基于脂質(zhì)組學的不同原料茯茶“發(fā)花”前后脂類變化研究

趙燕妮， 陳 丹， 陳雪峰， 曾 橋， 許牡丹， 李 華，胡 歆， 梁 艷， 趙潔妤， 劉 歡

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.南方科技大學 公共分析測試中心， 廣東 深圳 518055； 3.咸陽涇渭茯茶有限公司， 陜西 咸陽 712044； 4.河北環(huán)境工程學院 環(huán)境工程系， 河北 秦皇島 066102)

0 引言

依據(jù)茶葉生產(chǎn)過程中發(fā)酵程度的差異，將其分為非發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶、全發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶四大類.茯茶是一種后發(fā)酵茶，不僅能補充維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，而且有抑菌、抗氧化、健胃消食和減肥等作用[1-3].茯茶生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生以冠突散囊菌為主的優(yōu)勢菌，“發(fā)花”是茯茶加工過程中特有的工藝，也是區(qū)別于其他茶葉加工的獨有工藝，其目的是通過控制一定的環(huán)境條件，促使冠突散囊菌生長、繁殖，以產(chǎn)生俗稱為"金花"的金色閉囊殼."金花"能增進茶湯的色澤、產(chǎn)生獨特的香味，而且它的數(shù)量和質(zhì)量決定了茯茶的品質(zhì)[4,5].

脂類降解是茶葉生產(chǎn)過程中形成香氣的重要途徑之一，眾多與脂類氧化降解有關(guān)的香氣產(chǎn)物是構(gòu)成茯茶香氣特征的重要組分[6-8].Ho等[9]研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸是C6-C10脂肪族芳香化合物的重要前體，如(E)-2-己烯醇和(Z)-3-己烯醇(呈嫩茶鮮爽型清香);Yang等[10]報道，脂類降解產(chǎn)生的C6-C9脂肪族醛、醇類香氣物質(zhì)是茶葉產(chǎn)生新鮮清香氣味的重要因素;Cao等[11]研究發(fā)現(xiàn)中國黑茶中酮的含量較高，其主要來源于脂肪酸的氧化和降解.這些酮類化合物是茶中非常重要的風味物質(zhì)，可提供特殊的花香和果香.目前，在茶葉脂質(zhì)的研究中，多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[12]、高效液相色譜(HPLC)[13]等技術(shù)進行分離分析.然而，這些分析技術(shù)存在分析時間長、特異性和靈敏度較差等不足.

脂質(zhì)組學是對脂質(zhì)進行整體系統(tǒng)分析的一種新技術(shù)，是代謝組學的分支.脂質(zhì)組學可從分子水平上對生物體內(nèi)脂類物質(zhì)進行系統(tǒng)的定性定量分析，具有高通量、高靈敏、高特異的優(yōu)勢[14,15]，已成功應(yīng)用于植物有關(guān)的研究中.鄭姝寧等[16]建立了一種利用UPLC-TOF-MS/MS的脂質(zhì)組學方法對白菜葉片進行了分析，結(jié)果共鑒定出232種脂質(zhì)分子;Pablo等[17]利用多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的脂質(zhì)組學分析方法，在擬南芥葉片中鑒定出了393個脂質(zhì)分子，覆蓋23個(亞)類脂質(zhì);Li等[18]建立了基于UPLC-MS的脂質(zhì)組學分析方法，對紅茶加工過程中脂類動態(tài)變化規(guī)律進行了研究，結(jié)果表明與葉綠素降解、甘油糖脂代謝和其他胞外膜脂代謝相關(guān)的脂類均發(fā)生了顯著的變化.

研究發(fā)現(xiàn)不同原料制成的茯茶，其功能和感官品質(zhì)存在較大的差別[19].黑茶是制作茯茶的傳統(tǒng)原材料，“發(fā)花”可以促進黑茶內(nèi)部成分的轉(zhuǎn)化，改善黑茶的風味和功能特性[20].杜仲是我國的特有經(jīng)濟樹種且資源豐富，有兩千多年的藥用歷史，具有調(diào)節(jié)血糖和血脂等功效[21].近年來，杜仲葉茯茶作為一種新型的保健茶，受到越來越多的研究者關(guān)注.

本研究采用基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道肼高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q Exactive MS)的脂質(zhì)組學方法研究傳統(tǒng)黑茶和杜仲葉“發(fā)花”前后內(nèi)含脂類成分的衍變規(guī)律，以期從茶樣生化成分組成變化規(guī)律的角度揭示“發(fā)花”對茶葉品質(zhì)改善的機理，為茯茶產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展及多樣化茯茶制品的開發(fā)提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

茯茶樣品：分別以安化黑茶(湖南安化)、杜仲葉(陜西略陽)為原料，在同一加工條件下加工制成的茯茶[22].樣品經(jīng)液氮冷凍后置于-80℃保存(該溫度下保存茶葉時，其代謝基本停止).

HPLC級別試劑，包括異丙醇(IPA)、甲醇(MeOH)、乙腈(ACN),均購自美國TEDIA公司；甲基叔丁基醚(MTBE)、乙酸銨,購自美國Sigma公司；超純水購自美國Milli-Q公司.

1.1.2 主要儀器設(shè)備

CTFD-10S冷凍干燥機，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司；高速粉碎機，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；5424R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；冷凍離心濃縮儀，美國LABCONCO公司；BS224S分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；VORTEX2渦旋振蕩器，德國IKA公司；KQ3200B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道肼高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q Exactive MS)，美國Thermo公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

將茶樣于-80 ℃冰箱取出，置于冷凍干燥機干燥，采用高速粉碎機對茶樣進行粉碎.稱取茶樣20 mg于離心管中，加入300μL甲醇溶液和1 mL MTBE，搖勻渦旋1 h后，加入300μL H2O渦旋30 s，在4 ℃下靜置10 min，14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取500μL上清液凍干，于-80 ℃保存.

進樣分析前，復(fù)溶于100μL的乙腈/異丙醇/水=65/30/5(v/v/v)溶液中，渦旋3 min，以14 000 r·min-1轉(zhuǎn)速在10 ℃下離心10 min，取上清液于進樣瓶中.

為評價基于UHPLC-Q Exactive MS的脂質(zhì)組學方法在樣品分析過程中的穩(wěn)定性和可靠性，保證所獲得數(shù)據(jù)的準確性，每個試驗樣品選擇3個重復(fù)樣；取所有待測樣品等量混合為質(zhì)量控制樣本(QC)，均勻地插入至分析序列中，按照上述方法與樣品平行處理和分析.

1.2.2 色譜條件

采用Dionex UltiMate 3000 UPLC system系統(tǒng)(Thermo Fisher)和色譜柱C8 AQUITY(2.1×100 mm×1.7μm，Waters)進行LC分離.所用流動相為：流動相A(ACN∶H2O=6∶4，含10 mM乙酸銨)，流動相B(IPA∶ACN=9∶1,含10 mM乙酸銨)；洗針液(IPA∶ACN∶H2O=65∶30∶5)；流速：0.26 mL min-1；柱溫：55 ℃；進樣體積：5～10μL；進樣室溫度：10 ℃；洗脫梯度：0 min 68%A、1.5 min 68%A、15.5 min 15%A、15.6 min 3%A、18 min 3%A、18.1 min 68%A、20 min 68%A.

1.2.3 質(zhì)譜條件

UHPLC系統(tǒng)經(jīng)電噴霧離子化(ESI)源與Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜相連.分別采用正、負離子模式采集數(shù)據(jù)，鞘氣35 arb，輔助氣5 arb，毛細管電壓3 kV，離子傳輸管溫度為320 ℃.質(zhì)譜全掃模式下，儀器分辨率設(shè)置為120 000，掃描范圍為150～1 600 m/z，階梯碰撞能量：15、30、45 EV[23-28].

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

首先，采用LipidSearch(version 4.0，Thermo Scientific,Rockford，IL,U S A)工作站篩選出潛在的脂質(zhì)分子.通過比對保留時間、精確分子量、MS/MS二級碎片進行脂質(zhì)分子的定性.在TraceFinder EFS軟件(version 3.2;Thermo Scientific,Rockford,IL,U S A)中實現(xiàn)對定性脂質(zhì)分子的峰面積提取.然后將峰表中脂類物質(zhì)的原始峰面積歸一至樣品中所有化合物的總峰面積，實現(xiàn)化合物的相對定量.最后保留所有QC樣本中相對標準偏差(RSD)小于30%的脂質(zhì)離子，供后續(xù)統(tǒng)計學分析.采用SIMCA-P 14.0進行有監(jiān)督的主成分分析(PCA)和偏最小二乘回歸分析法(PLS-DA)分析.

用SPSS 18.0進行單變量Student′s t-test檢驗，篩選有顯著差異的代謝物.聚類分析由Mev 4.7.4完成.脂質(zhì)的命名和縮寫依據(jù)LIPID MAPS分類系統(tǒng)[18].

2 結(jié)果與討論

2.1 茯茶內(nèi)含脂類成分分析

基于上述方法對茯茶樣品進行分析，典型色譜圖如圖1所示.根據(jù)精確分子質(zhì)量、保留時間以及二級碎片信息共鑒定出414個脂質(zhì)分子，涵蓋了19類脂質(zhì)的信息.主要包括Cer、DG、MGDG、DGDG、TG、OAHFA、MGMG、PC、LPC、PE、LPE、PS、PI、LPI、PG、LPG、PA、LPA、CL.具體如表1所示.

(a)正離子模式

(b)負離子模式圖1 正、負離子模式下茯茶脂質(zhì)組學分析的總離子流圖

表1 基于LC-MS的脂質(zhì)組學的茯茶脂類物質(zhì)鑒定結(jié)果

2.2 分析方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性評價

為了評價預(yù)處理方法的重復(fù)性和分析方法的穩(wěn)定性，QC樣品被均等地插入至分析序列中.所有樣品的PCA分析中，QC樣品緊密地聚集在PCA得分圖的幾何中心(圖2(a)和圖2(b))，表明QC樣品的重復(fù)性較好.此外，所有QC樣本中各代謝物歸一化后峰面積的相對標準偏差(RSD)分布圖的結(jié)果顯示，正離子中86.7%的代謝物的RSD小于30%，累積占據(jù)總峰面積的94.84%(圖3(a))；負離子中95.15%的代謝物的RSD小于30%，累積占據(jù)總峰面積的99.66%(圖3(b))，上述結(jié)果表明該分析過程儀器狀態(tài)穩(wěn)定良好，獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可以滿足樣品的脂質(zhì)組學分析要求.

(a)正離子模式

(b)負離子模式圖2 QC樣品在正、負離子模式下的PCA圖

(a)正離子模式

(b)負離子模式圖3 正、負離子模式下QC樣品中所有脂質(zhì)的RSD分布圖(藍色柱形圖表示相應(yīng)相對標準偏差范圍內(nèi)的峰個數(shù)占總峰數(shù)的百分比，紅色折線表示峰面積累計值所占的百分比)

2.3 黑茶和杜仲葉“發(fā)花”前后脂類變化規(guī)律的分析

為了研究原料和“發(fā)花”工藝對茯茶脂類代謝的影響，將黑茶和杜仲葉“發(fā)花”前后的樣品導入SIMCA-P 進行有監(jiān)督的PLS-DA分析(圖4(a)).從圖中可以看出，原料的影響大于“發(fā)花”工藝的影響，不同原料的茯茶在第一主成分(PC1)上具有明顯的分離趨勢，“發(fā)花”前后的茯茶樣品主要在第二主成分(PC2)上具有明顯的分離趨勢.

分別對黑茶“發(fā)花”前后和杜仲葉“發(fā)花”前后的樣品進行PLS-DA分析(圖4(b)和圖4(c))，可以看出黑茶和杜仲葉“發(fā)花”前后均呈明顯的分離趨勢，表明在脂質(zhì)組學水平上“發(fā)花”后茶葉樣品所含的脂類物質(zhì)發(fā)生了顯著的變化.

(a)黑茶和杜仲葉“發(fā)花”前后樣品的PLS-DA得分圖

(b)黑茶“發(fā)花”前后樣品的PLS-DA得分圖

(c)杜仲葉“發(fā)花”前后樣品的PLS-DA得分圖圖4 樣品“發(fā)花”前后的PLS-DA得分圖

單變量分析篩選“發(fā)花”前后脂質(zhì)分子.在已鑒定出的414種脂質(zhì)中，共篩選出218個差異脂質(zhì)分子.如圖5所示，僅與黑茶“發(fā)花”前后有關(guān)的脂質(zhì)共113種，僅與杜仲葉“發(fā)花”前后有關(guān)的脂質(zhì)共44種，與“發(fā)花”工藝相關(guān)的脂質(zhì)有61種.

圖5 差異代謝物的韋恩圖

為了清楚地展示這些脂質(zhì)在黑茶、杜仲葉茯茶“發(fā)花”前后的變化規(guī)律，采用柱形圖對這61個脂質(zhì)分子按照類別進行分析比較(圖6).從圖6可以看出，MGMG、OAHFA、PE和長鏈TG的含量在兩種茯茶中有相同的變化規(guī)律.其中，MGMG和OAHFA的含量在兩種茶樣“發(fā)花”后均增加，PE和長鏈TG的含量“發(fā)花”后均減少.DG的含量在以黑茶為原料的茶樣加工過程中減少，而在以杜仲葉為原料的茶樣加工過程中增加.

(a)單半乳糖基單?；视王?/p>

(b)甘油二酯

(c)磷脂酰乙醇胺

(d)(O-?；?-ω-羥基脂肪酸

(e)長鏈甘油三酯圖6 五類脂質(zhì)在茶葉加工過程中相對含量的變化情況(相對強度=某一化合物的峰面積/所有化合物的總峰面積.DZ-before：杜仲葉“發(fā)花”前，DZ-after：杜仲葉“發(fā)花”后，T-before：黑茶“發(fā)花”前，T-after：黑茶“發(fā)花”后)

采用Mev 4.7.4軟件分別對與黑茶有關(guān)的113種脂質(zhì)、與杜仲葉有關(guān)的44種脂質(zhì)進行聚類分析[29]，其結(jié)果如圖7所示.

從圖7(a)和7(b)可以看出，以黑茶為原料的茶樣在加工過程中脂質(zhì)相對含量的變化趨勢可分為兩類：“發(fā)花”后含量增加的脂類分子：Cer、MGMG、PA、OAHFA、LPC、LPG、PI、短鏈TG；“發(fā)花”后含量減少的脂類分子：DGDG、MGDG、LPE、DG、PG、CL、PS、PE、長鏈TG.

從圖7(c)可以看出，以杜仲葉為原料的茶樣在加工過程中脂質(zhì)相對含量的變化趨勢亦可分為兩類：“發(fā)花”后含量增加的脂類分子：短鏈TG、CL、LPA、LPI、PI、LPC、DG、PC、PG、Cer；“發(fā)花”后含量減少的脂類分子：長鏈TG、MGDG、DGDG.

茯茶中的優(yōu)勢微生物種群-冠突散囊菌在適宜的“發(fā)花”條件下大量生長繁殖.冠突散囊菌不僅可以利用茶葉作為原料合成自身所需的脂類，亦可產(chǎn)生各種胞外酶(如多酚氧化酶、纖維素酶等)催化茶葉中相關(guān)物質(zhì)發(fā)生氧化、降解和轉(zhuǎn)化等反應(yīng)[4,5,30].

甘油糖脂類(MGMG、MGDG、DGDG)是植物葉綠體類囊體膜中含量最豐富的脂質(zhì)[31].在本研究中，黑茶和杜仲葉“發(fā)花”后，MGDG和DGDG含量均下降，而MGMG含量增加，這提示“發(fā)花”工藝可促進冠突散囊菌氧化降解乳糖二酰甘油脂為乳糖單酰甘油脂.

磷脂類是構(gòu)成細胞膜脂的主要成分.“發(fā)花”后黑茶中含量降低的磷脂包括LPE、CL、PG、PS、PE，而含量升高的磷脂包括PA、LPC、LPG、PI.杜仲葉中大多數(shù)磷脂類在“發(fā)花”后含量升高，包括CL、LPA、LPI、PI、LPC、PC、PG等.黑茶和杜仲葉在“發(fā)花”前后磷脂類的含量差別較大，這可能是因為兩種茶樣原料不同導致冠突散囊菌代謝轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物有所差異.

(a)黑茶中Cer、MGMG、PA、OAHFA、LPC、LPG、PI、DGDG、MGDG、LPE、DG、PG、CL、PS 、PE含量的變化 (b)黑茶中TG含量的變化 (c) 杜仲葉中CL、LPA、LPI、PI、LPC、DG、PC、PG、Cer、MGDG、DGDG、TG含量的變化圖7 黑茶和杜仲葉“發(fā)花”前后差異脂質(zhì)變化熱圖

?；视椭侵参镏凶钬S富的儲存脂.黑茶和杜仲葉“發(fā)花”后長鏈TG的含量降低，而短鏈TG的含量增加，這提示對于兩種原料，“發(fā)花”工藝會促進冠突散囊菌將長鏈TG氧化降解為短鏈TG.此外，本研究中黑茶“發(fā)花”后DG的含量減少，而杜仲葉“發(fā)花”后含量增加，可能與兩種原料基質(zhì)不同密切相關(guān).

鞘脂類是脂筏的重要組成部分，可維持細胞膜的完整性.本研究發(fā)現(xiàn)由黑茶和杜仲葉制作的茯茶中Cer含量較其對應(yīng)原料均有不同程度的升高，這提示“發(fā)花”過程中冠突散囊菌自身的神經(jīng)酰胺代謝增強.

3 結(jié)論

本研究采用基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道肼高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q Exactive MS)的脂質(zhì)組學方法，分析比較以黑茶和杜仲葉為原料制成的茯茶在“發(fā)花”前后的脂類分子的變化規(guī)律.

結(jié)果表明，對于黑茶，“發(fā)花”工藝可以提高Cer、MGMG、PA、OAHFA、LPC、LPG、PI、短鏈TG的含量；降低DGDG、MGDG、LPE、DG、PG、CL、PS、PE、長鏈TG的含量；對于杜仲葉，“發(fā)花”工藝可以提高短鏈TG、CL、LPA、LPI、PI、LPC、DG、PC、PG、Cer的含量；降低長鏈TG、MGDG、DGDG的含量.本研究可為開發(fā)多樣化茯茶制品、進一步發(fā)展茯茶產(chǎn)業(yè)提供科學依據(jù).