白蓮蓮房多糖分離純化、結構表征及抗氧化與免疫活性

馬廣強 李國群 吳 靜 熊 偉 吳 磊

(1.江西中醫(yī)藥大學生命科學學院，江西 南昌 330004；2.江西省科學院應用化學研究所，江西 南昌 330096)

植物多糖是一類重要的天然生物大分子。天然植物源多糖具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌、調節(jié)免疫等多種生物活性[1-2]，近年來，許多多糖已被廣泛地研究和應用于生物化學以及醫(yī)療行業(yè)，植物源多糖被公認為安全、高度穩(wěn)定和毒副作用小等優(yōu)點應用在醫(yī)藥和食品領域。

蓮(NelumbonuaferaGaertn)屬睡蓮科蓮屬，為多年生宿根水生草本植物[3]。目前，中國擁有的蓮品種多達800個以上，主要分布于福建、浙江、湖北、湖南、江蘇、安徽以及江西等地[4]。蓮富含生物堿、黃酮、糖苷、萜類、類固醇、脂肪酸、蛋白質、礦物質和維生素等化學成分，具有抗氧化、消炎、抗菌、抗心律失常、降血糖、止瀉、免疫調控等生理活性[5-9]。廣昌白蓮，中國國家地理標志產品。廣昌縣自古以來就被稱為“蓮鄉(xiāng)”，歷來被稱為“貢蓮”，為“蓮中珍品”，一直暢銷海內外。目前市面上出現了許多以荷葉、蓮子以及蓮子心為原料的產品，但是，在加工這些產品的過程中，會產生大量的下腳料——蓮蓬殼，目前只是作為廢棄物被丟棄，造成了極大的浪費。國內外目前對蓮蓬殼中化學成分及其藥用作用的相關研究鮮有報道，一直未得到重視。

課題組[10-11]前期曾對蓮房乙醇提取物化學成分及活性進行了研究。但是對蓮房多糖的研究仍處于空白。試驗擬通過水提醇沉法從白蓮蓮房中提取多糖，并對純化后的多糖理化性質進行分析，研究純化多糖的抗氧化與免疫調節(jié)活性，以期為蓮蓬殼廢棄物的高附加值開發(fā)與利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蓮房：廣昌縣白蓮科學研究所提供，由江西省科學院應用化學研究所徐剛研究員鑒定為白蓮的蓮房，樣本編號為LP-201708，已存放在江西省科學院應用化學研究所天然產物研究室的植物標本室；

RAW 264.7細胞：美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；

單糖標準品[D-葡萄糖(Glc，110833-201707)、D-半乳糖(Gal，100226-201506)、L-鼠李糖(Rha，111683-201502)、D-木糖(Xyl，111508-201605)和D-甘露糖(Man，140651-201504)]：中國食品藥品檢定研究院；

L(+)-阿拉伯糖(Ara，1506-200202)：中國藥品生物制品檢定所；

1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清：美國Gibco公司；

二甲基亞砜(DMSO)、脂多糖(LPS)、維生素C(VC)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 以及2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：美國Sigma公司；

腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)ELISA試劑盒：南京建成生物工程研究所；

乙醇、氯仿、正丁醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

臺式高速冷凍離心機：H1850型，廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；

冷凍干燥機：FDU-1200型，東京理化器械株式會社；

電子天平：ML203型，梅特勒—托利多(上海)儀器有限公司；

酶標儀：Tecan Infinite 200 PRO M Nano型，瑞士帝肯公司；

超聲波清洗器：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司；

二氧化碳培養(yǎng)箱：CLM-170B-8-NF型，新加坡ESCO公司；

奧林巴斯倒置顯微鏡：CKX53型，日本奧林巴斯公司；

傅立葉紅外光譜儀：FTIR-7600型，美國Lambad公司；

高效液相色譜儀(S-3250示差檢測器)：SYKAM S501 Series型，德國賽卡姆公司；

氣相色譜儀：GC-2010型，日本島津公司；

氣相色譜檢測器：FID型，日本島津公司；

色譜柱：WondaCap5型毛細管柱(0.25 mm×30.0 m×0.25 μm)，日本島津公司；

自動進樣器：AOC-20S型，日本島津公司；

自動注射器：AOC-20i型，日本島津公司；

壓片機：DF-4型，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蓮房粗多糖的提取 將陰干的蓮房粉碎(500.00 g)，用95%乙醇在80 ℃下熱回流提取6 h以去除脂類、色素、單糖和小分子化合物。殘渣在50 ℃的烘箱中干燥以獲得脫脂的蓮房粉。稱取100.00 g脫脂粉末，以蒸餾水為提取溶劑，料液比(m脫脂粉末∶V蒸餾水)為1∶30 (g/mL)，在90 ℃下的熱回流提取3次，每次提取3.5 h。提取液在轉速為4 000 r/min離心10 min、過濾，使用真空旋轉蒸發(fā)器濃縮至體積約為300 mL，加入4倍體積的無水乙醇混合，置于4 ℃冰箱過夜，12 000 r/min離心10 min，通過冷凍干燥(-50 ℃，20 Pa，24 h)獲得白蓮蓮房粗多糖。

1.2.2 蓮房多糖的純化 根據文獻[12]并修改，稱取白蓮蓮房粗多糖(1.00 g)加熱水10 mL溶解，然后加入Sevage試劑(V正丁醇∶V氯仿=1∶4)充分震蕩，在分液漏斗中靜置，此步驟重復3次去除蛋白質，合并上層液體，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮去除有機溶劑殘留。并加入粗多糖質量10%的活性炭，60 ℃、150 r/min 攪拌3 h，抽濾，濃縮(60 ℃，-0.1 MPa)。濃縮液裝入截留分子量為3 000 U的透析袋中用自來水透析48 h，蒸餾水透析48 h以去除小分子化合物，將透析后的多糖溶液經冷凍干燥得到純化蓮房多糖。

1.2.3 蓮房多糖質量分數測定 根據文獻[13]并修改，使用葡萄糖為標準品，配置成質量濃度為1 mg/mL母液，用蒸餾水稀釋成不同的標準濃度，加入苯酚硫酸反應后，吸取反應液200 μL至96孔板中，用酶標儀檢測吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(X)，吸光值為縱坐標(Y)繪制標準取線，回歸方程：Y=0.003 1X+0.018 2，R2=0.999 3。粗多糖與純化多糖含量經苯酚—硫酸法測得梯度葡萄糖的吸光值，代入標準曲線計算多糖含量，按式(1) 計算多糖的質量分數。

(1)

式中：

Y1——多糖的質量分數，%；

C——多糖配制液中多糖質量濃度，mg/mL；

V——配制液體積，mL。

m——蓮房質量，g。

1.2.4 多糖結構表征

(1) 紅外光譜分析：純化的多糖與KBr粉末混合后研磨，然后壓制成透明薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)在400～4 000 cm-1的范圍內進行掃描。

(2) 分子量測定：采用SYKAM S501 Series 高效液相色譜儀測定純化的蓮房多糖分子量大小。使用5種葡聚糖標準分子量(Mw)(分別為10 000，40 000，70 000，200 000，375 500 Da)進行液相色譜分析。將標準品配制成2 mg/mL的標準溶液，通過0.22 μm微孔膜，在以下條件下進行高效液相色譜分析，以色譜峰保留時間(TR)為橫坐標，葡萄糖標準品的平均分子量(lgMw)為縱坐標，繪制線性回歸方程。液相色譜條件：TSKG5000色譜柱；流動相0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)；流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，運行時間20 min。將白蓮蓮房多糖樣品配成10 mg/mL的白蓮蓮房多糖溶液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾后進行高效液相色譜分析。

(3) 單糖組分測定：對白蓮蓮房多糖的單糖組成進行分析，主要包括多糖的水解和乙酰化兩個步驟，根據文獻[14]并修改，精密稱取白蓮蓮房多糖(10.0 mg)放入密封管中，然后加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，在100 ℃下水解6 h以完全水解糖苷鍵。水解后，用甲醇共蒸餾去除多余的酸。水解物中加入0.5 mL吡啶使其溶解，加入10 mg鹽酸羥胺，在水浴90 ℃下孵育30 min后，添加0.5 mL醋酸酐并通過渦流震蕩徹底混合，繼續(xù)在水浴90 ℃下孵育30 min，反應完成后，取下密封管，放置在氮吹儀下將反應液吹至干，加入2 mL氯仿溶解乙?；苌铮^0.22 μm有機膜至進樣瓶中。單糖標準品(單標與混標)與內標按照多糖的乙?；襟E進行操作。色譜條件：載氣(氮氣)體積流量 30 mL/min；進樣溫度235 ℃；檢測器溫度260 ℃；分流比10∶1；柱色譜升溫程序：140 ℃保持3 min，以10 ℃/min 溫度至240 ℃，并保持15 min；運行時間28 min，進樣體積1 μL。

1.2.5 抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除活性測定：根據文獻[15]并修改。將3 mL的新鮮配置濃度為200 μmol/L的DPPH溶液作為自由基的母液分別加到不同濃度的樣品溶液中，樣品溶液質量濃度分別為0.025，0.050，0.100，0.200，0.400 mg/mL，所需樣品體積為1 mL。溶液快速搖動混合，并在25 ℃下反應25 min。吸取反應液200 μL至96孔板中，在517 nm處用酶標儀測定吸光度。將維生素C用作陽性對照。按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

S1——DPPH自由基清除率，%；

A1——對照品溶液(無樣品)的吸光度；

A2——樣品溶液的吸光度。

(2) 羥基自由基(OH自由基)清除活性測定：根據文獻[15]并修改。將1 mL不同質量濃度的多糖溶液(0.025，0.050，0.100，0.200，0.400 mg/mL)、1 mL硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)和1 mL水楊酸—乙醇溶液(6 mmol/L)混合。用1 mL的0.1%過氧化氫搖勻，在37 ℃下黑暗反應30 min。取反應液200 μL轉移至96孔板中，用酶標儀在510 nm下測定吸光度。以維生素C為陽性對照。根據式(3) 計算白蓮蓮房多糖及維生素C的OH自由基清除率。

(3)

式中：

S2——OH自由基清除率，%；

A0——蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照的吸光度；

A——樣品吸光度。

(3) Fe3+還原能力測定：根據文獻[16]并修改，將0.8 mL 樣品(0.025，0.050，0.100，0.200，0.400 mg/mL)與0.4 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6，0.2 mol/L)和0.4 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，并在50 ℃下反應20 min，然后再將0.4 mL 10%三氯乙酸溶液加入混合體系中。靜置10 min，加入1.6 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%氯化鐵溶液，室溫下靜置10 min后，于700 nm處測定樣品的吸光度。以維生素C為陽性對照。

1.2.6 免疫活性

(1) 細胞培養(yǎng)與模型建立：RAW 264.7細胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基每2～3 d更換一次。當融合率達80%時，進行傳代培養(yǎng)，傳代好的細胞分為以下3組，① 空白對照組：正常細胞，不加任何藥物；② 陽性對照組：培養(yǎng)基中加入1 μg/mL的LPS進行干預；③ 試驗組：加入不同質量濃度的WLRP進行預孵。

(2) 對RAW 264.7細胞活力的影響：細胞活性檢測采用MTT法[17]，取對數生長期細胞以1×106個細胞/孔接種于96孔板中。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，向細胞懸浮液中加入不同質量濃度(12.5，25.0，50.0，100.0，200.0 μg/mL)的白蓮蓮房多糖，繼續(xù)孵育24 h，吸取上清液，加入100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL MTT停止液。繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h后，在550 nm處用酶標儀測量吸光度，試驗重復3次。按式(4) 計算細胞存活率。

(4)

式中：

S3——相對細胞存活率，%；

A1——試驗組孔吸光值；

A2——空白組孔吸光值；

A3——對照組孔吸光值。

(3) 對細胞因子分泌量的影響：將RAW 264.7巨噬細胞(1×105個/mL)接種于48孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去舊培養(yǎng)基，向48孔板中加入不同質量濃度(0.0，12.5，25.0，50.0，100.0 μg/mL)的白蓮蓮房多糖和1 μg/mL LPS(陽性對照)，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，NO的分泌量采用Griess法[17]進行檢測，以亞硝酸鈉為標品，配置不同濃度的亞硝酸鈉溶液，加入Griess試劑反應測其吸光度，繪制標準曲線。TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量采用ELISA試劑盒測定。

1.2.7 數據分析 試驗數據處理和作圖軟件采用Excel 2013及Sigmaplot 10.0軟件，數據以平均值±標準差(SD)表示。單因素方差分析用于確定平均值之間的顯著性差異。95%的置信水平(P<0.05)被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 白蓮蓮房多糖的提取與純化

按照方法步驟1.2.1與1.2.2所得白蓮蓮房粗多糖和純化多糖的質量分別為9.45 g和0.56 g，經計算粗多糖與純化多糖的得率分別為9.45%和5.29%，粗多糖與純化多糖質量分數分別為32.34%和84.58%。

2.2 紅外光譜分析

圖1 白蓮蓮房多糖 的紅外光譜圖Figure 1 IR spectra of polysaccharide of white lotus receptacle

2.3 單糖組成及其分子量分析

對6種標準單糖和蓮房多糖樣品先后進行氣相色譜分析。由圖2(a)可知，6種單糖標準品在此色譜下分離完全。蓮房多糖單糖組成如圖2(b)所示，13.35 min處的單糖由于缺少相應單糖標品，暫未分析出來。蓮房多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6種單糖組成，其摩爾比為1.28∶2.10∶1.00∶2.20∶2.42∶4.76，其中半乳糖占比最大，為34.59%，葡萄糖和甘露糖次之。劉恩超等[22-23]研究發(fā)現蓮藕渣多糖主要由半乳糖和阿拉伯糖組成，其中半乳糖占比最高，為25.98%，鄧添華等[24]研究表明蓮子多糖中半乳糖的占比最高，與試驗結果一致，推測半乳糖是蓮多糖中占比最高的單糖。

1.鼠李糖 2.阿拉伯糖 3.木糖 4.甘露糖 5.葡萄糖 6.半乳糖 7.肌醇圖2 標準單糖與白蓮蓮房多糖的氣相色譜圖Figure 2 GC chromatogram of complex monosaccharide derivative

多糖的分子量具有相對性，代表相似鏈長的平均分布，通常用統(tǒng)計平均值來表示所測定的多糖分子量大小[25]。采用高效液相色譜法測定不同標準品分子重量。以標準品的保留時間(TR)為橫坐標，標準品的分子量平均值取對數(lgMw)為縱坐標，根據標準曲線lgMw=9.616 7-0.289 7TR(R2=0.996 7)測得白蓮蓮房多糖相對分子量為3.22×105kDa。此外，多糖(三螺旋)的有序結構對免疫調節(jié)活性至關重要。有研究[26]表明，只有多糖分子量>9×104Da，才能形成三重螺旋結構。

2.4 白蓮蓮房多糖的體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 如圖3所示，蓮房多糖對DPPH自由基的清除率與其質量濃度呈劑量依賴性增加。在質量濃度為0.025～0.200 mg/mL時對DPPH自由基的清除作用增強較快，后趨于平緩，在0.200，0.400 mg/mL 時，其清除率分別為(43.76±3.26)%和(43.57±3.75)%，但均低于同濃度維生素C的。

圖3 白蓮蓮房多糖對DPPH的清除能力的影響Figure 3 The effect of WLRP on DPPH radical scavenging ability (n=3)

2.4.2 OH自由基清除能力 如圖4所示，蓮房多糖對OH自由基的清除率隨其質量濃度的增加而增加，但是整體清除率比維生素C低。在給藥濃度范圍內，蓮房多糖對OH自由基的清除率在其質量濃度為0.400 mg/mL時達到最大，為(58.79±3.75)%。

圖4 白蓮蓮房多糖 對 OH 自由基清除能力Figure 4 The scavenging ability of WLRP to hydroxyl radicals (n=3)

2.4.3 Fe3+還原力 如圖5所示，蓮房多糖的Fe3+還原能力雖然隨著給藥濃度的增加而有所增強，但增加幅度偏小且整體弱于維生素C。在給藥濃度范圍內，蓮房多糖在質量濃度為0.4 mg/mL時Fe3+還原能力達到最大，為0.44。

圖5 蓮房多糖的還原能力Figure 5 Reducing power ability of polysaccharide (n=3)

白蓮蓮房多糖在還原力、清除DPPH自由基和OH自由基等方面均表現出一定的作用，但是整體作用要弱于維生素C，可能由于抗氧化作用機制不同所引起的，維生素C能通過逐級供給電子而實現清除活性氧自由基的作用，而白蓮蓮房多糖的抗氧化作用與分子上含有的醇羥基等活性基團有關[27]。

2.5 白蓮蓮房多糖的免疫活性

2.5.1 對細胞存活率的影響 如圖6所示，白蓮蓮房多糖質量濃度為200.0 μg/mL時，細胞存活率為(85.36±4.77)%(P<0.05)，與正常組相比，顯示對細胞有毒性，而多糖質量濃度為100.0，50.0，25.0，12.5 μg/mL時，細胞存活率分別為(96.77±4.52)%，(98.53±3.78)%，(106.46±5.23)%，(102.45±4.65)%，說明100 μg/mL以下的白蓮蓮房多糖對細胞是安全的，因此以0～100 μg/mL 白蓮蓮房多糖進行后續(xù)試驗。

*表示與正常組相比(P<0.05)圖6 白蓮蓮房多糖對RAW 264.7細胞存活率的影響Figure 6 Effect of WLRP on the viability of RAW 264.7 cells (n=3)

2.5.2 對RAW 264.7細胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β分泌的影響 研究觀察了白蓮蓮房多糖對NO、細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的影響。正常組中RAW 264.7細胞只釋放少量的NO [(3.12±0.12) μmol/L]、TNF-α[(5.52±0.11) ng/mL]、IL-6[(8.43±1.02) ng/mL]和IL-1β[(27.56±1.22) ng/mL]，如圖7所示，與正常組相比，白蓮蓮房多糖(25，50，100 μg/mL)處理能顯著促進NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，呈劑量依賴性。在白蓮蓮房多糖質量濃度為100 μg/mL時，NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量達到了最大值，與空白組相比，NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量分別增加了29.89 μmol/L、84.24 ng/mL、33.89 ng/mL和45.96 ng/mL。然而，用白蓮蓮房多糖(50，100 μg/mL)處理后NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌緩慢增加。說明白蓮蓮房多糖對巨噬細胞的激活是有限的，過度激活巨噬細胞將會導致炎癥。基于試驗中蓮房多糖與LPS對炎癥因子的釋放情況，白蓮蓮房多糖對巨噬細胞的作用遠小于LPS。

*表示與空白組相比(P<0.05) **表示與空白組相比(P<0.01)圖7 白蓮蓮房多糖對NO、細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的影響Figure 7 Effects of WLRP treatment on the secretion of NO,cytokine (TNF-α,IL-1β and IL-6) in RAW 264.7 cells (n=3)

3 結論

白蓮蓮房多糖是一種雜多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其中半乳糖質量分數最大，為34.59%；白蓮蓮房多糖相對分子量為3.22×105kDa；另外，紅外光譜分析表明白蓮蓮房多糖呈現出多糖類物質的典型特征吸收峰。蓮房多糖作為新發(fā)現的天然多糖之一，試驗表明，蓮房多糖具有較強的DPPH、羥基自由基清除活性和還原能力，可以作為一種潛在的天然抗氧化劑資源，此外，白蓮蓮房多糖可通過刺激巨噬細胞釋放NO和細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)來增強免疫調節(jié)活性而且對RAW 264.7細胞無毒性，可作為一種新型的功能性食品免疫調節(jié)劑。后續(xù)可對白蓮蓮房多糖的免疫調節(jié)活性的分子作用機制以及蛋白信號通路進行研究。