chǎn)物量增加不明顯。此結(jié)果與非水相酶學(xué)理論和大多數(shù)研究報道基本一致，非水介質(zhì)并非完全沒有水，酶催化活性需要靠著與之緊靠的一層左右的水分子來維持，如果沒有水，將會導(dǎo)致酶構(gòu)象的劇烈變化甚至完全失活[8]；如分子篩過量，會吸收脂肪酶分子表面的結(jié)構(gòu)水，容易奪去酶的“水保護(hù)層”，導(dǎo)致酶柔性喪失，降低酶活力，甚至酶失活。

圖4 分子篩加入量對酯產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of molecular sieve addition amount on ester yield

2.1.4乙酸加入次數(shù)和間隔時間的影響

在預(yù)制雜醇油3 mL、脂肪酶Novozym 435FG 70 mg、4A分子篩2.0 g，水浴45 ℃、搖床140 r/min反應(yīng)體系中，反應(yīng)36 h條件時，考察1.5 mL乙酸分加入次數(shù)對酯香料產(chǎn)率的影響，見圖5。由圖5可知，酯產(chǎn)率隨乙酸加入次數(shù)增加而增加，可見分批加入底物乙酸，有利于緩解低pH值作用，最大限度地提高酯產(chǎn)率。Romeroa等[6]在研究酶法合成乙酸異戊酯時也發(fā)現(xiàn)過量乙酸或乙酸酐會降低脂肪酶活性，采用過量異戊醇可緩解此類問題。因為乙酸的強酸性及pH值影響了反應(yīng)體系微環(huán)境，進(jìn)而改變了脂肪酶的空間結(jié)構(gòu)，使酶的活性位點被“蓋”起來，導(dǎo)致酶活性降低[9]；在無溶劑體系中，由于沒有有機溶劑的“緩沖保護(hù)”，這種作用可能更為明顯[16]。

圖5 乙酸加入次數(shù)對酯產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of acetic acid addition times on ester yield

在預(yù)制雜醇油3 mL、脂肪酶Novozym 435FG 70 mg、4A分子篩2.0 g，水浴45 ℃、搖床140 r/min，1.5 mL乙酸分6次加入，考察間隔時間對酯香料產(chǎn)率的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，乙酸加入間隔時間在1～3 h時，高濃度乙酸導(dǎo)致反應(yīng)體系呈現(xiàn)低pH微環(huán)境，顯著降低了酶活性，酯產(chǎn)率低；間隔時間3 h以上時，酯產(chǎn)率平緩增加，表明酶法酯化反應(yīng)需要一定時間的酶與底物充分接觸，乙酸間隔時間適當(dāng)增加，反應(yīng)底物的消耗，會增加酯產(chǎn)物生成；如果乙酸加入間隔時間短、積累過多，未反應(yīng)乙酸的累積改變了微環(huán)境pH值，會降低酶活性及酯產(chǎn)率。

圖6 乙酸加入間隔時間對酯產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of addition interval time of acetic acid on ester yield

2.1.5反應(yīng)溫度及反應(yīng)時間的影響

一般認(rèn)為酶活力受溫度影響較大，酶活力在一定范圍內(nèi)會隨著溫度提高而增加，固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性優(yōu)于未固定化酶，Novozym 435FG脂肪酶可在60 ℃下保持較好熱穩(wěn)定性。在預(yù)制雜醇油3 mL、脂肪酶Novozym 435FG 70 mg、4A分子篩2.0 g，1.5 mL乙酸分6次加入，每次加入間隔時間3 h，搖床140 r/min反應(yīng)條件下，考察反應(yīng)溫度和時間對酯香料產(chǎn)率的影響，結(jié)果分別見圖7和圖8。由圖7可知，在30～50 ℃的溫度范圍內(nèi)，酯產(chǎn)率基本相當(dāng)，說明此溫度范圍內(nèi)，酶的剛性結(jié)構(gòu)變化不明顯，酶活力和熱穩(wěn)定性變化不大，且45 ℃的酯產(chǎn)率接近高點，反應(yīng)時間25 h以上時，酯產(chǎn)率已趨于穩(wěn)定，因此，后續(xù)研究選擇45 ℃及25 h繼續(xù)研究。

圖7 反應(yīng)溫度對酯產(chǎn)率的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on ester yield

圖8 反應(yīng)時間對酯產(chǎn)率的影響Fig.8 Effect of reaction time on ester yield

2.1.6搖床轉(zhuǎn)速的影響

搖床轉(zhuǎn)速影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)阻力，研究了不同搖床轉(zhuǎn)速對酯產(chǎn)率的影響，見圖9。由圖9可知，搖床轉(zhuǎn)速較低時，由于傳質(zhì)阻力的影響，酯產(chǎn)率較低；隨著轉(zhuǎn)速提高，體系中底物分散更充分，提高了固定化酶活性位點與反應(yīng)底物接觸概率。搖床速率在140 r/min時，酯產(chǎn)率達(dá)到接近最高值，繼續(xù)提高搖床速度，酯產(chǎn)率升高不顯著，可能是由于轉(zhuǎn)速增快，固定化酶活性位點與反應(yīng)底物接觸不充分，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。Romeroa等[6]在研究不同?；w對酯合成影響的動力學(xué)時也有類似結(jié)論，搖床轉(zhuǎn)速從100 r/min提升至300 r/min，乙酸異戊酯產(chǎn)量未見提高，其結(jié)論與本研究結(jié)果也基本一致。

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對酯產(chǎn)率的影響Fig.9 Effect of shaker speed on ester yield

2.2 影響因素的正交試驗優(yōu)化結(jié)果

2.2.1正交試驗設(shè)計結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇對酯產(chǎn)率影響較大的分子篩加入量、乙酸加入次數(shù)、乙酸加入間隔時間及反應(yīng)時間4個因素，進(jìn)行正交試驗，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。由極差(R值)分析可知，無溶劑體系中4個因素對酯產(chǎn)率影響順序由大到小依次為總反應(yīng)時間(C)、乙酸加入次數(shù)(A)、乙酸加入的間隔時間(B)、分子篩添加量(D)。用SPSS 16.0軟件方差分析，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間、乙酸加入次數(shù)對乙酸異戊酯的影響顯著(P<0.05)，反應(yīng)時間對乙酸異丁酯、乙酸正丙酯的影響顯著(P<0.05)。因此結(jié)合直觀分析、方差分析的結(jié)果，各因素的最佳組合確定為A3B2C3D3，其優(yōu)化條件為V(雜醇油)3 mL、m(脂肪酶)70 mg、m(分子篩)2 g、1.5 mL的乙酸分6次加入、t(乙酸加入間隔)3 h、反應(yīng)溫度45 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min、t(酯化反應(yīng))36 h。

表2 雜醇油酶法制備酯香料的正交試驗及結(jié)果Tab.2 Orthogonal test and results of preparation of ester aromas by lipase catalysis of fusel oil

2.2.2優(yōu)化條件結(jié)果驗證

根據(jù)正交試驗優(yōu)化條件，進(jìn)行3組實驗驗證，結(jié)果見表3。在優(yōu)化條件下，乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸正丙酯的產(chǎn)率分別為(89.2±0.7)%、(89.3±0.6)%、(76.8±0.9)%。較優(yōu)化前有一定提高，該結(jié)果與前期研究有溶劑正丁烷反應(yīng)體系中酯產(chǎn)率接近(分別為90.1%、91.3%、78.1%)[16]，有利于酯產(chǎn)物的分離提取、節(jié)省了有機溶劑。

表3 優(yōu)化條件下雜醇油酶法制備酯香料的產(chǎn)率Tab.3 Yield of ester aromas prepared by lipase catalysis of fusel oil under optimized conditions %

2.3 超聲處理對酯香料產(chǎn)率、合成進(jìn)程及穩(wěn)定性的影響

2.3.1超聲處理對酯產(chǎn)率的影響

以正交試驗優(yōu)化條件為基礎(chǔ)，研究考察超聲場強(超聲頻率28、50、135 Hz，單位面積超聲功率0.1、0.3、0.5 W/cm2)對酯香料產(chǎn)率的影響，結(jié)果分別見圖10和圖11。由圖10可知，在0.1～0.5 W/cm2時，隨著單位面積超聲功率增大，酯產(chǎn)率明顯增加，其中超聲頻率50 Hz、單位面積超聲功率0.5 W/cm2處理6 h時，酯香料產(chǎn)率85%，顯著高于其他超聲處理實驗組，也接近正交試驗設(shè)計優(yōu)化條件的反應(yīng)36 h時酯產(chǎn)率，但超聲處理的酯香料最終產(chǎn)量和產(chǎn)率并未見增加。

圖10 單位面積超聲功率和超聲頻率對酯產(chǎn)率的影響Fig.10 Effect of ultrasonic power per unit area and ultrasonic frequency on ester yield

2.3.2超聲處理對酯合成進(jìn)程的影響

研究不同超聲處理對酯合成進(jìn)程的影響，結(jié)果見圖11。無溶劑體系中0.5 W/cm2以下的超聲處理大大加速了反應(yīng)進(jìn)程，顯著縮短了反應(yīng)時間(與搖床條件相比，相同酯產(chǎn)率時其反應(yīng)時間縮短近30 h)。表明適當(dāng)超聲處理產(chǎn)生的超聲空化和升溫作用，增強了酶活性中心與底物的充分接觸概率、酯化反應(yīng)加速，但超聲頻率過高或過低，會改變固定化脂肪酶的活性位點暴露或改變固定化酶孔徑，影響酶活性中心與底物接觸，尤其在135 Hz高頻率下反應(yīng)溶液出現(xiàn)變渾濁現(xiàn)象，這可能與脂肪酶從固定載體上脫落，而游離酶在高頻率下易失活等，導(dǎo)致反應(yīng)進(jìn)程變慢。趙江[17]研究非水相酶合成乳酸乙酯時認(rèn)為超聲條件下達(dá)到反應(yīng)平衡時間縮短了20 h，電鏡掃描發(fā)現(xiàn)超聲作用可使固定化脂肪酶的載體表面結(jié)構(gòu)致密度降低，表面變得粗糙，可能使產(chǎn)物和底物的擴(kuò)散能力增強，使反應(yīng)速度加快、產(chǎn)率增加。胡愛軍等[18]在研究超聲酶法制備生物柴油時，發(fā)現(xiàn)超聲處理的生物柴油產(chǎn)率比靜態(tài)時提高了27%～32%，比搖床條件的產(chǎn)率提高了9%～12%。但超聲頻率、超聲功率達(dá)到多少能改變脂肪酶的分子構(gòu)象，還未見報道，有待深入研究。

圖11 超聲處理對酯合成進(jìn)程的影響Fig.11 Effect of ultrasonic treatment on progress of ester synthesis

2.3.3超聲處理對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

實驗對比超聲條件和搖床條件下的酶使用重復(fù)性、穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，超聲處理的脂肪酶反復(fù)使用8次，其最高產(chǎn)酯率由80%下降到40%，而搖床產(chǎn)酯率由90%左右下降到60%。超聲能量比搖床高很多，長時間空化作用造成高溫高壓微環(huán)境會使脂肪酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變，脂肪酶失活速度加快；無溶劑體系中酶活性降低比正己烷等溶劑體系更快[16]。超聲處理時體系溫度會急劇上升，應(yīng)采取適當(dāng)降溫措施，保護(hù)酶的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

研究了無溶劑體系由雜醇油酶法制備天然等同酯香料的方法，并對影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，固定化脂肪酶Novozym 435FG在無溶劑體系中的酯化活力高，其乙酸異戊酯產(chǎn)率達(dá)到92.62%；分子篩、乙酸加入次數(shù)和間隔時間、反應(yīng)溫度和時間、搖床轉(zhuǎn)速及超聲處理等對酯化反應(yīng)速率及酯香料產(chǎn)率有一定影響。較優(yōu)的酯化工藝條件為V(雜醇油)3 mL、m(脂肪酶)70 mg、m(分子篩)2 g、1.5 mL的乙酸分6次加入、t(乙酸加入間隔)3 h、反應(yīng)溫度45 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min、t(酯化反應(yīng))36 h，在該條件下雜醇油酶轉(zhuǎn)化乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸正丙酯的產(chǎn)率分別達(dá)到(89.2±0.7)%、(89.3±0.6)%、(76.8±0.9)%。在超聲頻率50 Hz、單位面積超聲功率0.5 W/cm2處理6 h的酯香料產(chǎn)率達(dá)到85%，適當(dāng)超聲處理可大大加速酯化反應(yīng)進(jìn)程，顯著縮短反應(yīng)時間，但超聲處理對酯香料最終產(chǎn)率并未增加；長時間超聲空化作用造成體系微環(huán)境改變，固定化脂肪酶的穩(wěn)定性降低，酶失活速度加快。