腐乳丁酸及產(chǎn)丁酸菌發(fā)酵特性分析

馬艷莉，段 哲，梁靜靜，李素萍，丁玉峰

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473004；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

腸道微生態(tài)健康是近年來(lái)備受關(guān)注的健康問(wèn)題，發(fā)酵食品對(duì)微生態(tài)的影響引起世界關(guān)注，國(guó)際上對(duì)發(fā)酵食品研究已深入到腸道微生態(tài)領(lǐng)域[1-3]。腐乳是大豆經(jīng)磨漿、成坯、前酵、腌制、后酵等過(guò)程制作的傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品，歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，其中最具特色的為青方腐乳[4]。青方腐乳又被稱為“臭豆腐”，外觀呈青色，更多呈豆青色，是眾多腐乳種類中最具特色的一類。通常認(rèn)為，青方腐乳在發(fā)酵過(guò)程中因部分蛋白質(zhì)降解，游離出硫氫基和氨基，產(chǎn)生具有硫臭和氨臭等特殊強(qiáng)烈刺激性氣味，因此又被稱為臭腐乳。

短鏈脂肪酸是指碳原子數(shù)小于6的有機(jī)脂肪酸，近年來(lái)，由于發(fā)現(xiàn)其在微生態(tài)健康方面的重要作用而被廣泛關(guān)注[5-7]。丁酸是最重要的短鏈脂肪酸，在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、維持腸道微生態(tài)健康方面發(fā)揮積極作用[8]，丁酸還是組蛋白去乙?；傅囊种苿兄诿庖呒?xì)胞育成，具有抗細(xì)胞增生、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的能力[9]。目前已有多個(gè)丁酸的前體藥物被合成和研究[10-11]。因此，在食品范圍內(nèi)尋找含有丁酸的產(chǎn)品具有重要意義。但是，由于高濃度丁酸具有刺激性臭味，往往被作為破壞食品風(fēng)味品質(zhì)的組分，前期研究發(fā)現(xiàn)，丁酸是青方腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味成分，風(fēng)味閾值較低，對(duì)青方腐乳特征性臭味貢獻(xiàn)較大，在青方腐乳中含量為2.44 μg/g[12]。青方腐乳“聞著臭，吃著香”的獨(dú)特風(fēng)味為部分人所喜愛(ài)，甚至是嗜愛(ài)，有一定的消費(fèi)基礎(chǔ)，因此，青方腐乳中高丁酸含量不會(huì)引起風(fēng)味品質(zhì)下降，青方腐乳有可能成為丁酸的載體，促進(jìn)丁酸消費(fèi)，有助于其功能性發(fā)揮。

研究表明，多種微生物可以產(chǎn)丁酸，丁酸梭菌（Clostridium butyricum）是最受關(guān)注、研究最多的產(chǎn)丁酸微生物[13-14]。1933年，丁酸梭菌最早在日本被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，目前將其活菌制劑作為整腸劑用于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡已有60多年。作為益生菌，丁酸梭菌在維持腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防腫瘤發(fā)生等方面有很好的功效[15]。

本研究在前期確定丁酸是青方腐乳特征性風(fēng)味物質(zhì)[12]，并從青方腐乳中分離鑒定出丁酸梭菌BP01[16]的基礎(chǔ)上，使用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法比較不同類型腐乳丁酸及其他短鏈脂肪酸含量，并研究青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中丁酸變化規(guī)律，對(duì)亨蓋特厭氧滾管法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)從青方腐乳中分離鑒定的丁酸產(chǎn)生菌部分發(fā)酵特性進(jìn)行分析，研究結(jié)果將有利于發(fā)現(xiàn)富含丁酸的食品資源，并為丁酸梭菌進(jìn)一步應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青方、紅方、白方、低鹽紅腐乳及不同品牌青方腐乳為市售商品，購(gòu)自北京某大型超市。所用菌種大腸桿菌（Escherichia coliO78）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus26003）來(lái)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）為實(shí)驗(yàn)室保藏。

短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、酪蛋白 美國(guó)Sigma公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉 英國(guó)Oxoid公司；乙腈（色譜純） 美國(guó)Dima公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10A HPLC儀、UV mini 1240紫外-分光光度計(jì)日本Shimadz公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；A05077厭氧培養(yǎng)罐 重慶江雪科技有限公司；YXQ-SG46-280A蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)、TGL-16B冷凍離心機(jī) 上海安亭有限責(zé)任公司；KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WSZ-100A渦旋振蕩器 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁酸及其他短鏈脂肪酸含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定樣品中丁酸及其他短鏈脂肪酸的含量，參考Zhang Jianhua等[17]的方法，略有改動(dòng)。

樣品提取液制備：稱取樣品凍干粉0.50 g于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，超聲振蕩30 min，8 000 r/min離心20 min，取上清液，過(guò)0.45 μm濾膜制得樣品提取液。

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱：Shimadzu SCR-101（H）（7.9 mm×300 mm，10 μm）；流動(dòng)相：5 mmol/L硫酸溶液；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.3.2 丁酸產(chǎn)生菌發(fā)酵特性測(cè)定

1.3.2.1 生長(zhǎng)曲線和pH值曲線測(cè)定

將丁酸產(chǎn)生菌活化后稀釋到104CFU/mL，取0.1 mL接種到9.9 mL梭菌增殖培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，間隔適當(dāng)時(shí)間分別取厭氧管混勻后測(cè)其OD600nm和pH值，繪制生長(zhǎng)曲線和pH值曲線。

1.3.2.2 不同碳源培養(yǎng)基配制及丁酸產(chǎn)生菌的培養(yǎng)

以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基按照梭菌增殖培養(yǎng)基（RCM培養(yǎng)基）配制：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸膏3.0 g、牛肉浸膏10.0 g、葡萄糖5.0 g、三水合乙酸鈉3.0 g、氯化鈉5.0 g、半胱氨酸鹽0.5 g、0.5%美藍(lán)0.2 mL、瓊脂15.0 g（固體培養(yǎng)基添加）、蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0，滅菌20 min備用。

以乳酸為碳源的培養(yǎng)基配制：將梭菌增殖培養(yǎng)基中葡萄糖替換為同樣含量的乳酸；以葡萄糖和乳酸為碳源的培養(yǎng)基配制：將梭菌增殖培養(yǎng)基中葡萄糖減半，使用乳酸替換。將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產(chǎn)生菌接種到9.9 mL以上3 種培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定其發(fā)酵液中丁酸含量。

1.3.2.3 抑菌能力實(shí)驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)丁酸產(chǎn)生菌抑菌能力進(jìn)行測(cè)定。以大腸桿菌O78、金黃色葡萄球菌26003和蠟樣芽孢桿菌作為指示菌研究其抑菌能力，每個(gè)菌株活化2 次，并將菌懸液濃度調(diào)整為107CFU/mL。吸取稀釋后的指示菌菌懸液0.1 mL，涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上并靜置5 min，使用直徑為6 mm的無(wú)菌打孔器打孔，吸取50 μL離心后的丁酸產(chǎn)生菌發(fā)酵液，分別加入不同孔中，在厭氧條件下培養(yǎng)24 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并記錄包括孔直徑在內(nèi)的抑菌圈直徑，同時(shí)用未接種BP01菌株的RCM培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

1.3.2.4 食鹽耐受性實(shí)驗(yàn)

在梭菌增殖培養(yǎng)基中分別添加0、5、8、11 g/100 mL的食鹽，將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產(chǎn)生菌接種到9.9 mL以上4 種培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)其OD600nm值，研究其食鹽耐受性。

1.3.2.5 溫度適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

將0.1 mL活化后稀釋到104CFU/mL的丁酸產(chǎn)生菌接種到9.9 mL梭菌增殖培養(yǎng)基中，分別在20、28、37 ℃和45 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，測(cè)其OD600nm值，研究其溫度適應(yīng)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析，Duncan多重檢驗(yàn)確定數(shù)據(jù)間的差異，P＜0.05，差異顯著。每個(gè)樣品測(cè)定3 次，測(cè)定其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 青方腐乳丁酸及其他短鏈脂肪酸分析

短鏈脂肪酸是指碳鏈中碳原子數(shù)小于6的有機(jī)脂肪酸，近年研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和調(diào)控基因表達(dá)等方面發(fā)揮積極作用[18]。作為短鏈脂肪酸中最主要的代表，丁酸是結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用，受到廣泛關(guān)注[19]。在前期對(duì)青方腐乳關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，丁酸是青方腐乳關(guān)鍵性風(fēng)味成分之一，對(duì)其特征性風(fēng)味形成起重要作用，在此基礎(chǔ)上，使用HPLC法測(cè)定了同一品牌青方、紅方、白方和低鹽紅腐乳的丁酸含量，結(jié)果如圖1所示，青方腐乳丁酸含量明顯高于其他3 種類型腐乳，其含量達(dá)到25.4 mg/g（干質(zhì)量，下同），而紅方、白方和低鹽紅腐乳丁酸含量較低，且三者之間沒(méi)有顯著性差異。不同類型腐乳發(fā)酵方式最大的區(qū)別在于后酵湯料中添加的輔料不同，紅方腐乳誘人的紅色是由于后酵過(guò)程中添加了紅曲米，紅方腐乳后酵湯料中還添加面曲、白酒、食鹽、糖、香料等輔料；白方腐乳在生產(chǎn)過(guò)程中不添加紅曲米，保持本色，但是添加白酒；低鹽腐乳生產(chǎn)過(guò)程中降低了食鹽使用量，添加白酒；青方腐乳與紅方、白方、低鹽腐乳相比后酵湯料不添加白酒，湯料中只含有食鹽、黃漿水和少量花椒，沒(méi)有白酒、外源蛋白酶、紅曲和面曲等物質(zhì)引入，使青方腐乳后酵過(guò)程微生物分布與其他3 種腐乳存在較大差異，已有研究表明，丁酸梭菌生長(zhǎng)會(huì)受到乙醇的抑制，而青方腐乳后酵過(guò)程不添加乙醇，這可能帶來(lái)青方腐乳后酵過(guò)程丁酸梭菌快速增殖，丁酸梭菌代謝產(chǎn)生丁酸，使青方腐乳丁酸含量顯著高于其他類型腐乳。

圖1 不同類型腐乳丁酸含量比較Fig.1 Comparison of butyric acid contents among different types of sufu

進(jìn)一步對(duì)其他3 種品牌青方腐乳丁酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測(cè)定的3 種品牌腐乳丁酸含量也較高，均超過(guò)15 mg/g，此外，還測(cè)定了20多種豆豉和豆醬樣品的丁酸含量，發(fā)現(xiàn)它們不含或僅含少量丁酸（數(shù)據(jù)未給出）。這些結(jié)果表明，青方腐乳富含丁酸。丁酸由于在促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡、防治結(jié)腸炎和大腸癌等疾病方面有積極的作用而備受關(guān)注，一些以丁酸為前體的藥物被研究和開(kāi)發(fā)。自然存在的丁酸一般由微生物發(fā)酵產(chǎn)生，一些發(fā)酵食品，如清國(guó)醬[20]、納豆[21]、干酪[22]等含有丁酸，其中，文獻(xiàn)報(bào)道干酪丁酸含量為0.13～7.3 mg/g，與之相比，青方腐乳丁酸含量具有優(yōu)勢(shì)。但是，丁酸在高濃度時(shí)有不愉快氣味，限制了其在食品中功能性的發(fā)揮，而丁酸是青方腐乳特征性風(fēng)味之一，對(duì)青方腐乳“聞著臭，吃著香”的獨(dú)特風(fēng)味起貢獻(xiàn)作用，青方腐乳中高濃度丁酸不會(huì)對(duì)其風(fēng)味造成不良影響，可能為丁酸功能性發(fā)揮提供一個(gè)很好的載體。

圖2 不同類型腐乳其他短鏈脂肪酸含量比較Fig.2 Comparison of contents of other short-chain fatty acids among different types of sufu

對(duì)同一品牌的4 種腐乳樣品其他短鏈脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。青方腐乳乙酸和琥珀酸（丁二酸）含量最高，與其他3 種腐乳有顯著差異，但是青方腐乳乳酸含量最低，有文獻(xiàn)報(bào)道，乳酸在丁酸菌的作用下可轉(zhuǎn)化為丁酸[23]，Bourriaud等[24]也發(fā)現(xiàn)乳酸在腸道內(nèi)主要轉(zhuǎn)化為丁酸，所以青方腐乳的高丁酸含量可能和丁酸菌有關(guān)。白方腐乳乳酸和富馬酸（反丁烯二酸）含量最高，其乳酸含量達(dá)12.95 mg/g，約是青方腐乳的68.16 倍。Han Beizhong等[25]研究發(fā)現(xiàn)，白方腐乳中乳酸菌落數(shù)量較其他類型腐乳高，這可能和白方腐乳的高乳酸含量相關(guān)。從短鏈脂肪酸總量看，青方腐乳含量最高，白方腐乳次之，紅方腐乳和低鹽紅腐乳含量較低，這可能與不同類型腐乳生產(chǎn)工藝差異導(dǎo)致其微生物組成不同有關(guān)。

2.2 青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中丁酸及其他短鏈脂肪酸含量變化

圖3 青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中丁酸含量變化Fig.3 Changes in butyrate contents during production process of grey sufu

如圖3所示，白坯丁酸含量較低，僅為0.45 mg/g，接種雅致放射毛霉發(fā)酵48 h后，毛坯中丁酸含量明顯增加，約為白坯的5.21 倍，這與文獻(xiàn)報(bào)道丁酸一般由微生物發(fā)酵產(chǎn)生一致[26]。鹽腌過(guò)程導(dǎo)致丁酸含量減少，這可能與食鹽進(jìn)入坯體引起鹽坯固形物含量增加以及鹽坯水分流失相關(guān)。青方腐乳后發(fā)酵前期，特別是在后酵前30 d，丁酸含量上升迅速，隨后基本穩(wěn)定，在后酵第45天達(dá)到最大值，約為22.47 mg/g，繼續(xù)后發(fā)酵過(guò)程中，丁酸含量輕微降低。這表明，青方腐乳丁酸主要在后發(fā)酵前期產(chǎn)生，前期研究發(fā)現(xiàn)其他類型腐乳丁酸含量甚微，結(jié)合這一結(jié)論推測(cè)，不同類型腐乳丁酸含量差異由后發(fā)酵中微生物差異引起。

圖4 青方腐乳生產(chǎn)過(guò)程中其他短鏈脂肪酸含量變化Fig.4 Changes in contents of other short-chain fatty acids during production process of grey sufu

如圖4所示，在前酵和鹽腌過(guò)程中，毛坯短鏈脂肪酸含量最高，鹽坯次之，白坯最低，這與毛坯中微生物數(shù)量較多相關(guān)，因?yàn)橥ǔＵJ(rèn)為短鏈脂肪酸由微生物代謝產(chǎn)生[27]。從單個(gè)短鏈脂肪酸含量看，毛坯中乙酸和乳酸含量最高，與白坯和鹽坯有顯著性差異，毛坯和鹽坯中琥珀酸含量較高，與白坯有顯著性差異，但是毛坯、鹽坯和白坯中富馬酸含量都較低。青方腐乳后發(fā)酵過(guò)程中，乙酸和琥珀酸含量雖然在發(fā)酵中期有輕微波動(dòng)，但基本呈上升趨勢(shì)，在后酵結(jié)束時(shí)，含量分別達(dá)18.56 mg/g和6.21 mg/g。乳酸含量在青方腐乳后酵過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，特別是后酵前30 d下降明顯，導(dǎo)致青方腐乳后酵結(jié)束時(shí)，乳酸含量甚微，這可能與青方腐乳中乳酸在微生物作用下轉(zhuǎn)化為丁酸相關(guān)。

2.3 丁酸梭菌BP01的部分發(fā)酵特性分析

發(fā)酵食品中的丁酸大多由細(xì)菌產(chǎn)生，能產(chǎn)丁酸的微生物主要包括梭菌屬（Clostriduim）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、丁酸桿菌屬（Butyribacterium）等。前期研究發(fā)現(xiàn)青方腐乳丁酸含量顯著高于其他類型腐乳，所以對(duì)青方腐乳中丁酸產(chǎn)生菌進(jìn)行分離，得到1 株高產(chǎn)丁酸菌株，48 h培養(yǎng)液中丁酸濃度為6.48 mmol/L，對(duì)菌株命名為BP01，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為丁酸梭菌[16]。進(jìn)一步對(duì)丁酸梭菌BP01的部分發(fā)酵特性進(jìn)行研究，以期在青方腐乳發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用丁酸梭菌BP01，從而為提高青方腐乳丁酸含量提供參考。

圖5 BP01菌株生長(zhǎng)曲線和pH值曲線Fig.5 Growth curve of strain BP01 and pH variation in its fermentation broth

如圖5所示，菌株在RCM培養(yǎng)基中4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌落數(shù)指數(shù)上升，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)使培養(yǎng)基pH值快速下降。從培養(yǎng)液菌落數(shù)看，BP01在18 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，pH值穩(wěn)定在5.8左右，而后在約24 h由于形成芽孢，pH值略有上升。

圖6 碳源對(duì)BP01菌株產(chǎn)丁酸的影響Fig.6 Effect of carbon source on butyric acid-producing capacity of strain BP01

分別使用葡萄糖、乳酸、葡萄糖+乳酸作為碳源對(duì)BP01菌株進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，菌株均生長(zhǎng)良好，對(duì)其代謝終產(chǎn)物中的丁酸含量測(cè)定，圖6結(jié)果表明，BP01菌株可以利用葡萄糖和乳酸作為碳源生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生丁酸，雖然二者轉(zhuǎn)化丁酸的效率不同，但是可能因?yàn)锽P01菌株對(duì)兩種碳源利用率有差異，所以葡萄糖和乳酸作為單一碳源的代謝終產(chǎn)物中丁酸累積量沒(méi)有顯著差異。葡萄糖和乳酸同時(shí)作為碳源時(shí)，BP01菌株代謝終產(chǎn)物中丁酸含量明顯增加，是葡萄糖和乳酸單獨(dú)作為碳源時(shí)的3 倍多，可能是由于丁酸梭菌BP01在葡萄糖作為碳源存在的情況下代謝乳酸產(chǎn)生丁酸的效率提高，而在乳酸存在條件下，丁酸梭菌對(duì)葡萄糖的利用率也可以得到提升，二者產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，從而提高了BP01菌株代謝終產(chǎn)物中丁酸含量，這與胡小紅等[28]研究有類似之處，胡小紅等[28]從窖泥中分離鑒定丁酸梭菌BEY8，研究發(fā)現(xiàn)其能代謝乳酸產(chǎn)生丁酸，乳酸的轉(zhuǎn)化效率可進(jìn)行調(diào)控。這與本研究有類似之處。這為下一步實(shí)驗(yàn)提供思路，可以嘗試BP01菌株和乳酸菌共培養(yǎng)，利用乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸提高BP01菌株代謝終產(chǎn)物的丁酸含量，同時(shí)添加這兩種腸道微生態(tài)健康的益生菌到腐乳中，制作低鹽腐乳，增強(qiáng)其促進(jìn)腸道健康的功能性。

圖7 BP01菌株的抑菌性Fig.7 Antibacterial activity of strain BP01

傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中有時(shí)會(huì)檢測(cè)到某些致病微生物，對(duì)產(chǎn)品安全性造成一定隱患，因此，選擇能夠抑制致病菌的有益菌應(yīng)用于發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)保證發(fā)酵豆制品的安全性有很大現(xiàn)實(shí)意義。BP01菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽孢桿菌的抑制能力通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑表示，對(duì)照組是未接種BP01菌株的RCM培養(yǎng)液，其抑菌圈直徑為0 mm，說(shuō)明對(duì)照組RCM培養(yǎng)液對(duì)3 種致病菌無(wú)抑制作用，而由圖7可知，BP01菌株對(duì)3 種致病菌具有抑制作用，但抑菌能力有所差異，抑制大腸桿菌能力最強(qiáng)，與其他兩種菌有顯著差異，抑菌圈直徑達(dá)12.5 mm。BP01菌株對(duì)蠟樣芽孢桿菌抑制能力略強(qiáng)于金黃色葡萄球菌，但二者無(wú)顯著差異。文獻(xiàn)報(bào)道，丁酸梭菌具有抑制致病菌的能力[29]，與本研究一致。因此，作為一種益生菌，丁酸梭菌具有應(yīng)用于發(fā)酵食品，提高發(fā)酵食品微生物安全性的潛力。

圖8 BP01菌株對(duì)食鹽的耐受性Fig.8 Salt tolerance of strain BP01

傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品生產(chǎn)過(guò)程中一般會(huì)添加一定量食鹽，用于形成特定風(fēng)味、控制發(fā)酵過(guò)程、抑制腐敗微生物生長(zhǎng)等，因此，考察菌株對(duì)食鹽的耐受性對(duì)其在發(fā)酵豆制品中的潛在應(yīng)用十分必要。根據(jù)腐乳食鹽含量的現(xiàn)狀，設(shè)置5、8 g/100 mL和11 g/100 mL 3 個(gè)食鹽添加量，考察BP01菌株對(duì)食鹽的耐受性，使用OD600nm作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。如圖8所示，添加5 g/100 mL和8 g/100 mL食鹽時(shí)，BP01菌株生長(zhǎng)幾乎不受影響，其OD600nm對(duì)照（不添加食鹽）無(wú)顯著差異，當(dāng)食鹽添加量達(dá)11 g/100 mL時(shí)，BP01菌株的生長(zhǎng)受到輕微抑制，其OD600nm相對(duì)于對(duì)照下降12.34%，但仍可以較好生長(zhǎng)，這顯示BP01菌株可以耐受一定量的食鹽，具有應(yīng)用于含鹽食品的潛力。

發(fā)酵溫度會(huì)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品品質(zhì)及功能性產(chǎn)生影響[30-31]，在生產(chǎn)實(shí)踐中，一般會(huì)依據(jù)主要發(fā)酵菌種生長(zhǎng)特性形成固定的發(fā)酵溫度，因此，應(yīng)對(duì)菌株的溫度適應(yīng)性進(jìn)行研究，以考察其應(yīng)用于特定發(fā)酵豆制品的潛力。根據(jù)腐乳發(fā)酵溫度的現(xiàn)狀，設(shè)置20、28、37 ℃和45 ℃研究BP01菌株的溫度適應(yīng)性。如圖9所示，在28 ℃和37 ℃條件下培養(yǎng)，BP01菌株生長(zhǎng)良好，OD600nm無(wú)顯著性差異，20 ℃和45 ℃條件下，BP01菌株生長(zhǎng)略顯緩慢，其OD600nm與37 ℃培養(yǎng)相比，分別降低19.08%和10.53%，但整體上，BP01菌株仍能較好生長(zhǎng)，顯示其具有一定的溫度適應(yīng)性。

圖9 BP01菌株對(duì)溫度的適應(yīng)性Fig.9 Temperature adaptability of strain BP01

3 結(jié) 論

本研究在前期確定丁酸是青方腐乳關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)上，分析青方腐乳丁酸及變化規(guī)律，進(jìn)一步研究從青方腐乳中分離鑒定的產(chǎn)丁酸菌的部分發(fā)酵特性，得出如下結(jié)論：1）青方腐乳富含丁酸，其含量遠(yuǎn)高于紅方、白方和低鹽紅腐乳，可作為丁酸潛在的消費(fèi)載體。2）丁酸主要在青方腐乳后酵前30 d產(chǎn)生，與青方腐乳后酵過(guò)程中丁酸梭菌密切相關(guān)；青方腐乳乳酸含量較低，并且在后酵過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，可能在特定微生物作用下轉(zhuǎn)化為丁酸。3）在前期實(shí)驗(yàn)從青方腐乳中分離鑒定丁酸產(chǎn)生菌的基礎(chǔ)上，研究了高產(chǎn)丁酸的丁酸梭菌BP01部分發(fā)酵特性，結(jié)果表明其培養(yǎng)過(guò)程中較快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)18 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，終產(chǎn)物pH值在5.8左右，能利用乳酸作為碳源；BP01菌株抑制大腸桿菌能力最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌也有抑制作用，能夠耐受一定濃度的食鹽，并表現(xiàn)出一定的溫度適應(yīng)性，有應(yīng)用于腐乳發(fā)酵潛力。