硒納米顆粒的生物合成及其對孔雀石綠吸附性能的研究

陳 喆，曹 凱，程園園

(1.安徽大學 資源與環(huán)境工程學院，安徽 合肥230601；2.濕地生態(tài)保護與修復安徽省重點實驗室（安徽大學），安徽 合肥230601；3.安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥230601)

近年來，染料作為使織物獲得色澤的有機化合物，在生產活動中使用愈加頻繁.然而，染料的廣泛使用對環(huán)境中的水體造成了污染[1-2].三苯甲烷類染料廢水是典型的化工業(yè)廢水，具有致癌、致畸、致突變等特點.其中，孔雀石綠就是典型的三苯甲烷類染料，由于其高效的殺菌性，一度被廣泛利用在漁業(yè)生產中.對環(huán)境水體造成了巨大的污染.因此，去除廢水中的染料迫在眉睫.

眾多物理化學生物的方法已被應用于凈化染料廢水.其中，吸附作為一種簡單、靈活、高效的方法一直備受青睞.近年來，具有良好吸附量、快吸附速率的吸附材料得到越來越多的關注，納米顆粒由于其高比表面積，常作為高效的吸附劑來使用，如Se-NPs、納米ZnO和AgNPs[3-5].然而，現(xiàn)有制備方法常存在環(huán)境污染大、成本高、合成過程復雜、反應條件苛刻且易團聚等缺點，故尋求操作簡單、經濟實用、綠色環(huán)保的合成方法尤為重要.部分微生物如某些細菌、真菌和酵母菌能夠在一定濃度的金屬離子溶液中存活、生長并氧化還原這些金屬離子，將其轉換成對應的納米顆粒[6].故利用微生物還原氧化污染物，合成所需要的納米顆粒無疑是獲得納米顆粒的一種綠色環(huán)保的方式.

本實驗室從浙江舟山雙峰鹽場的土壤中分離出菌株膠紅酵母R.mucilaginosaPA-1，該菌株在亞硒酸鹽的還原中展現(xiàn)了較高的能力.以孔雀石綠為模型，研究了合成的Se-NPs吸附廢水中染料的能力，為污染物的治理提供新思路.

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗菌株R.mucilaginosaPA-1篩選自浙江舟山雙峰鹽場的土壤中[7].

1.1.2 試劑 菌株PA-1用R2A培養(yǎng)基(酪蛋白氨基酸0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、蛋白胨0.5 g/L、酵母提取物0.5 g/L、七水硫酸鎂0.05 g/L、磷酸氫二鉀0.3 g/L)在30 ℃、180 r/min條件下進行培養(yǎng).在厭氧培養(yǎng)基(磷酸氫二鉀0.225 g/L、磷酸二氫鉀0.225 g/L、氯化鈉0.46 g/L、硫酸銨0.255 g/L、七水硫酸鎂0.024 g/L、葡萄糖10 g/L、4-羥乙基哌嗪乙磺酸4.766 g/L、微量元素5 mL/L)中還原.本實驗中采用的試劑純度均為分析純，Na2SeO4采購自Sigma-Aldrich公司.

1.2 Se(Ⅳ)的測定方法亞硒酸鹽濃度的測定參照文獻[8].樣品經離心(10 000 r/min，10 min)后，取400μL的上清液，加入200μL的4 mol/L HCl和200μL的1 mol/L抗壞血酸，顯色10 min，在紫外分光光度計500 nm下測定Se(Ⅳ)的濃度.

1.3 Se-NPs的生物合成細菌在30℃、180 r/min好氧培養(yǎng)12 h.離心收集(6 000 r/min，5 min)，用厭氧培養(yǎng)基重懸.以初始濃度OD600=0.5 將菌株接種至含有不同濃度Na2SeO3的厭氧培養(yǎng)基中.以葡萄糖作為唯一碳源，Na2SeO3作為電子受體[9].

1.4 Se-NPs的原位表征取還原24 h后的4 mL樣品，1 000 r/min離心10 min去上清，以乙醇固定.

利用TEM觀察樣品的形貌特征. 再取還原24 h后的樣品，12 000 r/min離心收集后冷凍干燥，EDS、FTIR分析樣品.

1.5 Se-NPs還原條件的優(yōu)化厭氧條件下，考查底物濃度(0.5，1，2，5，10，15 mmol/L Na2SeO3)、pH值(2，4，6，8，10)、溫度(25，30，35℃)對硒還原的影響.

1.6 染料吸附實驗取定量吸附劑(0.3 g/L Se-NPs)于錐形瓶中，向其加入質量濃度5～40 mg/L的模擬印染廢水(MG)，調節(jié)pH值(5～10)，在轉速200 r/min，室溫條件下進行吸附.樣品經1 h吸附后離心(12 000 r/min，5 min).在617 nm處測其吸光度.MG的吸附量計算如下：

其中，qt是t時的吸附量，ρ0是初始質量濃度，ρt是吸附t時的質量濃度，V是溶液體積，m是Se-NPs的質量.

染料吸附后，10 000 r/min離心10 min，收集Se-NPs.用100 mmol NaCl重懸，循環(huán)利用Se-NPs.脫附效率由以下方程計算：

為了實驗Se-NPs的重復利用性，進行了5個連續(xù)的吸附/脫附循環(huán).循環(huán)去除效率計算如下：

2 結果與分析

2.1 Se-NPs的還原如圖1所示，厭氧條件下，接入菌株PA-1培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基由無色變?yōu)榧t色，對照組顏色不變.有研究指出，反應溶液呈紅色即代表有Se-NPs的生成[10-11].因此，推測菌株PA-1具有合成Se-NPs的能力.

圖1 菌株PA-1還原Se(Ⅳ)Fig.1 The reduction of Se(Ⅳ) by PA-1

為了進一步證明生成了硒納米顆粒，進行了一系列的物理表征.如圖2所示，TEM表明，形成的納米顆粒呈現(xiàn)規(guī)則的圓形，直徑范圍為30～100 nm，平均粒徑為60 nm左右.如圖2(c)所示，EDS分析證實了納米顆粒的主要成分為元素硒.此外，觀測到C、N、O的峰，可能是源于生物分子，如酶、細菌生物材料或包裹在Se-NPs上的多糖和蛋白質.Cu信號來源于銅片. 如圖2(e)所示，Se-NPs在261 nm處有明顯的吸收峰，表明Se-NPs的合成.

文獻[12]中所述，胞外聚合物(EPS)等細胞分泌物會附著在Se-NPs的表面，EPS有助于Se-NPs的分散并阻止其聚集，因此，無需添加外部穩(wěn)定劑即可以提高納米材料的穩(wěn)定性.通過比較菌株PA-1與生物合成的硒納米顆粒(Bio-Se NPs)的FTIR，如圖2(f)所示，二者光譜形狀類似.3 413 cm-1為胺基和羧酸基團的伸縮振動，證明了葡萄糖中O-H基團和蛋白質中N-H基團的存在[12-14].1 652、1 556、1 244 cm-1的特征峰對應于酰胺I、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ，證明了蛋白質的存在[15].1 070～1 085 cm-1處的多種峰，證明了碳水化合物的存在.FTIR譜圖表明，Bio-Se NPs的表面包裹了EPS.據(jù)報道，Se-NPs表面的EPS在硒還原反應過程中起著重要的作用.EPS中的蛋白質和其他生物大分子被用作元素Se的還原劑，其中膜表面上的蛋白質主要屬于還原酶和氧化還原酶，負責將Se(Ⅳ)還原為Se-NPs[16].整個還原過程是通過電子傳遞鏈上的氧化還原酶由NADPH/NADH電子傳遞開始的.蛋白質表面電子和Se(Ⅳ)之間的靜電相互作用，導致還原反應，從而形成Bio-Se NPs.

圖2 Se-NPs的物理表征Fig.2 Physical characterization of Se-NPs

2.2 硒還原條件的優(yōu)化Bio-Se NPs的生物合成也受到一些環(huán)境參數(shù)的影響，包括底物濃度、pH和溫度.如圖3所示，菌株PA-1只在0.5 mmol/L的Na2SeO3中還原完全.在pH=8的條件下，Se(Ⅳ)的還原效率優(yōu)于其他，28 h即能完全還原.在一定范圍內，溫度的提高對硒的生物還原具有顯著的促進作用.菌株PA-1在35℃下還原最快，20 h即可還原97%，24 h完全還原.

圖3 不同條件下Se(Ⅳ)的還原效率Fig.3 Se(Ⅳ)reduction efficiency under different conditions

2.3 染料吸附與脫附實驗本研究探究了不同條件下Bio-Se NPs對MG的吸附能力.如圖4(a)所示，10 mg/L的MG由藍色變?yōu)闊o色，表明MG被Bio-Se NPs吸附.UV-Vis也證實了MG被吸附脫色.據(jù)報道[5-17]，材料的吸附性能往往受體系內pH值變化的影響. pH值的變化不僅會影響吸附劑的表面性質，還會對吸附質的溶解度及其質子化程度產生重要影響.例如體系在高pH值時，溶液中存在大量的OH-，使得Bio-Se NPs帶負電荷，從而使得材料對陽離子染料(MG)的吸附能力增強.而當pH值變低時，材料上帶正電荷的吸附位點增多，從而與陽離子染料之間產生庫倫斥力，不利于材料對染料的吸附.如圖4(b)所示，MG的去除效率隨pH的增加明顯提高，與之前的報道結果一致.說明材料Bio-Se NPs與陽離子染料MG之間主要吸附機理是靜電作用.吸附劑的再生及重復利用能力可以大大降低其使用成本并且使吸附過程變得更具競爭力.因此，我們探究了Bio-Se NPs的循環(huán)再利用性.實驗結果表明，經5次吸附-脫附循環(huán)過后，Bio-Se NPs的吸附效率仍高達82.12%（圖5（c））.

圖4 MG的吸附及脫附實驗Fig.4 MG adsorption and desorption experiment

如圖5(a)、(b)所示，pH=10、30℃條件下，探究了MG的接觸時間對吸附容量的影響.實驗結果表明，MG的吸附速率極快，不同濃度的MG均能在10 min內達到吸附平衡.此外，還建立了準一級、準二級和Elovich動力學模型，以闡明其吸附機理.

準一級動力學模型：

其中qe和qt分別是平衡和時間t時的吸附量(mg·g-1).k1、k2分別是準一級、準二級速率常量(h-1)，A、k是Elovich方程的常量.動力學參數(shù)如表1所示，MG的準一級動力學方程的R2為0.999，高于準二級和Elovich模型.即Bio-Se NPs對MG的吸附動力學符合準一級模型，是一種反應速率與一種反應物濃度呈線性關系的擴散控制的吸附反應過程.

了解平衡吸附等溫線對于充分了解Bio-Se NPs吸附性能具有重要意義.我們用如下模型來擬合.

Langmuir方程：

其中，qm(mg·g-1)是吸附劑最大容量，KL(L·mg-1)平衡吸附常量；KF(L·mg-1)和1/n是代表吸附容量和吸附強度的Freundlich常量，A和B是Temkin常量.吸附等溫線及其擬合參數(shù)如圖5(d)及表2所示.其中，Langmuir的相關系數(shù)最高，說明吸附劑表面均勻，吸附物不能在表面上遷移，吸附質之間沒有相互作用，吸附是單層的.且當吸附劑表面被單層吸附物覆蓋時，發(fā)生最大吸附[18].根據(jù)Langmuir模型，303、313、323 K下MG的qm分別為1 355.39、1 095.49、898.62 mg/g.Freundlich常量(n＞2)說明吸附容易進行[19].

熱力學參數(shù)能夠分析吸附過程的自發(fā)性、隨機性、吸熱性以及放熱性.根據(jù)

Van’t Hoff方程：

圖5 Bio-Se NPs對MG的吸附性能Fig.5 Adsorption performance of Bio-Se NPs for MG

表1 Bio-Se NPs吸附MG的動力學模型參數(shù)Tab.1 Parametersof kinetic model of Bio-Se NPs for the MG adsorption

表2 Langmuir,Freundlich and Temkin吸附等溫線的常量、相關系數(shù)和q mTab.2 Langmuir,Freundlich and Temkin adsorption isotherm constant,correlation coefficient and q m

其中，KD=Ke/ρe，R為通用氣體常量(8.314 J/(mol·K))；T為熱力學溫度(K)；?Hθ為焓(J/mol)，?Sθ為熵(J/mol)，?Gθ(kJ/mol)為自由能.熱力學參數(shù)的值見表3.不同溫度下，?Gθ值為負.這表明MG在Bio-Se NPs上的吸附是一種自發(fā)的過程.隨著溫度的升高，ΔGθ的增高，表明在較高的溫度下，MG的吸附過程更不利.MG的吸附反應是放熱反應(ΔHθ＜0)，ΔSθ＜0，說明MG 被吸附到Bio-Se NPs上，使得吸附質分子失去部分自由度(包括但不限于平動和轉動)，從而使熵減小，表明此過程是一個趨于有序的吸附過程[20].

表3 Bio-Se NPs吸附MG的熱力學參數(shù)Tab.3 Thermodynamic parameters for MG adsorption onto Bio-Se NPs.

為了更好地解釋反應的吸附機理，將Bio-Se NPs吸附脫附循環(huán)5次，利用FTIR、XPS及XRD對吸附前后的Bio-Se NPs進行分析.如圖6(c)所示，Bio-Se NPs吸附前后的XRD衍射光譜的數(shù)據(jù)符合硒的JCPDS(編號：06-0362)標準卡片，且吸附前后并無明顯變化. 如圖6(f)所示，吸附MG后的Bio-Se NPs樣品的FTIR譜圖出現(xiàn)了MG分子的特征峰，其原因是在材料表面吸附了大量MG分子，使得吸附后的樣品兼具Bio-Se NPs和MG的特征峰.圖6(a)、(b)、(d)、(e)為吸附前后的Bio-Se NPs的XPS譜.Se 3d5/2峰分別處于56.7、55.9 eV和55.5 eV，說明Bio-Se NPs中的Se元素為0價硒. 此外，吸附MG后的Bio-Se NPs譜圖(圖6(b))中，出現(xiàn)了 Na 1s、Cl 2p的新峰，說明有部分脫附劑吸附在了吸附劑表面，除此之外譜圖沒有明顯變化，表明吸附MG之后吸附劑的化學組成并沒有發(fā)生變化，說明吸附過程為物理吸附.

圖6 Bio-Se NPs吸附MG前后的表征譜圖Fig.6 Characterization of Bio-Se NPs before and after MG adsorption

3 結論

(1) 通過R.mucilaginosaPA-1合成Bio-Se NPs.波譜表征結果表明，合成的為表面包裹著EPS、分散性良好的、球形Bio-Se NPs.其顆粒粒徑大小分布范圍為30～100 nm，平均粒徑為60 nm左右.進一步探究了Bio-Se NPs合成的最適條件：OD600=0.5，0.5 mmol Na2SeO3，pH=8，35℃.最適條件下，Bio-Se NPs的合成僅需24 h.

(2)研究了Bio-Se NPs對MG的吸附能力以及影響因素，如pH、溫度.Bio-Se NPs在pH=10下對陽離子染料具有很大的去除潛力.吸附動力學研究表明，準一級動力學模型可以很好地擬合Bio-Se NPs對MG的動力學吸附，吸附過程為物理吸附. 等溫吸附研究表明，MG在Bio-Se NPs上的吸附等溫線符合Langmuir模型，屬單分子層吸附.303～323 K范圍內，染料去除率隨溫度的升高而降低，吸附量分別為1 355.39、1 095.49 mg/g和898.62 mg/g，對MG的去除能力優(yōu)于傳統(tǒng)生物質材料.吸附熱力學研究表明，MG在Bio-Se NPs上的吸附是一種自發(fā)的放熱反應.此外，Bio-Se經5次循環(huán)后，吸附能力依然優(yōu)異，MG去除率高達80%以上.