唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的研究進展

汪廷彩 雷 毅 周 露 曾曉琮

(廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435)

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)是1977年中國學者在東北酵米面中毒事件中發(fā)現(xiàn)的食物中毒菌[1]。該菌可產(chǎn)生毒黃素(Toxoflavin，TF)和米酵菌酸(Bongkrekic acid，BA)，能引起高致死性的食物中毒，研究[2]報道，發(fā)病率可高達96%，病死率可高達68%～89%，在個別中毒事件中死亡率甚至達100%，是迄今為止中國發(fā)現(xiàn)的發(fā)病率和死亡率極高的食源性致病菌。

隨著社會和經(jīng)濟發(fā)展，由該菌引起的食物中毒事件在中國已很少發(fā)生，但近年來，在中國部分保持傳統(tǒng)飲食習慣的地區(qū)又頻頻出現(xiàn)。2012年云南省紅河州發(fā)生過玉米面湯圓引起的聚集性的食物中毒事件，中毒9人，死亡5人[3]；2014年云南省文山州發(fā)生一起吊漿粑食物中毒事件，導(dǎo)致20人中毒，6人死亡[4]；2018年7月29日浙江金華發(fā)生因進食浸泡2 d的黑木耳食物中毒事件，3人中毒，1人死亡[5]；2018年10月廣東省河源市東源縣半江鎮(zhèn)一家庭食用因變質(zhì)河粉導(dǎo)致米酵菌酸中毒，4人中毒，2人死亡[6]；2018年11月廣東省東莞市發(fā)生米粉米酵菌酸中毒事件，5人急性肝衰竭，其中3例死亡[7]；2020年7月28日廣東省揭陽市惠來縣11人在一家腸粉店吃完粿條不久，先后出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等疑似食物中毒癥狀，其中1人不幸死亡，4人送醫(yī)治療[8]；2020年10月5日，黑龍江省雞西市雞東縣發(fā)生酸湯子食物中毒事件，9人中毒，最終9人死亡[9]。據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會[9]發(fā)布的消息，2010年至今，中國已發(fā)生此類中毒14起，84人中毒，37人死亡。由此可見，全面了解該菌的生物學特性及中毒機理對于預(yù)防食物中毒極其迫切與重要，然而近幾年相關(guān)綜合性的介紹較少見報道。因此，文章擬綜述該菌的命名歷程、生物學特性、污染食品中毒作用機理、消毒和去毒研究及預(yù)防中毒措施等相關(guān)內(nèi)容，以期全面了解唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)，為食品中毒事件應(yīng)急處置及食品安全監(jiān)管提供支持。

1 命名歷程

1960年印度尼西亞從發(fā)酵食物Tempe bongkrek中毒樣品中分離并命名一種食物中毒菌，叫椰毒假單胞菌。Bongkrek是印度尼西亞爪哇島中部的一種風味食品，采用米根霉(Rhizopusoryzae)作曲種發(fā)酵椰子制成，發(fā)酵過程曾出現(xiàn)產(chǎn)毒細菌污染引起食物中毒，稱為“Bongkrek 中毒”[10]。Vanveen等[11]于1934年首先從Bongkrek中毒樣品中分離出病原菌，稱之為“BongkrekBacerium”，并初步鑒定出該病原菌產(chǎn)生的兩種毒素：Toxoflavin和Bongkrekic acid，即毒黃素和米酵菌酸。該病原菌在20世紀60年代被命名為“Pseudomonascocovenenans”(椰毒假單胞菌)。據(jù)不完全統(tǒng)計[12]，1951—1960年印尼爪哇島地區(qū)發(fā)生椰毒假單胞菌污染發(fā)酵椰子食品導(dǎo)致的中毒死亡人數(shù)達1 000人。

中國由椰毒假單胞菌導(dǎo)致的食物中毒最先報道于酵米面食物中毒事件中。酵米面是中國東北地區(qū)農(nóng)村調(diào)劑膳食的一種食品，略帶酸味，又稱臭米面，利用酵米面，可做餃子、面條等食品[13]。酵米面的制作工藝流程包括先將粗糧(主要是玉米)加水浸泡1～30 d發(fā)酵、用水洗磨漿、再經(jīng)紗布過濾及沉淀、最后去水晾干成白色玉米面粉[13]。酵米面中毒事件在中華人民共和國成立前曾發(fā)生過，但缺乏相關(guān)資料。1953年黑龍江省首次報道了因食用酵米面食品而引起的食物中毒事件，1956年和1959年遼寧省和吉林省相繼報道酵米面食物中毒事件[14]。

1961年遼寧省衛(wèi)生防疫站金家香[15]對來自遼寧省建平縣食物中毒的樣品進行了病原菌研究，從中首次分離出一種“黃色菌”，且動物毒理試驗發(fā)現(xiàn)該“黃色菌”可導(dǎo)致試驗動物死亡，證明“黃色菌”是酵米面中毒致病的重要因素。據(jù)不完全資料統(tǒng)計[14]，中國東北三省1975年發(fā)生226起酵米面中毒事件，導(dǎo)致1 842人中毒，其中703人死亡，當時并未能明確中毒原因，為此中國酵米面中毒病因研究協(xié)作組專家開展了大量研究，并于1979年將發(fā)現(xiàn)新的食物中毒菌暫定名為酵米面黃桿菌(Flavobacteriumfarinofermentansnov sp.)[13]。劉秀梅等[16]于1984年報告了同樣由該產(chǎn)毒菌引起的變質(zhì)銀耳食物中毒事件，導(dǎo)致105人致病，8人死亡。

從20世紀70年代開始，中國學者對椰毒假單胞菌及酵米面黃桿菌進行了深入的研究，涉及生化鑒定[1]、檢測方法、米酵菌酸結(jié)構(gòu)的鑒定、菌體抗原結(jié)構(gòu)[17-18]、產(chǎn)毒機制[19]等方面。孟昭赫等[1]對酵米面黃桿菌、椰毒假單胞菌及其他相近菌種在形態(tài)特點、生理生化、血清學、分子雜交、培養(yǎng)特征、產(chǎn)毒試驗等方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)絕大部分的試驗結(jié)果一致，僅在側(cè)金盞花醇實驗室上不同，酵米面黃桿菌可分解側(cè)金盞花醇，椰毒假單胞菌不能分解?；谂c國際細菌學命名原則保持一致，又反映該菌在中國的生態(tài)分布特征的考慮，1987年酵米面黃桿菌被易名為椰毒假單胞菌酵米面亞種(Pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans)，簡稱椰酵假單胞菌[20]。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，該菌的系統(tǒng)學分類被重新定位。Monique等[21]通過開展椰毒假單胞菌rRNA研究，將該菌命名為椰毒伯克霍爾德菌(Burkholderiacocovenenans)，劃歸為伯克霍爾德菌屬，同年Zhao等[22]通過16S rRNA序列分析也建議劃歸為伯克霍爾德菌屬。Coenye等[23]通過DNA-DNA雜交和全細胞蛋白分析技術(shù)證明椰毒伯克霍爾德氏菌應(yīng)歸類于唐菖蒲伯克霍爾德菌(Burkholderiagaldioli)。唐菖蒲伯克霍爾德菌是伯克霍爾德菌屬中的一個種，研究[24]顯示唐菖蒲伯克霍爾德菌在自然界廣泛分布，在土壤、水體和多種動物等生態(tài)位生存，常與真菌和植物共生，種內(nèi)具有復(fù)雜多樣性，包含3個不同的致病型，分別是唐菖蒲伯克霍爾德菌唐菖蒲致病變種(B.gladiolipvgladioli，導(dǎo)致樹葉等腐爛的病原菌)、唐菖蒲伯克霍爾德菌洋蔥致病變種(B.gladiolipvalliicola，導(dǎo)致洋蔥腐爛的植物病原菌)、唐菖蒲伯克霍爾德菌蘑菇致病變種(B.gladiolipvagaricicola，導(dǎo)致蘑菇腐爛的病原菌)[25]。

邱茂鋒[26]對椰毒假單胞菌酵米面亞種及B.cocovenenans和B.galdioli進行了rDNA指紋圖對比研究，研究結(jié)果顯示比起B(yǎng).cocovenenans，椰酵假單胞菌的親緣關(guān)系更接近于B.galdioli。Jiao等[25]對椰毒假單胞菌酵米面亞種與B.galdioli進行了DNA-DNA雜交研究，結(jié)果顯示雜交相似度為81%～93%，16S rDNA序列分析椰毒假單胞菌酵米面亞種與B.cocovenenans和B.galdioli的相似度高達99.3%，并因此建議將該菌劃為唐菖蒲伯克霍爾德菌的第4個病原型，即唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病變種，又稱椰毒唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(B.gladiolipvcocovenenans)。

Nadine等[27]于2012年對印尼食物中毒事件中的B.galdioli分離株開展了全基因組測序分析研究，并將在德國菌種保藏中心保藏的分離自印尼有毒椰子發(fā)酵食品的B.cocovenenansDSM11318標準株更名為B.galdioli[28]。

目前，該菌在食品微生物學檢驗國家新標準——GB 4789.29—2020被命名為：唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種) [Burkholderiagaldioli(Pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans)]。該標準于2020年9月11日發(fā)布，2021年3月11日實施。

2 生物學特性

2.1 形態(tài)學

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)為革蘭氏陰性需氧無芽孢短桿菌，兩端鈍圓，多形態(tài)，大小為0.4 μm×1.0～2.5 μm，有動力，有鞭毛呈極生、亞極生及側(cè)生鞭毛[13]。使用電子顯微鏡，可觀察到細胞壁、板樣和管狀結(jié)構(gòu)。使用透射電鏡，可觀察到有異染顆粒、板層狀內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)顆粒等特殊結(jié)構(gòu)。其中板層狀內(nèi)膜系統(tǒng)僅見于如甲烷氧化菌、硝化細菌等少數(shù)菌屬，其功能與光合作用及氧化磷酸化過程相關(guān)，而該菌的板層狀內(nèi)膜結(jié)構(gòu)功能尚不清楚[29]。

2.2 培養(yǎng)特性

該菌適宜生長溫度為26～37 ℃[30]。該菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA平板、沙門氏菌—志賀氏菌瓊脂SS平板、卵黃瓊脂平板、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂mPDA平板、椰毒假單胞菌酵米面亞種分離平板(有稱銀耳卵黃氯霉素瓊脂)PCFA平板上的培養(yǎng)特征見表1。

表1 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)培養(yǎng)特征[31-32]?Table 1 Culture characteristics of Burkholderia galdioli (Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)

該菌在培養(yǎng)過程中可由于溫度、培養(yǎng)基、菌種保存時間等因素產(chǎn)生不同顏色的色素，不同色素的毒素毒性有所不同，一般可區(qū)分為毒性較強的淡黃色(檸檬色)、其次為黃綠色、毒性較弱的棕黃色[30]。

該菌代謝多樣性豐富，對碳源要求不高，在有任一可利用的有機化合物存在下即可生長繁殖，在適宜的溫度和濕度條件下，短時間內(nèi)可產(chǎn)生大量毒素，人類食用受污染的食品后極易出現(xiàn)食物中毒[33]。

該菌具有很強的耐藥性和頑強的生長能力，在同一培養(yǎng)過程中，不同濃度的抗菌素作用下，該菌的生長良好，而其他細菌及部分霉菌的生長均會受到抑制[34]。該菌在生長過程可形成生物膜，定植于基質(zhì)表面。在食品基質(zhì)表面形成生物膜將對有效防控和清除該菌的污染造成困難[35]。

2.3 生化性狀

根據(jù)GB/T 4789.29—2003，椰毒假單胞菌酵米面亞種生化性狀見表2。與GB/T 4789.29—2003相比較，GB 4789.29—2020在生化特征內(nèi)容方面刪除了37 ℃生長、5 ℃不生長、41 ℃不生長3個反應(yīng)，增加了兩個陰性反應(yīng)：蔗糖、苯丙氨酸脫羧酶。

表2 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)生化性狀Table 2 Biochemical characteristics of Burkholderia galdioli (Pseudomonas cocovenenans subsp.Farinofermentans)

2.4 檢測診斷方法

目前，對該菌污染食物引起中毒進行診斷和檢驗的標準主要有GB 14928—1994《食物中毒診斷標準與處理總則》、WS/T 12—1996《椰毒假單胞菌酵米面亞種食物中毒診斷標準及處理原則》、GB 4789.29—2020《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢驗》。

此外，有采用ELISA檢測技術(shù)[36]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[37]、MALDI-TOF-MS及recA序列分析法[38]、實時熒光PCR檢測技術(shù)[39]對該菌進行檢測研究。相較于檢驗耗時需10 d左右的國標微生物培養(yǎng)法，分子生物學方法可應(yīng)用于該菌的快速檢測，有助于快速進行中毒診斷。

3 污染食品中毒作用機理

3.1 產(chǎn)毒特點

該菌具有特殊的產(chǎn)毒代謝過程，引起細菌性食物中毒的外毒素大多為多肽或蛋白質(zhì)，而該菌產(chǎn)生的外毒素為米酵菌酸和毒黃素兩種脂肪酸類的小分子物質(zhì)，這是不同于其他細菌的明顯特點。在相同條件下，米酵菌酸產(chǎn)生量遠大于毒黃素，且米酵菌酸毒性比毒黃素強[40]，米酵菌酸是導(dǎo)致酵米面等食物中毒的主要原因[41]。

該菌引起的食物中毒具有地域性特點，主要發(fā)生在中國及東南亞地區(qū)，在西方國家地區(qū)未見報道。2015年1月非洲莫桑比克報道了一起由該菌引起的食物中毒事件，導(dǎo)致75人死亡，230人住院，病原菌來自非洲粟酒的原料玉米粉[42]。

該菌引起的食物中毒具有明顯的季節(jié)性，主要發(fā)生在夏秋季。一方面，夏秋季節(jié)溫度濕度條件適合微生物生長繁殖；另一方面，酵米面、吊漿粑制作過程需要長時間發(fā)酵或浸泡，若貯存不當，則容易受到該菌的污染，更容易腐敗變質(zhì)導(dǎo)致食物中毒。

該菌引起的食物中毒大部分與某些地方特色食品有關(guān)，在中國南方多以糯米、酵米面、米泡制成的吊漿粑、湯圓、河粉等食品為主，北方以酵米面制作的格格豆、酸湯子、臭碴子等為主，這些食品的制作往往需要經(jīng)過長時間發(fā)酵或浸泡，極易受到該菌的污染。劉秀梅[43]分析了1985—1994年該菌中毒食品三大種類：谷物制品(糯玉米湯圓粉、玉米淀粉、發(fā)酵玉米面、涼醋粉等)、薯類制品(山芋淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯粉條等)、變質(zhì)銀耳。陳榮橋等[44]在進口碎米中檢出該菌，提示進口碎米存在該菌污染的安全風險。

3.2 產(chǎn)毒影響因素

該菌的產(chǎn)毒能力受多方面因素影響。孟昭赫等[19]采用正交設(shè)計試驗，研究了在不同的pH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、菌株、培養(yǎng)基條件下該菌的產(chǎn)毒能力情況，發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)毒能力的影響程度由大到小依次為：菌株、培養(yǎng)基、溫度、pH值、培養(yǎng)時間，且最適產(chǎn)毒溫度為26～28 ℃，最適產(chǎn)毒pH為6.5～8.0。在GB/T 4789.29—2003及GB 4789.29—2020中產(chǎn)毒培養(yǎng)條件規(guī)定為(26±1) ℃，培養(yǎng)5 d。

陳衛(wèi)真等[45]及王夏等[46]的研究發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)毒能力與內(nèi)膜系統(tǒng)及菌體脂肪酸組成相關(guān)，內(nèi)膜系統(tǒng)影響氧化磷酸化作用。研究[46]發(fā)現(xiàn)，Co33菌株膜系統(tǒng)發(fā)達，脂肪顆粒較少，氧化作用強，對毒素分解較快，表現(xiàn)為弱產(chǎn)毒株。Co14菌株脂肪顆粒較多，膜系統(tǒng)不發(fā)達，氧化作用較弱，對毒素分解較弱，因此毒素聚集，產(chǎn)毒量高，表現(xiàn)為強產(chǎn)毒株。

Rafael等[47]研究表明油脂的種類和濃度對米酵菌酸的產(chǎn)生很重要，低于10%(質(zhì)量分數(shù))的椰子油沒有引起米酵菌酸的產(chǎn)生，即使B.cocovenenans菌生長到很高的濃度，40%和50%的椰子油可產(chǎn)生多達1.4 mg/g米酵菌酸，在3種飽和脂肪酸中，只有月桂酸(12∶0)、肉豆蔻酸(14∶0)、棕櫚酸(16∶0)刺激產(chǎn)生了米酵菌酸，當用4種碳18自由脂肪酸在不同飽和濃度下比較時，只有油酸(18∶1)刺激引起了大量的米酵菌酸產(chǎn)生(2.62 mg/g干重)。

王靜等[48]研究了葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、蔗糖對該菌產(chǎn)毒性能的影響，結(jié)果葡萄糖和甘油可大幅度提高產(chǎn)毒能力，且質(zhì)量分數(shù)3%的葡萄糖增強效果優(yōu)于質(zhì)量分數(shù)5%的，而可溶性淀粉、蔗糖對產(chǎn)毒性能影響不顯著，推測是蔗糖和淀粉不能被分解利用的原因。證明了生長基質(zhì)中適宜濃度的糖分對該菌產(chǎn)毒性能有重要影響。

Buklie等[49]研究了pH值和鹽濃度對該菌產(chǎn)毒性能的影響，結(jié)果在椰子培養(yǎng)基(CCM)中，當pH為6.9時，米酵菌酸的產(chǎn)量遠高于黃毒素，pH為5.5時，檢測不到黃毒素，米酵菌酸產(chǎn)量下降，pH為4.5時，檢測不出米酵菌酸和黃毒素。在同一pH 6.9條件下，當NaCl質(zhì)量分數(shù)為1%時，米酵菌酸、黃毒素產(chǎn)毒量均減少，當NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%時，檢測不到黃毒素。在NaCl質(zhì)量分數(shù)為2%條件下，當pH值為4.5或5.0時，均未檢測到米酵菌酸、黃毒素。證明了酸化培養(yǎng)基和增加鹽濃度可抑制該菌的產(chǎn)毒。

3.3 米酵菌酸特性與中毒作用機理

3.3.1 特性與檢測方法 米酵菌酸是一種帶有特殊分支結(jié)構(gòu)的高度不飽和三羧基脂肪酸，結(jié)構(gòu)式見圖1，分子式為C28H38O7，分子量為486 g/mol，易溶于氯仿、甲醇、乙醚、石油醚等有機溶劑及堿性水溶液中。強耐熱，120 ℃高溫處理1 h仍不被破壞[50]，冷凍也無法破壞。對氧化劑和日光不穩(wěn)定。無氣味，無味道[51]，食用過程中往往不易察覺食品是否受到米酵菌酸的污染。

圖1 米酵菌酸結(jié)構(gòu)式Figure 1 Bongkrekic acid structure

有學者[52]發(fā)現(xiàn)米酵菌酸能夠?qū)γ咕?、酵母及某些細菌產(chǎn)生強烈抑制作用，可作為一種抗菌素。Moebius等[53]認為米酵菌酸和鹽酸多西環(huán)素、紅霉素和許多抗生素一樣，都屬于聚酮，是由細菌、真菌、植物產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物，用于提高存活率。

現(xiàn)行米酵菌酸測定國家標準為GB 5009.189—2016《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》，該標準方法規(guī)定了銀耳及其制品、酵米面及其制品等食品中的米酵菌酸測定方法，方法檢出限為0.005 μg/g，定量限為0.015 μg/g。2019年8月國家衛(wèi)生健康委發(fā)布《關(guān)于印發(fā)2019年度食品安全國家標準立項計劃的通知(國衛(wèi)辦食品函〔2019〕671號)》，食品中米酵菌酸的測定標準修訂獲得立項，牽頭單位為廣東省食品檢驗所。

目前，僅有GB 7096—2014《食品安全國家標準 食用菌及其制品》規(guī)定銀耳及其銀耳制品中米酵菌酸的限量要求為≤0.25 mg/kg，對于其他食品中米酵菌酸的限量要求暫未查找到相關(guān)標準規(guī)范。

3.3.2 中毒癥狀 米酵菌酸在人體內(nèi)主要經(jīng)消化道黏膜吸收，隨血液分布到全身，作用于肝、腦、腎等臟器[54]，發(fā)病潛伏期一般為1～10 h[55-56]，少數(shù)達1～2 d，主要癥狀表現(xiàn)為上腹部不適、腹瀉、頭痛、惡心、嘔吐、全身無力，重癥癥狀表現(xiàn)為昏迷、中樞神經(jīng)麻痹，腦、肝、腎多器官功能衰竭，最終因呼吸衰竭而死亡[3-7,50]。根據(jù)美國《食品毒理學手冊》[44]，當米酵菌酸在人體血液中達200～300 μg/L 時，即可達到致死劑量。按體重60 kg的人血液總量約為4 200～4 800 mL計，人體致死劑量為1.0～1.5 mg[54]。人群中毒事件研究結(jié)果反映，經(jīng)口攝入含16 mg 米酵菌酸的食物中毒臨床表現(xiàn)較輕，經(jīng)口攝入含31 mg米酵菌酸的食物可致死亡[44]。根據(jù)過往中毒事件情況表明，米酵菌酸中毒至今尚無特效救治藥物。

3.3.3 生物合成與中毒作用機理 Nadine等[57]對唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒致病變種菌DSMZ 11318株開展了基因組研究，菌株是從東南亞發(fā)酵椰肉食品中分離得到。研究發(fā)現(xiàn)了米酵菌酸的生物合成基因簇bonLJKFGABCDHIM，該基因簇編碼I型聚酮合酶復(fù)合體，聚酮合酶復(fù)合體催化組裝米酵菌酸的主骨架和β-支鏈。彭子欣等[58]在中國酵米面食物中毒株Co14基因組中也發(fā)現(xiàn)了bon基因簇，而在非產(chǎn)毒株的基因組中并未發(fā)現(xiàn)。推測是在進化過程中外來的米酵菌酸生物合成基因?qū)е露玖Πl(fā)生分化，原非產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生致病性。

Mehruba等[51]對米酵菌酸中毒作用機理研究表明，米酵菌酸對線粒體有獨特的毒害作用機理，其抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體(ANT)而非其他的電子傳遞鏈。當腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體構(gòu)型受到米酵菌酸作用改變后，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放性受到抑制，線粒體內(nèi)膜上二磷酸腺苷與三磷酸腺苷(ATP)的交換受到阻礙，ATP生成量減少，依賴ATP的生理機制停止工作，導(dǎo)致細胞無法正常獲得能量而死亡。

另一方面，研究[59-60]表明米酵菌酸會影響ANT構(gòu)型及MPTP開放，可抑制細胞凋亡，在重要器官如大腦局部缺血時，具有一定保護機體的作用。米酵菌酸對抑制細胞凋亡和抗腫瘤的作用也受到關(guān)注。

3.4 毒黃素特性與中毒作用機理

3.4.1 特性與檢測方法 毒黃素的分子式為C7H7N5O2，結(jié)構(gòu)式見圖2，分子質(zhì)量是193.21 g/mol，是一種水溶性黃色素，不溶于乙醚、二甲苯石油醚等，可溶于甲醇、乙醇、氯仿等有機溶劑，易在通氣條件下產(chǎn)生[61]。純的毒黃素為亮黃色片狀結(jié)晶，172～173 ℃分解，紫外線吸收峰在256.7 nm和394.0 nm(ε分別為16 400，2 500)處[62]。除了該菌外，莢殼伯克霍爾德氏菌、水稻細菌性谷枯病菌等菌種也可產(chǎn)生毒黃素[63]。一方面，毒黃素可引起農(nóng)作物患枯萎病[64-65]，另一方面，毒黃素有抑菌、殺菌、抗病毒、抗腫瘤性等潛在作用，利用毒黃素開發(fā)抗菌劑和抗腫瘤劑受到關(guān)注[47,66]。

圖2 毒黃素結(jié)構(gòu)式Figure 2 Toxoflavin structure

目前，定性或定量檢測毒黃素的方法主要有薄層色譜法[67-69]、分光光度法[70-73]、高效液相色譜法[74-76]、高效液相色譜質(zhì)譜法[74-76]、生物傳感測定法等。

3.4.2 中毒癥狀 研究顯示毒黃素小鼠LD50靜脈注射為1.7 mg/kg，口服為8.4 mg/kg[74，77]。毒黃素對動物造成病理性損害的器官主要有血管平滑肌[78]、腎臟[79]、心臟[80]等，可引起胃腹部不適、肝腎損傷乃至中毒性休克等癥狀，損害人體呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)[81-82]。

3.4.3 生物合成與中毒作用機理 如圖3所示，產(chǎn)生毒黃素的基因可分為合成基因和轉(zhuǎn)運基因，合成基因包括toxA、toxB、toxC、toxD、toxE，轉(zhuǎn)運基因包括toxF、toxG、toxH、toxI[83]。合成基因和轉(zhuǎn)運基因的操縱子全部由TofI-TofR群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)(QS)控制，該系統(tǒng)在毒黃素合成過程中起著重要作用[66-67,84]。Kim等[85]在對水稻致病菌莢殼伯克霍爾德菌BGR1的研究中發(fā)現(xiàn)，TF生物合成基因簇toxABCDE的表達受到調(diào)控蛋白ToxR和TF的共同誘導(dǎo)而激活，tox基因簇的表達也可能受到另一個由群體效應(yīng)調(diào)控蛋白ToxJ的參與。Lee等[67]研究發(fā)現(xiàn)存在調(diào)節(jié)毒黃素產(chǎn)生的獨立突變體TofM，位于TofI和TofR之間。Suzuki等[86]在核黃素合成途徑研究中推斷出5個與毒黃素生物合成相關(guān)的酶促反應(yīng)，菌株將在操縱子發(fā)生突變或產(chǎn)生toxA-衍生物的情況下喪失產(chǎn)毒黃素的能力[64]。彭子欣等[58]對唐菖蒲伯克霍爾德菌椰毒致病型菌株Co14基因組中毒黃素的生物合成相關(guān)基因進行了預(yù)測和分析，通過同源序列比對，在Co14染色體1上發(fā)現(xiàn)了TF的生物合成相關(guān)基因簇toxRABCDE。

圖3 基因組成圖Figure 3 Gene composition map

目前毒黃素的中毒機理主要認為是作用于細胞的呼吸鏈系統(tǒng)。任維棟等[87-89]研究證明毒黃素對呼吸鏈電子傳遞體的旁路作用產(chǎn)生了高于正常代謝水平H2O2及對組織和血細胞自由基的影響等多種因素對人體造成中毒反應(yīng)。孫鳳祥等[90]研究證明毒黃素的毒性作用主要發(fā)生在心臟，阻礙了心肌正常利用乳糖供應(yīng)能量。此外，研究發(fā)現(xiàn)自由基損傷可能是毒黃素的重要機制之一[91]。毒黃素中毒作用機理的研究也將有助于椰毒假單胞菌食物中毒事件的診斷與治療。

4 消毒、去毒研究及預(yù)防中毒措施

近10余年來，唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)導(dǎo)致的食物中毒很少發(fā)生，對于該菌及毒素的消毒、去毒研究相對較少?？刹檎业降南嚓P(guān)研究主要有：王夏等[92-93]研究了次氯酸鹽類(次氯酸鈣、次氯酸鈉)、氧化劑類(高錳酸鉀、過氧乙酸、氫碘酸)及硫酸、乙酸、亞硫酸鈉對米酵菌酸去毒的影響，研究發(fā)現(xiàn)次氯酸鈣和過氧乙酸去毒效果較好，硫酸、次氯酸銅次之。還采用抑菌試驗檢測波長254 nm紫外線照射的去毒作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未照射的陽性對照紙片(含毒素1 μg)形成直徑30 mm的抑菌圈，照射60 min后不形成抑菌圈，證明短波照射具有去毒作用。

陳曉明等[94]采用薄層層析法和動物試驗研究了日曬法對鮮銀耳中米酵菌酸的去毒效果，結(jié)果日曬2 d可去毒95%～97%，干銀耳日曬2 d去毒57%～62%，日曬8 d后，去毒可達94%，推測由于日曬的作用，毒素分子結(jié)構(gòu)被破壞，米酵菌酸轉(zhuǎn)為了對線粒體親和力僅為1/2～1/4的異米酵菌酸，以致毒性不同程度地降低。俞世榮等[95]研究了短波紫外和薰香靈的去毒效果，證實短波紫外照射具有明顯的去毒作用，將采摘的銀耳放置于紫外燈下照射30 min并及時烘干，基本上可去毒。1%薰香靈可在一定程度上降低該菌的產(chǎn)毒能力[17]。

在預(yù)防中毒措施方面，2020年10月國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布慎吃長時間發(fā)酵的酵米面類食品的提示[9]：不制作、不食用酸湯子等發(fā)酵米面食品；不食用浸泡過夜的黑木耳；購買新鮮的、生產(chǎn)日期近的食材；購買食物時盡量選擇小包裝，不囤積食物；選擇低溫干燥、通風的環(huán)境儲存食物，避免陽光直射；發(fā)霉食品及時處理掉，絕不可沖洗或去除霉變部分后繼續(xù)食用。如發(fā)生疑似中毒，應(yīng)立即停止食用，盡快催吐，并及時送醫(yī)院救治。

5 結(jié)語

唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)是一種發(fā)病率和致死率極高的食源性致病菌，中毒無特效救治藥物，應(yīng)引起高度重視。目前該菌相關(guān)的國家檢驗標準及檢測技術(shù)不斷完善，預(yù)防控制措施不斷增強。然而，該菌導(dǎo)致的食物中毒也出現(xiàn)了一些新變化，在一些新類別的食品如碎米中也發(fā)現(xiàn)受到過該菌的污染，存在食品安全風險隱患。未來應(yīng)進一步開展該菌在如大米、淀粉制品等食品類別中的污染規(guī)律、生長規(guī)律、產(chǎn)毒機理、生產(chǎn)控制措施、快速準確的檢測鑒定技術(shù)等方面的研究，將對深入了解、預(yù)防、應(yīng)對該菌食物中毒，對保障人們舌尖上的安全提供重要幫助。